CN103599567B - 一种温敏性复合材料及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种温敏复合材料基质组合物，它包括如下重量配比的成分：氯化壳聚糖80～200份、β-甘油磷酸二钠200～260份、羟乙基纤维素37.5～87.5份、小肠粘膜下层微粉125～375份。本发明还公开了一种温敏复合材料及其制备方法和用途。本发明温敏复合材料具有良好的温敏特性，具有内在生物活性，可持续释放多种生长因子，具有良好的生物相容性，临床应用前景良好。

Description

一种温敏性复合材料及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种温敏复合材料及其制备方法和用途。

背景技术

水凝胶（Hydrogel）是以水为分散介质的凝胶，具有接近正常组织的含水量及良好的生物相容性，理化性质可控，具有多孔结构，其立体多孔结构跟细胞外基质很相似，有利于细胞生长增殖分化，也有利于生物活性因子活性的保持，可微创植入，在组织工程中具有广泛应用前景。

温敏性水凝胶可在体温范围内从液态转变为凝胶态，不需其他催化剂及剧烈的反应条件，能修复各种不规则形状的的组织缺损，能将细胞或者活性物质均匀的分布在缺损部位，促进细胞生长、胞外基质的分泌和组织的自我修复，在组织工程应用中具有突出的优势。水凝胶可由合成材料（如有PCL、PEG、PVA和PNIPAAm等）及天然材料（如壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸和脱细胞胞外基质等）制备。

壳聚糖是由葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺通过β-(1,4)糖苷键连接的线性半晶体多聚糖，由几丁质通过去乙酰化取得，壳聚糖的侧链氨基使壳聚糖带正电荷，使之能自动与其他带负电荷的物质发生电荷中和，疏水性增加自发形成凝胶。壳聚糖凝胶因其无毒，良好的细胞相容性，生物活性及生物可降解特性，在生物医学及组织工程领域有广泛的应用。然而，单纯的壳聚糖凝胶不含生物活性因子，如生长因子，不能有效促进新血管的生成和胞外基质的分泌，使其应用受到了限制。有研究人员将生物活性因子如b-FGF、重组人表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF)等复合于壳聚糖凝胶上，提高其生物活性，但复合过程不可避免地会影响生长因子的活性，常不能维持生长因子持续释放，且复合生长因子的种类有限，其促进组织再生和修复的效果往往不尽如人意。

猪小肠粘膜下层（small intestinal submucosa,SIS），是由猪小肠经过物理、化学或酶消化等方法去除其细胞成分而保留其结构及主要成分的天然材料，主要成分是胶原蛋白、弹性蛋白，富含多种生物活性因子，包括多种生长因子（如VEGF、TGF-β、TNF-α和bFGF）。SIS作为组织工程支架材料有利于细胞的粘附、增殖和迁移，能促进修复部位的血管以及新生组织的生成。SIS促进组织再生和修复的机制与其内在的多种生物活性因子密切相关，亦与其超微结构相关。但SIS为薄膜状，不能很好地填充修复形状不规则的缺损组织，虽然将SIS冻干后球磨成粉状，能修复不规则缺损，却易被体液冲刷迁移，降解速率较快，影响其修复效果。也有研究人员将SIS制成水凝胶以修复不规则缺损，但是其制备过程需经过酸溶、酶降解等处理步骤，SIS的超微结构被破坏，同时不可避免地导致SIS内在生物活性因子的减少。

发明内容

为了解决单纯壳聚糖凝胶无生物活性因子以及小肠粘膜下层微粉植入体内后易于流失及降解过快的问题，本发明提供了一种新的温敏复合材料基质组合物，以及其制备方法和用途。

本发明温敏复合材料基质组合物，它包括如下重量配比的成分：

氯化壳聚糖 80～200份

β-甘油磷酸二钠 200～260份

羟乙基纤维素 37.5～87.5份

小肠粘膜下层微粉 125～375份。

优选地，温敏复合材料基质组合物包括如下重量配比的成分：

氯化壳聚糖        160份

β-甘油磷酸二钠   230份

羟乙基纤维素      62.5份

小肠粘膜下层微粉  375份。

本发明种温敏复合材料，它包括前述的基质组合物和水，其中，小肠粘膜下层微粉的浓度为5～30mg/ml。

本发明制备前述温敏复合材料的方法，包括如下步骤：

（1）按照权利要求1或2的配比，取原料；

（2）分别将氯化壳聚糖、β-甘油磷酸二钠和羟乙基纤维素溶于水性溶剂，得浓度为10～25mg/ml的氯化壳聚糖溶液，得浓度为100～130mg/ml的β-甘油磷酸二钠溶液，得浓度为15～35mg/ml的羟乙基纤维素溶液，将三种溶液按8:2:2.5混合，；

（3）在步骤（2）的混合溶液中加入小肠粘膜下层微粉至浓度为5～30mg/ml，混匀，即得本发明温敏复合材料。在pH6.5～7.5，温度35～38℃的条件下放置2～8min，可形成凝胶。

步骤（2）中，所述氯化壳聚糖溶液的浓度为20mg/ml，所述β-甘油磷酸二钠溶液的浓度为115mg/ml，所述羟乙基纤维素溶液的浓度为25mg/ml。

步骤（3）中，小肠粘膜下层微粉的浓度为30mg/ml。

步骤（3）中，所述pH为7.2，所述温度为37℃。

本发明还提供了前述温敏复合材料在制备缺损修复材料中的用途。

采用本发明特定配比的基质，可以制备得到温敏复合材料，同时很好地保留了小肠粘膜下层微粉的超微结构及其内在的生物活性因子，能够很好地填充体内不规则缺损，持续释放多种生长因子，具有良好的生物相容性，免疫原性低，延长SISP的体内降解，具有适宜的生物可降解性，用于组织修复的效果良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1VEGF标准曲线

图2bFGF标准曲线

图3SISP/CSCl-GP-HEC凝胶和CSCl-GP-HEC凝胶成胶，A：CSCl-GP-HEC凝胶成胶前；B：CSCl-GP-HEC凝胶成胶后；C：SISP/CSCl-GP-HEC凝胶成胶前；D：SISP/CSCl-GP-HEC凝胶成胶后

图4A:SISP/CSCl-GP-HEC凝胶（200×）；B：CSCl-GP-HEC凝胶（200×）；C：SISP（1000×）；D：A:SISP/CSCl-GP-HEC凝胶（1000×）；E：SISP/CSCl-GP-HEC凝胶（10000×）

图5SISP/CSCl-GP-HEC凝胶、CSCl-GP-HEC凝胶和SISP的FT-IR图谱

图6流变学检测结果，储能模量(G’)和损耗模量(G”)之间的交点即为凝胶的相变温度

图7流变学检测结果，在37℃下的流变学检测,储能模量(G’)和损耗模量(G”)之间的交点即为凝胶的相变时间

图8SISP/CSCl-GP-HEC凝胶中VEGF(A)和bFGF(B)体外释放，将1ml SISP/CSCl-GP-HEC凝胶分别浸泡于1ml PBS和0.2%I型胶原蛋白酶-PBS溶液，在第1,3,5,10,15,20,25,30day搜集样品，ELISA检测生长因子含量。

图9SISP/CSCl-GP-HEC水凝胶体外降解失重曲线

图10活死细胞荧光染色。观察NIH3T3成纤维细胞在材料表面生长情况，在第1天用荧光显微镜观察并拍照，其中a、b为SISP/CSCl-GP-HEC；c、d为CSCl-GP-HEC；e、f为SISP，a、c、e放大倍数100X，c、d、f放大倍数200X。

图11活死细胞荧光染色。观察NIH3T3成纤维细胞在材料表面生长情况，在第4天用荧光显微镜观察并拍照，其中a、b为SISP/CSCl-GP-HEC；c、d为CSCl-GP-HEC；e、f为SISP，a、c、e放大倍数100X，c、d、f放大倍数200X。

图12活死细胞荧光染色。观察NIH3T3成纤维细胞在材料表面生长情况，在第7天用荧光显微镜观察并拍照，其中a、b为SISP/CSCl-GP-HEC；c、d为CSCl-GP-HEC；e、f为SISP，a、c、e放大倍数100X，c、d、f放大倍数200X。

图13材料植入体内1小时后取材大体观察。红色区域内为CSCl-GP-HEC凝胶；蓝色区域内为SISP/CSCl-GP-HEC凝胶

图14材料体内植入（a）和取材（b,c,d）大体观察b：1周取材；c：2周取材；d：4周取材

图15材料皮下植入1周H&E染色。a和b为SISP/CSCl-GP-HEC组，c和d为CSCl-GP-HEC组，e和f为SISP组。a、c、e放大倍数为100×，b、d、f放大倍数为400×。

图16材料皮下植入2周H&E染色。a和b为SISP/CSCl-GP-HEC组，c和d为CSCl-GP-HEC组，e和f为SISP组。a、c、e放大倍数为100X，b、d、f放大倍数为400X。

图17材料皮下植入4周H&E染色。a和b为SISP/CSCl-GP-HEC组，c和d为CSCl-GP-HEC组，e和f为SISP组。a、c、e放大倍数为100X，b、d、f放大倍数为400X。

图18皮下植入炎性细胞总数

图19皮下植入纤维囊厚度

图20SISP/CSCl-GP-HEC凝胶皮下植入B超图。a为1个月；b为2个月

图21CSCl-GP-HEC凝胶皮下植入B超图a为1个月；b为2个月；c为3个月

图22SISP皮下植入B超图a为1个月；b为1.5个月

图23SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC凝胶和SISP在大鼠体内形状

具体实施方式

主要试剂与仪器

1、试剂

氯化壳聚糖（浙江金壳生物化学有限公司，中国）；

β-磷酸甘油二钠(sigma公司，美国)；

羟乙基纤维素(sigma公司，美国)；

DMEM培养基（GIBCO公司，美国）；

胎牛血清（Thermo公司，美国）

Ⅰ型胶原酶（GIBCO公司，美国）

Elisa试剂盒（CUSABIO公司，中国）

2、仪器

扫描电镜（日立S-520,日本）

石蜡组织切片机（德国Leica公司）

微型台式离心机（SANYO公司,日本）；

水平离心机(北京医用离心机厂)；

尼康显微镜（日本）

CO2细胞培养箱（SANYO公司，日本）

超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，中国）

倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；

荧光显微镜（Olympus公司，日本）；

冷冻干燥机（CHRIST公司，德国）；

红外光谱仪（热电公司，美国）；

流变仪（Thermo公司，美国）；

B超机（Philips公司，荷兰）。

3.实验动物

实验动物：健康SD大鼠25只，（2月龄）体重250～300g，雄性，由持国家一级动物生产许可证的四川大学华西医学中心动物实验中心提供；上述动物由持国家一级动物饲养许可证的四川大学华西医学实验动物中心饲养。

实施例1 本发明温敏复合材料制备方法

1、SIS粉末的制备

取屠宰4h内新鲜的猪小肠清水冲洗干净后，截成10cm的小段，用钝性器械刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，然后用生理盐水反复清洗剩余的粘膜下层直至水不浑浊，接着用甲醇：氯仿（1：1，V/V）混合液脱脂12h,去离子水冲洗至无特殊气味，再用0.05%胰蛋白酶浸泡处理4℃过夜，生理盐水冲洗干净，之后0.5%SDS生理盐水溶液震荡浸泡4h，去离子水冲洗干净，最后0.1%过氧乙酸和20%乙醇混合溶液处理30分钟后，生理盐水冲洗干净。得到的猪小肠粘膜下层脱细胞基质（SIS）冻干后密封保存。将冻干的SIS用低温球磨仪器研磨为粉末，经80目筛子去除大颗粒后，即为SISP，分装并经环氧乙烷消毒灭菌备用。

2、温敏复合材料的制备

称取0.2g氯化壳聚糖，溶于10ml超纯水中，搅拌溶解后，即成2%（浓度为20mg/ml）CSCl水溶液，高压蒸汽灭菌。称取1.15gβ-DGP，溶于10mlH-DMEM培养液，溶解后即成11.5%（浓度为115mg/ml）β-DGP溶液。称取0.25gHEC，溶于10ml H-DMEM培养基中，即成2.5%（浓度为25mg/ml）的HEC溶液。β-DGP溶液和HEC溶液均用0.22μm滤膜过滤除菌。将上述三种溶液4℃冰箱保存备用，在临用前按照CSCl:β-DGP:HEC=8:2:2.5的比例在冰浴下混合成液态（pH=7.2），得混合物CSCl-GP-HEC，其中，每1ml混合物中含有12.8mgCSCl、18.4mgβ-DGP、5mg HEC，之后加入SISP至浓度为30mg/ml，即得本发明的温敏复合材料，该材料置于37℃恒温孵箱中形成在2-5分钟形成凝胶。检测理化性质时分别用超纯水溶解各组分，动物实验时分别溶于PBS中。

实施例2 本发明温敏复合材料的制备方法

1、SIS粉末的制备

取屠宰4h内新鲜的猪小肠清水冲洗干净后，截成10cm的小段，用钝性器械刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，然后用生理盐水反复清洗剩余的粘膜下层直至水不浑浊，接着用甲醇：氯仿（1：1，V/V）混合液脱脂12h,去离子水冲洗至无特殊气味，再用0.05%胰蛋白酶浸泡处理4℃过夜，生理盐水冲洗干净，之后0.5%SDS生理盐水溶液震荡浸泡4h，去离子水冲洗干净，最后0.1%过氧乙酸和20%乙醇混合溶液处理30分钟后，生理盐水冲洗干净。得到的猪小肠粘膜下层脱细胞基质（SIS）冻干后密封保存。将冻干的SIS用低温球磨仪器研磨为粉末，经80目筛子去除大颗粒后，即为SISP，分装并经环氧乙烷消毒灭菌备用。

2、温敏复合材料的制备

称取0.1g氯化壳聚糖，溶于10ml超纯水中，搅拌溶解后，即成1%（浓度为10mg/ml）CSCl水溶液，高压蒸汽灭菌。称取1gβ-DGP，溶于10mlH-DMEM培养液，溶解后即成10%（浓度为100mg/ml）β-DGP溶液。称取0.15HEC，溶于10ml H-DMEM培养基中，即成1.5%（浓度为15mg/ml）的HEC溶液。β-DGP溶液和HEC溶液均用0.22μm滤膜过滤除菌。将上述三种溶液4℃冰箱保存备用，在临用前按照CSCl:β-DGP:HEC=8:2:2.5的比例在冰浴下混合成液态（pH=7.5），混合后，每1ml混合物中含有6.4mgCSCl、16mgβ-DGP、3mg HEC，之后加入SISP至浓度为20mg/ml，即得温敏复合材料，该材料置于35℃恒温孵箱中形成凝胶。检测理化性质时分别用超纯水溶解各组分，动物实验时分别溶于PBS中。

实施例3 本发明复合温敏材料的制备方法

1、SIS粉末的制备

取屠宰4h内新鲜的猪小肠清水冲洗干净后，截成10cm的小段，用钝性器械刮除空肠的浆膜层、粘膜层及肌层，然后用生理盐水反复清洗剩余的粘膜下层直至水不浑浊，接着用甲醇：氯仿（1：1，V/V）混合液脱脂12h,去离子水冲洗至无特殊气味，再用0.05%胰蛋白酶浸泡处理4℃过夜，生理盐水冲洗干净，之后0.5%SDS生理盐水溶液震荡浸泡4h，去离子水冲洗干净，最后0.1%过氧乙酸和20%乙醇混合溶液处理30分钟后，生理盐水冲洗干净。得到的猪小肠粘膜下层脱细胞基质（SIS）冻干后密封保存。将冻干的SIS用低温球磨仪器研磨为粉末，经80目筛子去除大颗粒后，即为SISP，分装并经环氧乙烷消毒灭菌备用。

2、温敏复合材料的制备

称取0.25g氯化壳聚糖，溶于10ml超纯水中，搅拌溶解后，即成2.5%（浓度为25mg/ml）CSCl水溶液，高压蒸汽灭菌。称取1.3gβ-DGP，溶于10mlH-DMEM培养液，溶解后即成13%（浓度为130mg/ml）β-DGP溶液。称取0.35gHEC，溶于10ml H-DMEM培养基中，即成3.5%（浓度为35mg/ml）的HEC溶液。β-DGP溶液和HEC溶液均用0.22μm滤膜过滤除菌。将上述三种溶液4℃冰箱保存备用，在临用前按照CSCl:β-DGP:HEC=8:2:2.5的比例在冰浴下混合成液态（pH=6.5），混合后，每1ml混合物中含有16mgCSCl、20.8mgβ-DGP、7mg HEC，之后加入SISP至浓度为5mg/ml，混合均匀即得本发明的温敏复合材料，该材料置于38℃恒温孵箱中形成凝胶。检测理化性质时分别用超纯水溶解各组分，动物实验时分别溶于PBS中。

实施例4 本发明温敏性水凝胶的配比筛选

一、小肠粘膜下层粉含量的筛选

（1）材料制备

按照实施例1的方法制备本发明温敏性水凝胶，其中，SISP的浓度分别5、10、20和30mg/ml、40mg/ml。

CSCl-GP-HE凝胶：按照实施例1的方法制备混合物CSCl-GP-HEC，混合均匀后置于37℃恒温孵箱中形成凝胶。

（2）材料相变时间检测

SISP/CSCl-β-DGP-HEC、CSCl-β-DGP-HEC在溶液状态下滴于40mm的平钢板中心位置，检测距离为1mm，分别测量相变时间。在1Hz频率和1%张力条件下，温度为恒定的37℃，检测相变时间，储能模量（G’）和耗能模量（G”）的交点为相变时间。

2、检测结果

1、材料相变时间检测结果如下表1所示：

表1 材料相变时间检测检测

如上表所示，当小肠粘膜下层微粉含量高于30mg/ml，复合材料高度粘稠，不具有温敏材料低温下的可注射特性。

小肠粘膜下层微粉的含量在本发明范围内，即为5-30mg/ml时，均可制备得到本发明温敏性水凝胶，其中，小肠粘膜下层为30mg/ml时，制备得到的水凝胶最优，既包含了较多的活性成分，又具有温敏特性。

实验结果说明，各基质的配比在本发明范围内时，可以制备得到温敏复合材料，在本发明范围外，则难以制备得到具有温敏特性的复合材料。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1 本发明温敏性水凝胶的性质检测

本实验例中，SISP、SISP/CSCl-GP-HEC凝胶按照实施例1制备，CSCl-GP-HEC按照实施例4制备。

1、实验方法

1.1 理化性质检测

1.1.1 扫描电镜观察(SEM)

SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC、SISP在-40℃下冷冻2h，再放入冻干机中冻干。将冻干的SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC和SISP喷金用扫描电镜观察凝胶的形态结构。

1.1.2 傅里叶变换红外光谱分析（FT-IR）

冻干的SISP/CSCl-GP-HEC凝胶和CSCl-GP-HEC凝胶制成粉末，与SISP分别与KBr混合制成小球，用红外光谱分析仪(Nicolet,USA)在波长4000–400cm-1范围内检测其透射峰并进行分析。

1.1.3 流变学检测

（1）温敏材料凝胶化温度比较:采用流变仪对SISP/CSCl-β-DGP-HEC、CSCl-β-DGP-HEC温敏材料样品进行流变学中的温度扫描测定。用40mm平板几何测头于10～50℃范围内缓慢上升温度，升温速率为1℃/min，得到储能模量（G′）和耗能模量（G″）变化曲线，当G′和G″均符合力学定律（G′∝ωn，G″∝ωn），且n值相同时，该温度为凝胶化温度。在pH6.5条件下，分别测定SISP/CSCl-β-DGP-HEC、CSCl-β-DGP-HEC温敏溶液的凝胶化温度，每种材料样品均进行3次实验，取平均值。

（2）温敏材料相变时间检测：SISP/CSCl-β-DGP-HEC、CSCl-β-DGP-HEC在溶液状态下滴于40mm的平钢板中心位置，检测距离为1mm，分别测量相变时间。在1Hz频率和1%张力条件下，温度为恒定的37℃，检测相变时间，储能模量（G’）和耗能模量（G”）的交点为相变时间。

1.1.4 生长因子体外释放

1.1.4.1 样本收集

SISP/CSCl-GP-HEC凝胶组和CSCl-GP-HEC凝胶组按上述方法配好凝胶，分别加入5ml EP管中，每管1ml凝胶，SISP组每管30mgSISP。三组材料均进行I型胶原酶酶解和PBS水解，在第1,3,5,10,15,20,25天进行取样，取样时先离心再取上清液，低温冷冻备用。

1.1.4.2 生长因子含量检测：

按ELISA试剂盒说明操作，主要步骤如下：在孔板中加入标准浓度的VEGF（ng/ml），bFGF（pg/ml）的标准品和样本体积各50μl，然后在样本中加入生物素各10μl，在标准品及样本中加入酶标记液各50μl；混匀后37℃孵育1h，洗板5次，每次5分钟，再在各孔板中加入A，B底物各50μl，混匀后37℃避光孵育15min，最后加入终止液各50μl。见下表2：

1.1.4.3 VEGF，bFGF标准曲线：

将OD值与相应生长因子浓度作图1～图2。

1.1.5 体外降解

按前述方法制备SISP/CSCl-GP-HEC、和CSCl-GP-HEC凝胶，分别加入5ml EP管中，每管1ml，SISP粉末组每管30mgSISP。三组材料均进行酶解和水解，分别加入1ml0.2%I型胶原酶溶液和1ml PBS溶液，在37℃恒温摇床上以80r/min震荡降解。在第1，3，5，10，15，20，25天进行取样。取样时先离心取上清液用于生长因子检测备用，冻干后称重，最后按如下公式进行计算：

1.1.6 体外细胞实验

SISP/CSCl-GP-HEC凝胶为实验组，CSCl-GP-HEC凝胶和SISP为对照。凝胶按比例配好，以0.5ml/孔把凝胶铺板在六孔板中，放入37℃恒温孵箱中，待凝胶形成。将消化的NIH-3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）以每1ml凝胶2×105个细胞进行表面接种。在第1,4,7天死活细胞染色观察细胞在材料上的生长情况，首先弃去培养液，PBS清洗两遍，加入染色液（每毫升PBS含有1μl钙黄绿素、1μl PI和1μl hochest）覆盖凝胶表面即可，在37℃孵育30分钟后弃去多余的染液，PBS清洗2次，最后用荧光显微镜观察。

1.1.7 皮下植入实验

SD大鼠共25只，2月龄，体重250～300g，其中15只用于皮下注射植入实验观察SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC及SISP材料的炎症反应，另外10只B超观察三组材料在体内的体积维持情况。大鼠用水合氯醛麻醉后沿背部脊柱两侧去毛，再用碘伏消毒三次后，在脊柱两侧选择3个点分别作为实验组和对照组，每个点至少间隔2cm。SISP/CSCl-GP-HECl凝胶组为实验组，CSCl-GP-HEC凝胶组和SISP/PBS(30mg/ml)组作为对照组。术后7、14、28天处死5只SD大鼠取材，在4%多聚甲醛固定液中固定24小时，石蜡包埋，切片（片厚4μm），HE及Masson染色，显微镜下观察。通过数字图像分析系统(Nikon E600Microscope，Nikon Digital Camera DXM1200,Nikon Corporation,Japan)于每张切片随机采取6个视野照相，炎性细胞（包括单核细胞、多形核白细胞）数目及材料皮肤侧纤维囊厚度采用图像分析系统(Image-Pro Plus,Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)计数和测量[63,64]。另外10只分别在第2、4、6、8、12周B超观察材料在体内植入后形状的维持。用iU22B超仪（PHILIPS公司）在17-5MHz频率下使用Caliper功能检测皮下植入材料的长、宽、高并记录，按公式（体积=3/4π×1/2长×1/2宽×1/2高）计算出植入物体积，将2、4、6、8、12周的体积与第一天的体积相比得出材料的体积比。

1.1.8 组织学分析

将取下的组织用4%多聚甲醛固定24h后，流水冲洗过夜，再在室温下放入80%，90%，95%，100%，100%酒精梯度脱水12h，接着放入ETC组织透明液8h，然后在60℃恒温箱中Ⅰ蜡，Ⅱ蜡，Ⅲ蜡里分别浸泡2h，最后石蜡包埋，制成5μm厚的切片。将切片做苏木精-伊红染色，用显微镜观察并拍照。通过数字图像分析系统(Nikon E600Microscope，Nikon DigitalCamera DXM1200,Nikon Corporation,Japan)于每张切片随机采取6个视野照相，炎性细胞（包括单核细胞、多形核白细胞）数目采用图像分析系统(Image-Pro Plus,Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)计数[Boer,U.;Lohrenz,A.;Klingenberg,M.,et al.The effect of detergent-baseddecellularization procedures on cellular proteins and immunogenicity in equinecarotid artery grafts.Biomaterials,2011;32(36):9730-7]。

1.1.9 统计学方法

数据采用SPSS16统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD法，P值<0.05有统计学意义。

2、实验结果

2.1本发明温敏特性检测结果（扫描电镜和流变学检测）

如图3扫描电镜（SEM）的结果所示，本发明SISP/CSCl-GP-HEC凝胶呈白色不透明，CSCl-GP-HEC凝胶呈无色透明，二者在在37℃下均可由液态变为凝胶态。

如图6～7所示，本发明SISP/CSCl-β-DGP-HEC凝胶、CSCl-β-DGP-HEC凝胶的初始凝胶化温度分别为16℃、13℃，凝胶化时间分别为（2.8±1.48）min、（1.5±0.86）min，杂化温敏材料的相变时间短于单纯壳聚糖无统计学意义；当加温到10℃，两种材料初始储能模量G’和耗能模量G”均约1Pa，表明处于可流动的液体状态，在相变温度后，材料储能模量G’上升，表明材料从液态向凝胶态转变。

实验结果说明，本发明水凝胶具有良好的温敏特性，成胶时间为2.8±1.13分钟，在注入体内后可快速形成凝胶，有利于形状的维持。

2.2 生长因子的含量以及释放情况检测结果

VEGF和bFGF在I型胶原酶酶解和PBS水解作用下的累积释放趋势图如图3～4以及图8所示：

表3 VEGF的累积释放量

表4 bFGF的累积释放量

如图9所示，VEGF和bFGF在水解和酶解作用下释放趋势相同，SISP/CSCl-GP-HEC凝胶内bFGF在30天内持续缓慢释放，VEGF释放曲线在第1天到第15天快速升高，之后趋于平缓，bFGF释放曲线持续升高。

实验结果说明，采用本发明特定基质，在本发明特定条件下制备的温敏性水凝胶，生长因子含量高，无初期爆发释放生长因子的现象，能够长时间逐步缓慢释放生长因子，克服了现有直接复合生长因子的水凝胶存在生长因子活性低、生长因子易在短时间内释放的缺陷。

2.3 小肠粘膜下层结构检测结果（扫描电镜和傅里叶红外光谱（FT-IR） 检测）

如图4的扫描电镜（SEM）的结果所示，本发明SISP/CSCl-GP-HEC凝胶均呈多孔海绵状（图4A、B），孔径为264.23±106.12μm。SISP微粉粒径小于凝胶孔径，在SISP/CSCl-GP-HEC凝胶孔壁上可以观察到SISP，其胶原蛋白结构完整。（图4D、E）。

傅里叶红外光谱检测（图5）结果表明：

SISP/CSCl-GP-HEC吸收峰有：3450cm-1左右由O-H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰,2920cm-1附近有甲基或次甲基的C-H伸缩振动吸收峰，1650cm-1(酰胺Ⅰ)、1550cm-1(酰胺Ⅱ)，1310cm-1(酰胺Ⅲ)以及在1116cm-1和1072cm-1归属于磷酸根的不对称伸缩振动吸收峰，975cm-1归属于磷酸根的对称伸缩振动吸收峰，磷酸根是壳聚糖凝胶中GP的基团。

在CSCl-GP-HEC的红外光谱图中,比较特征的吸收峰有：3450cm-1左右由O-H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰,2920cm-1附近有甲基或次甲基的C-H伸缩振动吸收峰。酰胺(NH-C=O)的三个特征吸收峰,分别是1650cm-1(酰胺Ⅰ)、1550cm-1(酰胺Ⅱ)和1310cm-1(酰胺Ⅲ),以及氨基(-NH2)在1600cm-1附近的特征吸收谱带，在1116cm-1和1072cm-1归属于磷酸根的不对称伸缩振动吸收峰，975cm-1归属于磷酸根的对称伸缩振动吸收峰，磷酸根是壳聚糖凝胶中β-DGP的基团。

在SISP的红外光谱图中，比较特征的吸收峰有：3450cm-1左右由O-H的伸缩振动吸收峰和N-H的伸缩振动吸收峰重叠而成的一个宽峰,3082cm-1处甲基的对称和反对称伸缩振动、2958cm-1处的亚甲基的反对称面内的弯曲振动、1652cm-1（酰胺I带）处C=O对称伸缩振动、1539cm-1（酰胺II带）处的N-H弯曲振动与C-N伸缩振动和1310cm-1（酰胺III带）处的N-H面内变形振动与C-N伸缩振动。

对比SISP和CSCl-GP-HEC凝胶，SISP/CSCl-GP-HEC凝胶的图谱发生轻微的改变，但是SIS和CSCl-GP-HEC的特征吸收峰均可以观察到。

实验结果说明，采用本发明特定基质，在本发明特定条件下制备温敏性水凝胶，可以有效维持小肠粘膜下层微粉的超微结构，有利于细胞的粘附迁移和增殖，克服了现有方法制备的小肠粘膜下层凝胶超微结构被破坏的缺陷。

2.4 材料体外降解

本发明水凝胶的降解失重率如表5和图9所示所示：

表5 本发明水凝胶的降解失重率

SISP/CSCl-GP-HEC凝胶用PBS水解和0.2%I型胶原酶酶解作用下失重率曲线逐渐上升，酶解作用下的失重率大于水解作用，在第30天酶解的失重率达到90%，水解失重率达到63%。在I型胶原酶作用下，失重率曲线在第1天到第10天上升较快，之后趋于平缓。水解作用下的失重率曲线上升较为平缓。

实验结果说明，本发明水凝胶具有可降解性，表明其具有适宜的生物可降解性，是一种良好的组织工程支架材料。

2.5 细胞实验

将成纤维细胞接种于SISP-CSCl凝胶、CSCl凝胶和SISP后，细胞数量变化情况如图10～12所示：

第1天时，细胞数量差别不明显；第4和7天时SISP/CSCl-GP-HECl凝胶和CSCl-GP-HEC凝胶上的细胞呈球形生长，在SISP组中细胞围绕SISP微球生长。

SISP组，细胞围绕SIS微粉生长，细胞形态完整，细胞数明显增加，而在SISP/CSCl-GP-HEC凝胶和CSCl-GP-HEC凝胶上，成纤维细胞逐渐增长为细胞团块，随培养时间延长，细胞团块的数量和体积都明显增加。

实验结果说明，细胞在本发明凝胶上生长良好，说明本发明凝胶有良好的细胞生物相容性，可以负载细胞，用于体内缺损修复。

2.6 皮下植入

2.6.1 大体观察

如图13～14所示，将材料注射至大鼠皮下1小时后，SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC均形成椭圆球形凝胶（图13），术后1周，各组材料明显可见，术后1个月，SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC可见，SISP体积明显减小，不易分辨。各时间点所有植入部位均无严重反应，如肉芽组织形成、坏死、感染等（图14a）。

2.6.2 组织学观察

不同材料在体内引起的炎性反应如表6和图15～19所示：

表6 不同材料内炎性细胞密度

炎性细胞数量的变化：

如图15所示，植入后1周，SISP/CSCl-GP-HEC材料边沿有大量炎性细胞浸润，包括多形核白细胞和嗜中性粒细胞，材料内部可见片状SISP，细胞浸润较少；CSCl-GP-HEC材料与组织界面附近有大量炎性细胞，包括多形核白细胞和嗜中性粒；SISP组细胞浸润较快，材料中部区域已有炎性细胞，炎性细胞数较上述两组材料少；

如图16所示，植入后2周，SISP/CSCl-GP-HEC材料组，炎性细胞进一步向材料内浸润，主要为嗜中性粒细胞，材料内部可见片状SISP，细胞浸润增多；CSCl-GP-HEC材料内炎性细胞减低；SISP组细胞炎性细胞数增加；

如图17所示，植入后4周，SISP/CSCl-GP-HEC材料仍有炎性细胞浸润，包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞，材料内炎性细胞密度为16.53±9.46个/0.01mm²与CSCl-GP-HEC、SISP组差异无统计学意义（P>0.05）（见图18），材料内SISP松散；CSCl-GP-HEC材料炎性细胞减少，炎性细胞密度为4.36±1.07个/0.01mm²，与SISP/CSCl-GP-HEC、SISP差异无统计学意义（P>0.05）（见图18）；SISP组炎性细胞增多，其密度为18.20±15.62个/0.01mm²，与植入后2周差异无统计学意义（P>0.05）（见图18），与SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC组相比差异无统计学意义（P>0.05）（见图18），SISP更为疏松，降解明显。

纤维囊的变化：

如图15所示，术后1周，纤维囊由含有大量炎性细胞，主要包括单核细胞、淋巴细胞等，少量成纤维细胞的疏松结缔组织构成，SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC皮肤侧纤维囊厚度分别为481.45±126.11μm和413.36±178.45μm，与SISP组230.04±114.56μm差异无统计学意义（P>0.05）（见图19）；

如图16所示，术后2周，纤维囊中主要为单核细胞，嗜中性粒细胞数量逐渐增加，成纤维细胞分泌大量胞外基质，有血管形成。三组材料纤维囊厚度分别为324±78.08μm、311.34±257.67μm、171.00±101.32μm，SISP/CSCl-GP-HEC、CSCl-GP-HEC纤维囊厚度大于SISP组，差异无统计学意义（P>0.05）（见图19）；

如图17所示，术后4周，SISP/CSCl-GP-HEC纤维囊厚度为451.63±135.40μm，与术后1、2周比差异无统计学意义（P>0.05）（见图19），高于SISP组，差异有统计学意义（P<0.05）（见图19），低于CSCl-GP-HEC组μm，差异无统计学意义（P>0.05）（见图19），细胞主要为单核细胞和成纤维细胞等。CSCl-GP-HEC组纤维囊厚度增加为717.69±262.41，高于其术后1、2周，与1周相比差异无统计学意义（P>0.05）（见图19），与2周相比差异有统计学意义（P<0.05），纤维囊中细胞主要为单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。

实验结果说明，本发明凝胶在体内引起的炎性反应较弱，可用于体内组织修复。

2.6.3 B超检测

通过B超监测各组分体积在皮下3个月内的变化情况如表7和图20～22：

表7 不同材料在体内不同时间的体积比

a：与0.5个月体积比相比较，P<0.05。

如表7和图20～22所示:

小肠粘膜下层微粉SISP在体内的降解速度非常快，1个月内迅速下降，至1.5个月时已完全检测不到；CSCl-GP-HEC的降低速度则非常慢，植入体内3个月时，仍可检测。

而本发明温敏性水凝胶在2个月内逐步降解，其中的小肠粘膜下层微粉降解速度较单纯SISP降解速度减慢，在体内存留时间相对较长。

综上，采用本发明特定基质，在本发明特定条件下制备得到的温敏复合材料，，含有多种生长因子，，并可持续缓释，有效地解决了现有直接复合生长因子的凝胶，存在生长因子活性低、生长因子易在短时间内释放的问题；其中的小肠粘膜下层的微结构与天然小肠粘膜下层相似，有利于细胞的粘附迁移和增殖，克服了现有方法制备的小肠粘膜下层凝胶超微结构被破坏的缺陷。同时，本发明凝胶具有温敏特性，注入体内可快速形成凝胶，可用于修复不规则缺损，生物相容性良好，具有良好的可降解特性，免疫原性低，能够有效促进组织修复。

Claims (9)

1.一种温敏复合材料基质组合物，其特征在于：它包括如下重量配比的成分：

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：它包括如下重量配比的成分：

3.一种温敏复合材料，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的基质组合物和水。

4.根据权利要求3所述的温敏复合材料，其特征在于：小肠粘膜下层微粉的浓度为5～30mg/ml。

5.根据权利要求4所述的温敏复合材料，其特征在于：所述小肠粘膜下层微粉的浓度为30mg/ml。

6.一种制备权利要求3～5任意一项所述温敏复合材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)按照权利要求1或2的配比，取原料；

(2)分别将氯化壳聚糖、β-甘油磷酸二钠和羟乙基纤维素溶于水性溶剂，得浓度为20mg/ml的氯化壳聚糖溶液，得浓度为115mg/ml的β-甘油磷酸二钠溶液，得浓度为25mg/ml的羟乙基纤维素溶液，将三种溶液按8:2:2.5混合；

(3)在步骤(2)的混合溶液中加入小肠粘膜下层微粉至浓度为5～30mg/ml，混匀，在pH 6.5～7.5，温度35～38℃的条件下放置2～8min，形成凝胶，即得本发明温敏复合材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，小肠粘膜下层微粉的浓度为30mg/ml。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述pH为7.2，所述温度为37℃。

9.权利要求3～5任意一项所述温敏复合材料在制备缺损修复材料中的用途。