CN102861360A

CN102861360A - 一种促神经修复材料及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102861360A
Application number: CN201210397806XA
Authority: CN
Inventors: 解慧琪; 刘宏银; 罗静聪; 杨志明
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: CN102861360B

Abstract

本发明公开了一种促神经修复的材料，它包括小肠黏膜下层和神经生长因子，所述神经生长因子的含量为1~500pg/cm²。本发明还公开了促神经修复材料的制备方法和用途。本发明促神经修复的材料中，神经生长因子可以缓慢释放，释放速度为每天42.01±1.43~82.43±1.89pg/cm²，克服直接添加生长因子的缺陷，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。

Description

一种促神经修复材料及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种促神经修复的材料，属于生物材料领域。

背景技术

目前，理想的组织/器官修复是：形成构造的完整性，即外型的修复，并且能够修复组织/器官的功能，形成功能上的整合修复，包括血管重建，神经重建等。

小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种天然的细胞外基质类生物材料，通常由猪小肠制备。SIS主要含有胶原、氨基多糖、糖蛋白等成分，并且含有多种生长因子，对组织的修复重建及细胞的生长有重要作用，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等，可通过与细胞表面的多种受体作用后介导细胞信号转导，从而对上皮细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞等多种细胞具有促进生长、分化的作用。研究表明，SIS中的生长因子虽经消毒、冻干等处理，仍具有生物活性。同时，由于SIS具有无免疫原性、抗微生物活性，能促进组织再生等特性，已作为组织工程的支架材料广泛应用于尿道、膀胱、血管、肌腱、神经、骨等多种组织缺损修复。

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是一种小分子蛋白，是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF在组织/器官修复中，特别是神经重建中发挥重要作用，是不可或缺的重要调控因子。研究发现，SIS中NGF含量仅为4.92±2.06pg/cm²。

目前在材料中添加的生长因子的方法主要是直接添加，或通过缓释给药技术来完成。直接添加生长因子的方式因生长因子会在短时间内释放，释放速度和活性均难以控制，有效性差，存在安全隐患。缓释给药技术可以控制生长因子在体内的释放速度，但现有的缓释材料大多为高分子合成材料，价格昂贵，药物释放的稳定性也不尽如人意，还可能因代谢问题给机体带来副作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的促进神经修复的材料。

本发明促神经修复材料，它包括小肠黏膜下层和神经生长因子，所述神经生长因子的含量为1~500pg/cm²。

所述材料是由如下方法制备：

（1）取小肠黏膜下层和雪旺细胞，将雪旺细胞接种于小肠黏膜下层上，共培养，得复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层；

（2）将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层反复冻融，冻干，即得所述的材料。

其中，所述步骤（1）中雪旺细胞的接种密度5×10³个/cm²~2.5×10⁵个/cm²。优选地，所述雪旺细胞为采用双酶分步消化法处理大鼠双侧坐骨神经得到的原代细胞或者RSC96大鼠雪旺细胞，接种密度为2.5×10⁵个/cm²或者5×10³个/cm²。双酶分步消化法采用公知方法，如，宁仁德等，“雪旺细胞分步消化培养及其纯化实验研究”，解剖与临床2003年第8卷第4期公开的分步消化培养法。

其中，所述双酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型胶原酶。

其中，所述步骤（1）共培养的时间是3~15天。

其中，所述步骤（2）中反复冻融是将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中10分钟，37℃处理10分钟，重复操作3次。

其中，所述步骤（2）中反复冻融是将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中8~12分钟，室温放置15~25分钟，置于摇床上用0.2~0.5%SDS溶液洗3~7分钟，去离子水漂洗，重复操作3~5次；再用0.2~0.5%SDS溶液置于摇床上振荡洗15~25分钟，去离子水漂洗5~10分钟。

本发明促神经修复的材料的制备方法，包括如下步骤：

其中，所述步骤（1）中雪旺细胞的接种密度5×10³个/cm²~2.5×10⁵个/cm²。

优选地，所述雪旺细胞为采用双酶分步消化法处理大鼠双侧坐骨神经得到的原代细胞或者RSC96大鼠雪旺细胞，接种密度为2.5×10⁵个/cm²或者5×10³个/cm²。

其中，所述步骤（1）共培养的时间是3~15天。

其中，所述步骤（2）中反复冻融是将复合了原代雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中10分钟，37℃处理10分钟，重复操作3次。

本发明促神经修复材料还可用于制备治疗组织缺损的药物。

本发明促神经修复材料由复合了雪旺细胞的小肠粘膜下层制备而成，可以缓慢释放神经生长因子，释放速度为每天42.01±1.43~82.43±1.89pg/cm²，可有效延长神经生长因子药效，既不需要直接添加生长因子，也不需要采用高分子缓释材料，效果稳定，使用安全，制备方法简单，成本低廉，具有广阔的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1 倒置显微镜观察生长5天的雪旺细胞的形态结果图。

图2 S-100免疫荧光染色鉴定雪旺细胞的结果图。

图3 SIS电镜扫描结果图。其中，A：未冻干的SIS呈半透明状膜；B：冻干后的SIS成白色纸状；C：处理后SIS表面未见细胞残留(HE×200)；D：处理后的SIS(SEMx200）。

图4 复合了SCs的SIS的观察结果图。其中，A：组织切片观察SCs在SIS上生长情况（HE×100）；B：组织切片观察SCs在SIS上生长情况

（Massonx100）；C：扫描电镜观察SCs在SIS生长情况（×1200）。

图5 培养时间对本发明材料中NGF-β含量的影响。

图6 本发明材料NGF-β的释放曲线。

图7 倒置相差显微镜观察长至约80%融合状态的RSC96细胞形态图。

图8 S-100免疫荧光染色鉴定RSC96细胞结果图。

图9 复合了RSC96细胞的SIS上的观察结果图。A:HE染色观察RSC96细胞在SIS上的生长情况；B：扫描电镜观察RSC96细胞在SIS上的生长情况。

图10 复合了RSC96细胞的SIS经不同脱细胞处理后DAPI染色结果。A：对照组，未经处理；B：反复冻融组，将复合了RSC96细胞的SIS置于液氮中10分钟，室温放置20分钟解冻，置于摇床上去离子水洗6分钟，以上步骤重复5次，再用去离子水洗25分钟；C：反复冻融加SDS处理组，将复合了RSC96细胞的小肠黏膜下层置于液氮中处理10分钟，室温放置20分钟，置于摇床上用0.25%SDS去离子水溶液洗5分钟，去离子水漂洗1分钟，以上步骤重复五次；再用0.25%SDS去离子水溶液置摇床上振荡洗20分钟，去离子水洗5分钟。

图11复合了RSC96细胞的SIS经不同脱细胞处理后，酚-氯仿法提DNA琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

缩略语：

SIS：小肠粘膜下层；SCs：雪旺细胞；NGF：神经生长因子；NGF-β：神经生长因子-β，NGF的β亚单位；G418：氨基糖苷类抗生素；H-DMEM：高糖-Dulbecco改良的Eagle培养基；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

实施例1本发明促神经修复材料的制备和检测

一、雪旺细胞SCs的分离纯化培养及检测

1、雪旺细胞SCs的分离纯化培养

（1）取材：取20只5～7天的SD乳鼠，引颈处死后无菌条件下，取双侧坐骨神经，在解剖显微镜下用显微器械尽快剥除神经外膜组织。

（2）消化：分别用0.25%胰蛋白酶和0.2%II型胶原酶各消化10分钟，1200rpm的转速离心5min，差速贴壁一次20min后接种。

（3）纯化：24h后，更换成含有20μl/ml G418（200μg/mL）或者2×10^-6M~1×10^-5M阿糖胞苷的10%FBS的H-DMEM培养液培养。G418或阿糖胞苷作用两天后，换含10%FBS的H-DMEM培养液。待SCs生长达到一定的密度后（约第6天）把血清浓度降低到2.5％。

（4）传代：接种8～9天后，倒置显微镜下观察贴壁细胞70～80%融合时，弃培养液，PBS液清洗两次，后加入用0.25%胰蛋白酶与0.1%EDTA混合液和PBS以1：4的比例混合消化传代，镜下观察见成纤维细胞皱缩后，立刻用含10%FBS的H-DMEM终止消化，经差速贴壁一次20min后接种。

2、SCs纯度的检测

取纯化后的细胞，制成细胞爬片，用倒置显微镜观察，用S-100进行免疫荧光染色鉴定。

结果如图1和图2所示，图1为倒置显微镜×200观察培养5天的细胞，细胞双极突起细长，细胞核为圆形或卵圆形，细胞纯度高，呈明显的“端对端”“肩并肩”平行排列；图2为SCs S-100免疫荧光染色（荧光显微镜×200），SCs的胞质呈绿色，为S-100阳性，着色的SCs与活的SCs形态一致，成纤维细胞不着色，呈阴性反应，细胞核染色均为蓝色。根据图1~图2所示结果可知，纯化后的雪旺细胞纯度好，未掺入杂细胞。

二、SIS的制备和检测

1、SIS的制备

（1）清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。

（2）分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。

（3）脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷和甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4个小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次，每次滤干之前的液体再浸入到新的脱脂液中。

（4）脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25%的胰酶液里，4℃脱细胞处理过夜。用去离子水漂洗10次后用0.5%的SDS处理至少4个小时，清洗后冻干。

2、SIS的检测：染色、扫描电镜

通过HE染色和扫描电镜观察有无残留的细胞，结果如图3所示，光镜以及扫描电镜下观察到的处理后的SIS未见细胞残留。

三、本发明神经修复材料的制备及检测

1、本发明神经修复材料的制备

（1）将制备的无菌冻干SIS剪成约1cm×1cm，置于6孔板中，分别用无菌的PBS，含10%胎牛血清的H-DMEM，置于5％CO₂恒温培养箱中浸泡16小时。

（2）SIS与SCs的复合培养：体外分离培养和纯化乳鼠的SCs，取生长状态良好的第三代细胞，消化离心，制成细胞悬液，以2.5×10⁵个/cm²滴加于步骤（1）所得SIS表面，加入10%FBS的H-DMEM培养液，于5％CO₂37℃条件下培养，培养3~15d。隔日更换培养液。

（3）反复冻融：取步骤（2）所得SIS与SCs的复合培养物，液氮中放置10分钟后，置于37℃水浴锅中10分钟，反复作用3次，冻干，即得本发明神经修复材料。

2、检测

（1）取步骤（2）中复合了SCs的SIS，组织切片观察SCs在SIS上的生长情况。

结果如图4所示，图4A，4B均显示SCs在SIS上分裂增殖，呈三维生长，细胞形态多为长梭形，纺锤形或长三角形，突起显著，细胞呈端对端的相互连接或排列成束状或栅栏状，图4C显示细胞表面蛋白颗粒分泌良好。

实验结果说明雪旺细胞在SIS上生长良好。

（2）复合后NGF-β含量的检测：

SCs与SIS复合培养后，对照组中直接种密度为2.5×10⁵个/cm²的雪旺细胞，分别于第1、2、3、4、5、7天时，各吸取细胞上清液0.2mL，利用ELISA方法定量检测大鼠神经生长因子的分泌量。评价SIS对SCs分泌NGF-β是否有影响，即SIS与SCs的生物相容性。

结果见表1：

表1ELISA法检测细胞上清液中NGF-β的含量结果

如表1所示，实验组NGF-β的分泌量第1天时约248.53±23.42pg/mL，到第5天增至约510.13±31.68pg/mL，第7天维持在498.22±42.47pg/mL。对照组的分泌量第1天时约267.53±19.74pg/mL，到第5天增至约503.97±23.95pg/mL，第7天维持在493.18±42.33pg/mL。

所获数据采用SPSS16.0软件进行均数间t检验统计学处理（P＞0.05）,说明实验组SCs与SIS复合培养分泌NGF-β的量和对照组正常培养的SCs无显著性差异，并且分泌量随着时间的延长而逐渐增高并在第5-7天达到峰值。

实验结果说明，SIS与SCs复合后，对其分泌NGF-β无影响，二者相容性良好。

（3）ELISA方法定量检测本发明神经修复材料中大鼠神经生长因子（NGF-β）的含量

分别取复合生长3d、5d、7d、10d、13d、15d后经过反复冻融处理并冻干的材料复合物，以及单纯SIS（对照组），分别取各组材料剪碎置于1ml PBS液中浸湿，用液氮冷冻后在陶钵中碾磨，放入匀浆管中匀浆，3000rpm离心7min后，取上清液。

结果如图5所示，ELISA法检测空白组（单纯SIS），3d组，5d组，7d组，10d组，13d组，15d组的NGF-β含量分别为（4.92±2.06）、（64.12±10.84）、（192.30±21.34）、（282.00±27.54）、（414.29±20.87）、（404.43±19.21）和（390.17±26.72）pg/cm²。

与空白组比较，本发明各组均有统计学意义（P＜0.05），本发明10d组，13d组，15d组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。即材料上的NGF含量随细胞复合培养的时间延长而增加，到第10天达到最大值，以后时间延长并不增加NGF含量。

实验结果说明，本发明方法制备的神经修复材料中含有大量NGF-β，可用于体内神经修复，复合生长3-15天，含有的NGF-β的量即可达到体内修复的要求，共培养10天，NGF-β的量可达到最大值。

（4）ELISA法测定本发明神经修复材料中NGF-β的释放情况

取上述制备得到的本发明神经修复材料1cm²（平行样3组），无菌条件下37℃浸润于3ml PBS中，每24小时取出1ml材料浸提液，并补进1ml新鲜无菌PBS，连续取样20天。ELISA法测其材料浸提液中NGF-β含量。

结果如表2和图6所示：

表2 ELISA法检测材料浸提液中NGF-β的含量结果

时间（天）	NGF-β含量（pg/cm²）
		1	82.43±1.89
2	73.15±1.21
		3	79.22±2.03
4	78.22±2.63
		5	70.56±1.79
6	68.34±1.04
		7	65.21±2.1
8	65.28±2.32
		9	69.67±2.08
10	68.22±1.98
		11	61.2±3.18
12	61.24±2.17
		13	63.78±1.36
14	59.22±2.09
		15	61.29±2.35
16	53.21±1.09
		17	50.28±1.71
18	45.37±0.89
		19	42.68±0.86
20	42.01±1.43

由表2和图6可知，SIS复合材料可缓慢地持续释放NGF-β生长因子，每天释放量为42.01±1.43~82.43±1.89pg/cm²，释放时间长，证明本发明修复材料具有缓释的功效。

实验结果说明，本发明神经修复材料中NGF含量高，并且NGF可以缓慢释放。

实施例2本发明促神经修复材料的制备和检测

一、RSC96细胞的传代培养、冻存及检测

1、RSC96细胞的传代培养

（1）传代培养：RSC96细胞购自中科院细胞库。如图7，待RSC96细胞长至约80%融合时，吸净培养基，加入0.5ml含0.25%胰蛋白酶与0.1%EDTA的PBS溶液消化，晃动消化液，约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入5ml含10%FBS的H-DMEM培养基，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，分置于4个细胞培养瓶中，补充含10%FBS的H-DMEM培养基至约5ml，置于5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养。

（2）冻存保种：长至约80%融合状态的RSC96细胞消化，中止，吹打至单细胞状态，1300rpm，离心5分钟。弃上清液，加入1ml冻存液（H-DMEM:FBS：DMSO=8:1:1）重悬细胞，计数调整至细胞终浓度约10⁶/ml。以每管1～1.5ml分装至冻存管中，放入预冷的程序降温冻存盒中置于-70℃冰箱冷冻过夜，次日快速转移至纸质冻存盒中，放入-150℃冰箱中长久保存。

2、RSC96细胞的纯度鉴定

取传代培养数代处于对数生长期的RSC96细胞，制成细胞爬片，用抗S-100抗体进行免疫荧光染色鉴定RSC96细胞的纯度。

结果如图7和图8所示，图7为倒置显微镜×100观察传代培养3天的RSC96细胞，较原代培养的雪旺细胞，RSC96细胞双极突起稍短，细胞间有突起之间的连接，细胞核为圆形或卵圆形；图8为RSC96细胞S-100免疫荧光染色（荧光显微镜x200），细胞核染色为蓝色，所有细胞胞质都呈绿色，为S-100阳性，说明培养的RSC96细胞纯度好，未掺入杂细胞。

二、SIS的制备和检测

同实施例1。

三、本发明神经修复材料的制备及检测

1、本发明神经修复材料的制备

（1）将制备无菌冻干的1cm×1cm SIS于无菌操作下置于24孔板中，加入含10%FBS的H-DMEM在孵箱中浸泡过夜，次日于接种细胞前1小时吸干培养基，放回孵箱中待用。

（2）取传代培养数代处于对数生长期的RSC96细胞，消化离心，制成单细胞悬液，计数调整细胞密度为2×10⁵个/ml，每SIS膜表面滴加25μl，即5×10³个细胞/cm²，放回孵箱中培养，以使细胞尽可能贴在SIS上，2小时后加入含10%FBS的H-DMEM培养液，于5％CO₂37℃条件下培养，培养3~15d。前4天隔日更换培养液。4天后将SIS转移到新的培养板中继续培养至第7天，每日换液。

（3）冻融：A，对照组，未经处理；B，反复冻融组，将复合了RSC96细胞的SIS置于液氮中10分钟，室温放置20分钟解冻，置于摇床上去离子水洗6分钟，上述过程重复5次，再用去离子水洗25分钟；C，SDS溶液洗涤的反复冻融方法组：将复合了RSC96细胞的SIS置于液氮中10分钟，室温放置20分钟，置于摇床上用0.25%SDS去离子水溶液洗5分钟，去离子水洗1分钟，上述过程重复5次，再用0.25%SDS去离子水溶液置摇床上洗20分钟，去离子水洗5分钟。

2、检测

（1）取步骤（2）复合了SCs的SIS，HE染色和扫描电镜观察SCs在SIS上生长情况，结果如图9所示。图9A显示RSC96在SIS上分裂增殖状态好，呈三维生长，图9B显示细胞表面蛋白颗粒分泌良好。

实验结果说明雪旺细胞在SIS上生长良好。

（2）冻融后脱细胞效果检测：

①DAPI染色检测。

结果如图10所示，对照组可见大量细胞核阳性染色呈蓝色，反复冻融组细胞核量有所减少，SDS溶液洗涤的反复冻融方法组几乎未见细胞核阳性染色。

②酚-氯仿法提取DNA，琼脂糖凝胶电泳法检测DNA片段。

结果如图11所示，对照组(Ctrl)有大量DNA片段存在，反复冻融组(F/T)DNA片段明显减少，但仍然存在大片段DNA，SDS溶液洗涤的反复冻融方法组(F-T/SDS)未见DNA片段存在。

实验结果说明简单地反复冻融可以有效地去细胞化，制备的促神经修复材料免疫原性低，可以满足体内修复的对材料的免疫原性的要求，用SDS溶液洗涤的反复冻融方法脱细胞最为彻底，制备的促神经修复材料免疫原性极低，用于体内修复最为安全。

实验说明本发明促神经修复材料中，NGF含量高，NGF以缓释的方式释放，释放速度为42.01±1.43~82.43±1.89pg/cm²，免疫原性低，稳定性好，安全性高，且制备方法简单，具有良好的工业和医学应用前景。

Claims

1.一种促神经修复材料，其特征在于：它包括小肠黏膜下层和神经生长因子，所述神经生长因子的含量为1~500pg/cm²。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：它是由如下方法制备：

3.根据权利要求2所述的材料，其特征在于：所述步骤（1）中雪旺细胞的接种密度5×10³个/cm²~2.5×10⁵个/cm²；共培养的时间是3~15天。

4.根据权利要求3所述的材料，其特征在于：所述雪旺细胞为采用双酶分步消化法处理大鼠双侧坐骨神经得到的原代细胞或者RSC96大鼠雪旺细胞，接种密度为2.5×10⁵个/cm²或者5×10³个/cm²。

5.根据权利要求4所述的材料，其特征在于：所述双酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型胶原酶。

6.根据权利要求2所述的材料，其特征在于：所述步骤（2）中反复冻融是将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中10分钟，37℃处理10分钟，重复操作3次。

7.根据权利要求2所述的材料，其特征在于：所述步骤（2）中反复冻融是将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中8~12分钟，室温放置15~25分钟，置于摇床上用0.2~0.5%SDS溶液洗涤3~7分钟，去离子水漂洗，重复操作3~5次；再用0.2~0.5%SDS溶液置于摇床上振荡洗涤15~25分钟，去离子水漂洗5~10分钟。

8.一种制备权利要求1~7任意一项所述促神经修复材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中雪旺细胞的接种密度5×10³个/cm²~2.5×10⁵个/cm²；共培养的时间是3~15天。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述雪旺细胞为采用双酶分步消化法处理大鼠双侧坐骨神经得到的原代细胞或者RSC96大鼠雪旺细胞，接种密度为2.5×10⁵个/cm²或者5×10³个/cm²。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述双酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型胶原酶。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中反复冻融是将复合了原代雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中10分钟，37℃处理10分钟，重复操作3次。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中反复冻融是将复合了雪旺细胞的小肠黏膜下层置于液氮中8~12分钟，室温放置15~25分钟，置于摇床上用0.2~0.5%SDS溶液洗3~7分钟，去离子水漂洗，重复操作3~5次；再用0.2~0.5%SDS溶液置于摇床上振荡洗15~25分钟，去离子水漂洗5~10分钟。

14.权利要求1~7任意一项所述促神经修复材料在制备治疗组织缺损的药物中的用途。