CN111214699A - 一种用于周围神经损伤修复的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于周围神经损伤修复的水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.2％～0.6％、羟乙基纤维素钠0.18％～0.22％、壳聚糖1.5％～2.5％、β‑甘油磷酸钠2.5％～3.5％、PLGA载药微球0.8％～1.2％、余量为水。本发明的水凝胶以CS‑HEC‑HA/GP为基质，克服了单一组分HA支架的缺点，改善了基质的机械性、控制胶凝时间以及可控降解等，属于温敏型水凝胶，可用来注射给药；此外，将神经生长因子NGF装入生物材料中，可直接在组织修复中实现靶向性、持续性的分子释放，将NGF载入PLGA微球制得粒径均匀的PLGA(NGF)，达到药物缓释的效果，延长水凝胶的治疗周期，从而避免药物爆释引起的副作用。

Description

一种用于周围神经损伤修复的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于周围神经损伤修复的水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程材料领域。
背景技术
周围神经损伤(PNI)的修复效果是一直困扰骨科医生的难题。通过端端缝合的方式可以达到治疗短距离神经缺损，长段神经缺损治疗的“金标准”是自体神经移植，但自体神经移植存在供体来源有限、供体区副损伤、手术区和供体神经不相匹配等缺陷，限制了其临床应用。已有组织工程神经导管在临床上被批准使用，并且在PNI治疗上已取得了一定进展。但是，在长段神经缺损情况下，空载神经导管缺乏细胞外基质、神经生长因子等改善神经导管腔内微环境的填充物，治疗效果欠佳。目前已有多种生物材料、生长因子、细胞联合应用于改善PNI再生局部微环境。神经生长因子(NGF)治疗PNI有确切疗效，但是NGF存在半衰期短、容易扩散、难以定位等缺点，且作为一种大分子蛋白质，NGF治疗不能通过静脉内滴注或口服给药，限制了NGF的应用。因此，通过研制不同NGF载体在损伤局部释放NGF以提高其生物利用率成为亟需解决的问题。
水凝胶作为缓释生长因子(药物)的载体，具有良好的组织亲和性与生物降解性。由于结构类似于细胞外基质，水凝胶能填充神经导管，为新生轴突提供结构支撑，促进神经再生。现有研究表明，通过使用层黏连蛋白凝胶充满硅胶管治疗大鼠坐骨神经10mm缺损，层黏连蛋白凝胶组与硅胶管组、生理盐水组相比轴突生长速率更快，表明层黏连蛋白凝胶能够促进轴突生长。
透明质酸(HA)是细胞外基质的主要成分之一，具有良好的保水性能，既够减少受损部位瘢痕形成，又能够促进轴突再生。然而，HA在体内降解较快，从而限制了其在PNI修复中的应用。目前使用透明质酸凝胶来治疗大鼠10mm神经缺损，通过神经电生理及免疫组化检测，透明质酸凝胶组神经电传导速度更快，再生轴突以及髓鞘数量也明显多于生理盐水对照组，该研究取得了一定的修复效果，但与自体神经移植组(金标准)结果相比，仍存在差距。且天然水凝胶存在着材料重复性差，结构、力学性能不受人工调节等问题。因此，与其他材料混合构建复合型水凝胶支架成为一种可行的思路。
壳聚糖(CS)是一种天然生物大分子，具有良好的生物相容性以及消炎、抗菌等特性。β-甘油磷酸钠(GP)是一种动物体内天然存在的有机化合物，临床上通常作为磷补充剂用于治疗磷酸盐代谢失衡。CS与GP可混合构建一种温敏型水凝胶，该种水凝胶具有良好的生物相容性、稳定性以及温敏凝胶特性，常温下为液态，植入动物体内后能在体温作用下形成凝胶。
羟乙基纤维素钠(HEC)是一种常见的可溶性纤维素衍生物，具有良好的增稠、保水以及保护胶体等特性，被广泛应用于医药食品领域，HEC与CS和GP混合构建CS-HEC/GP水凝胶，可以起到提高水凝胶性能的作用，同时还能减少GP的用量，进而减弱GP带来的高渗透压对细胞生长所产生的影响。
因此，通过联合制备以上水凝胶材料，从而提高NGF生物利用率是PNI治疗一个绝佳的选择，国内相关研究报道较少。有报道通过EDC/NHS作为交联剂，制备GEL和HA凝胶材料，然而，交联剂的毒性可能对PNI修复产生不利的影响。本研究制备凝胶基质时不需要加入交联剂也可成胶，降低了水凝胶的毒性，制备出负载NGF的低毒性的水凝胶材料。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于周围神经损伤修复的水凝胶及其制备方法，该水凝胶具有优异的生物相容性，能够持续释放神经生长(NGF)因子来治疗周围神经损伤。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于周围神经损伤修复的水凝胶，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.2％～0.6％、羟乙基纤维素钠0.18％～0.22％、壳聚糖1.5％～2.5％、β-甘油磷酸钠2.5％～3.5％、PLGA载药微球0.8％～1.2％、余量为水。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.4％、羟乙基纤维素钠0.2％、壳聚糖2％、β-甘油磷酸钠3％、PLGA载药微球1％、余量为水。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述PLGA载药微球为负载神经生长因子NGF的PLGA微球。
本发明通过将神经生长因子NGF负载在PLGA微球上，然后与壳聚糖-羟乙基纤维素钠-透明质酸/β-甘油磷酸钠(CS-HEC-HA/GP)的混合溶液相互作用，形成一种新型的治疗周围神经损伤的水凝胶CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)。CS-HEC/GP修饰HA可以改善基质的机械性、控制胶凝时间以及可控降解等，并且属于温敏型水凝胶，可用来注射给药。此外，神经生长因子NGF治疗PNI有确切疗效，采用PLGA微球缓释NGF可以延长水凝胶的治疗周期。
壳聚糖(CS)和β-甘油磷酸钠(GP)可以构建一种温敏性水凝胶，该种水凝胶不需要采用大面积外科手术的移植方案，从而在较大程度上降低了移植过程中发生二次损伤的风险，但其在生理温度37℃下的温敏特性依赖于较高的GP浓度，而高浓度的GP会降低CS/GP水凝胶的生物相容性。通过在CS/GP混合溶液中加入一定量的羟乙基纤维素钠(HEC)，可以降低水凝胶对GP的依赖程度，从而提高水凝胶的生物相容性。透明质酸(HA)作为一种能够促进细胞贴附、增殖的天然多糖，被同时作为水凝胶结构成分以及活性因子成分加入到CS-HEC/GP水凝胶中，旨在提高水凝胶整体的生物相容性及组织亲和度。CS-HEC-HA/GP水凝胶前液在室温条件下具有良好的可注射性能，引起排斥反应的程度很低，在神经再生时提供营养物质及结构支持，并且可控降解。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述PLGA载药微球的制备方法为：
(1)将PVA溶于去离子水中形成PVA溶液；
(2)将PLGA溶于二氯甲烷溶液中形成PLGA溶液；
(3)将NGF溶解在PBS缓冲溶液中形成NGF溶液，将NGF溶液滴入PLGA溶液中，得PLGA/NGF混合溶液；
(4)将PVA溶液和PLGA/NGF混合溶液在冰浴下降温，将PBS缓冲溶液加入PLGA/NGF混合溶液中得PLGA/NGF的PBS混合溶液，超声分散后加入到PVA溶液中，继续超声至液体呈淡乳白色后，搅拌使二氯甲烷挥发完全；
(5)待微球成型后，离心，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，冷冻、干燥，即得PLGA载药微球。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述PVA溶液的浓度为0.1％，所述PLGA溶液的浓度为8％～10％，所述NGF溶液的浓度为170～250ng/mL。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述步骤(3)中，NGF溶液与PLGA溶液的体积比为1:6；所述步骤(4)中，PBS缓冲溶液与PLGA/NGF混合溶液的体积比为1:7，所述PVA溶液与PLGA/NGF的PBS混合溶液的体积比为6:1。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述步骤(4)中，超声分散时间为15～25s，搅拌时间为4～6h；所述步骤(5)中，离心时间为3～5min，冷冻温度为-20℃。
作为本发明所述水凝胶的优选实施方式，所述PLGA载药微球的制备方法为：
(1)将0.3g PVA溶于300mL去离子水中，在60～80℃条件下使其溶解完全，形成PVA溶液；
(2)将0.28～0.35g PLGA溶于3.5mL二氯甲烷溶液中，形成PLGA溶液；
(3)将NGF溶解在PBS缓冲溶液中，配成170～250ng/mL的NGF溶液，取500μL NGF溶液滴入3mL的PLGA溶液中得PLGA/NGF混合溶液；
(4)将PVA溶液和PLGA/NGF混合溶液在冰浴下降温，取500μL PBS缓冲溶液加入PLGA/NGF混合溶液中，用超声细胞破碎仪在200W功率下超声分散15～25s至液体呈乳白色；
(5)用滴管滴加上述溶液到24mL PVA溶液中，继续超声分散2min至液体呈淡乳白色后，放置于磁力搅拌器上搅拌4～6h，以使二氯甲烷有机溶剂挥发完全；
(6)待微球成型后，在5000rpm转速条件下离心3～5min，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心清洗三次；
(7)清洗过后放入-20℃冰箱中冷冻，真空干燥后即得PLGA载药微球。
优选地，步骤(1)中，搅拌温度为70℃；步骤(2)中，PLGA的用量为0.3g；步骤(3)中，NGF溶液的浓度为200ng/mL；步骤(4)中，超声分散时间为20s；步骤(5)中，磁力搅拌时间为5h；步骤(6)中，离心时间为4min。
第二方面，本发明提供了上述水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将透明质酸溶于蒸馏水中，形成透明质酸溶液；
(2)将羟乙基纤维素钠加入透明质酸溶液中，搅拌至完全溶解，形成混合溶液；
(3)将壳聚糖加入到步骤(2)所得的混合溶液中，搅拌均匀后加入盐酸溶液，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，形成壳聚糖/羟乙基纤维素钠/透明质酸混合溶液，保存备用；
(4)将β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到步骤(3)所得的壳聚糖/羟乙基纤维素钠/透明质酸混合溶液中，滴加完成后继续冰浴搅拌，混合均匀后保存备用；
(5)加入PLGA载药微球，摇匀、注入模具、冷冻、干燥，即得用于周围神经损伤修复的水凝胶。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，盐酸溶液的浓度为1mol/L，保存温度为4℃。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，β-甘油磷酸钠溶液的浓度为25％～35％，冰浴搅拌时间为10min，保存温度为4℃；所述步骤(5)中，冷冻温度为-80℃。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述水凝胶的制备方法为：
(1)将20～60mg透明质酸(HA)搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将18～22mg羟乙基纤维素钠(HEC)加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将150～250mg壳聚糖(CS)加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 25％～35％的β-甘油磷酸钠(GP)溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.2％～0.6％；
(5)加入0.8～1.2wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
优选地，HA的用量为40mg，HEC的用量为20mg，CS的用量为200mg，GP溶液的浓度为30％，PLGA载药微球的用量为1.0wt.％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明通过将神经生长因子NGF负载在PLGA微球上，然后与壳聚糖-羟乙基纤维素钠-透明质酸/β-甘油磷酸钠(CS-HEC-HA/GP)的混合溶液相互作用，形成一种新型的治疗周围神经损伤的水凝胶CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)。
(2)本发明的水凝胶以CS-HEC-HA/GP为基质，克服了单一组分HA支架的缺点，改善了基质的机械性、控制胶凝时间以及可控降解等，属于温敏型水凝胶，可用来注射给药；此外，将神经生长因子NGF装入生物材料中，可直接在组织修复中实现靶向性、持续性的分子释放，将NGF载入PLGA微球制得粒径均匀的PLGA(NGF)，达到药物缓释的效果，延长水凝胶的治疗周期，从而避免药物爆释引起的副作用。
(3)本发明的水凝胶具有可降解性和无毒性，很大程度上减轻了患者的不适感、身体/经济负担，是一种很有前途的治疗周围神经损伤的生物功能材料。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的PLGA载药微球的扫描电镜图。
图2为本发明实施例1制备的PLGA载药微球的粒径分布图。
图3为本发明实施例2制备的水凝胶在25℃和37℃的成胶示意图，其中，A为25℃下的成胶示意图，B为37℃下的成胶示意图。
图4为本发明实施例2制备的水凝胶的扫描电子显微镜图。
图5为本发明实施例2～5制备的水凝胶的含水率统计图，其中，A为实施例2制备的水凝胶，B为实施例3制备的水凝胶，C为实施例4制备的水凝胶，D为实施例5制备的水凝胶。
图6为本发明实施例2～5制备的水凝胶在人工脑脊液中的降解情况统计图。
图7为本发明实施例3～5制备的水凝胶在37℃条件下的成胶时间统计图。
图8为本发明实施例3～5对海马神经元细胞的细胞毒性统计图。
图9为本发明实施例4制备的水凝胶在人工脑脊液中NGF的释放情况统计图，其中，A为NGF在PBS中的标准曲线图，B为实施例4制备的水凝胶在模拟体内环境条件下NGF随时间的累计释放量图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种PLGA载药微球，制备方法如下：
(1)将0.3g PVA溶于300mL去离子水中，在70℃条件下使其溶解完全，形成PVA溶液；
(2)将0.3g PLGA溶于3.5mL二氯甲烷溶液中，形成PLGA溶液；
(3)将NGF溶解在PBS缓冲溶液中，配成200ng/mL的NGF溶液，取500μL NGF溶液滴入3mL的PLGA溶液中得PLGA/NGF混合溶液；
(4)将PVA溶液和PLGA/NGF混合溶液在冰浴下降温，取500μL PBS缓冲溶液加入PLGA/NGF混合溶液中，用超声细胞破碎仪在200W功率下超声分散20s至液体呈乳白色；
(5)用滴管滴加上述溶液到24mL PVA溶液中，继续超声分散2min至液体呈淡乳白色后，放置于磁力搅拌器上搅拌5h，以使二氯甲烷有机溶剂挥发完全；
(6)待微球成型后，在5000rpm转速条件下离心4min，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心清洗三次；
(7)清洗过后放入-20℃冰箱中冷冻，真空干燥后即得PLGA载药微球。
本实施例制备的PLGA载药微球的扫描电镜图如图1所示，可以看出，PLGA载药微球呈球形，表面比较粗糙。本实施例制备的PLGA载药微球的粒径分布图如图2所示，可以看出，PLGA载药微球的粒径为50.75μm。
实施例2
一种CS-HEC-HA/GP水凝胶，其制备方法为：
(1)将40mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将20mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将200mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 30％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀；
(5)将上述溶液注入模具中，放入-20℃冰箱中冷冻，真空干燥后即得CS-HEC-HA/GP水凝胶。
本实施例制备的CS-HEC-HA/GP水凝胶在25℃和37℃的成胶示意图如图3所示。可以看出，CS-HEC-HA/GP水凝胶具有良好的温度敏感特性，在室温条件下能较长时间保持液体状态，在37℃条件下能快速形成凝胶。
本实施例制备的CS-HEC-HA/GP水凝胶的扫描电子显微镜图如图4所示。可以看出，CS-HEC-HA/GP水凝胶内部均呈现三维多孔网络结构，多孔网络结构能够为细胞的伸展、增殖提供空间，为氧气、营养及代谢物交换提供条件。
实施例3
一种CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶，包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.2％、羟乙基纤维素钠0.2％、壳聚糖2％、β-甘油磷酸钠3％、PLGA载药微球1％、余量为水。所述PLGA载药微球的制备方法同实施例1。
其制备方法为：
(1)将20mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将20mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将200mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 30％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.2％；
(5)加入1.0wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
实施例4
一种CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶，包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.4％、羟乙基纤维素钠0.2％、壳聚糖2％、β-甘油磷酸钠3％、PLGA载药微球1％、余量为水。所述PLGA载药微球的制备方法同实施例1。
其制备方法为：
(1)将40mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将20mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将200mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 30％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.4％；
(5)加入1.0wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
实施例5
一种CS-HEC-HA(60)/GP(PLGA@NGF)水凝胶，包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.6％、羟乙基纤维素钠0.2％、壳聚糖2％、β-甘油磷酸钠3％、PLGA载药微球1％、余量为水。所述PLGA载药微球的制备方法同实施例1。
其制备方法为：
(1)将60mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将20mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将200mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 30％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.6％；
(5)加入1.0wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA(60)/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
实施例6
一种CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)水凝胶，包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.2％、羟乙基纤维素钠0.18％、壳聚糖1.5％、β-甘油磷酸钠2.5％、PLGA载药微球0.8％、余量为水。所述PLGA载药微球的制备方法同实施例1。
其制备方法为：
(1)将20mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将18mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将150mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 25％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.6％；
(5)加入0.8wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
实施例7
一种CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)水凝胶，包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.6％、羟乙基纤维素钠0.22％、壳聚糖2.5％、β-甘油磷酸钠3.5％、PLGA载药微球1.2％、余量为水。所述PLGA载药微球的制备方法同实施例1。
其制备方法为：
(1)将60mg HA搅拌溶解至8mL蒸馏水中，形成HA溶液；
(2)将22mg HEC加入到HA溶液中，继续搅拌至HEC完全溶解，形成混合溶液；
(3)将250mg CS加入混合溶液中，搅拌均匀后加入1mL 1mol/L的盐酸溶液，继续搅拌至CS完全溶解，形成CS/HEC/HA混合溶液，4℃保存备用；
(4)将1mL 35％的GP溶液缓慢滴加到8mL CS/HEC/HA混合溶液中，滴加完成后继续在冰浴搅拌10min以混合均匀，随后置于4℃保存，HA的最终浓度分别为0.6％；
(5)加入1.2wt.％的PLGA载药微球，摇匀，注入模具，放入-80℃急冻，之后采用冷冻干燥法，得到CS-HEC-HA/GP(PLGA@NGF)水凝胶。
效果例
(1)含水率测试
测试方法：待成胶后，将水凝胶取出，用滤纸吸干周围水分，称取水凝胶质量记为Ww，冷冻干燥后称取其质量记为Wd，利用公式计算水凝胶的含水率:
Figure BDA0002359397950000111
实施例2～5制备的水凝胶的含水率如图5所示，其中，A为实施例2制备的水凝胶，B为实施例3制备的水凝胶，C为实施例4制备的水凝胶，D为实施例5制备的水凝胶。可以能看出，实施例2制备的CS-HEC-HA/GP水凝胶含水率在90％以上，实施例3制备的CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶含水率为94.2±0.78％，实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶含水率为94.8±0.98％，实施例5制备的CS-HEC-HA(60)/GP(PLGA@NGF)水凝胶含水率为95.9±0.33％，说明实施例2～5制备的水凝胶均具有高含水率的特性。
(2)在人工脑脊液中的降解情况
测试方法：对水凝胶的降解行为进行了监测。初始称重支架(W0)浸泡在ACSF中，置于恒温摇床(37℃，70rpm)。在测量的时间点，去除水凝胶并称重(Wt)。并分别于3、7、14、21、28天分别取出样品，超纯水清洗，冻干称重。并在特定的时间点对支架进行扫描电镜观察支架形貌，采用公式计算出支架的体外降解率：
降解率(％)＝(Wo-W1)/Wo×100％。
实施例2～5制备的水凝胶在人工脑脊液中的降解情况如图6所示。可以看出，实施例2制备的CS-HEC-HA/GP水凝胶在28天内持续降解，浸泡28天后剩余水凝胶的质量约为原质量的30％；实施例3制备的CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶在28天内持续降解，浸泡28天后剩余水凝胶的质量约为原质量的30％；实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶在28天内持续降解，浸泡28天后剩余水凝胶的质量约为原质量的33％；实施例5制备的CS-HEC-HA(60)/GP(PLGA@NGF)水凝胶在28天内持续降解，浸泡28天后剩余水凝胶的质量约为原质量的28％；说明实施例2～5制备的水凝胶均具有良好的稳定性及可降解性。
(3)成胶时间测试
测试方法：取1mL预制的水凝胶前液加入试管，将试管放入37℃恒温水浴锅，每隔30s取出观察，通过倾斜法和倒置法判断凝胶是否形成，判断标准为水凝胶维持形状不变超过60s，所需时间即为胶凝时间。
实施例3～5制备的水凝胶在37℃条件下的成胶时间如图7所示。实施例3制备的CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的成胶时间大概为4.3分钟，根据文献报道及实际操作经验，配合水凝胶温敏可注射特性，10min以内是较为理想的胶凝时间范围。实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的成胶时间大概为2.7分钟，比CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的成胶时间要短。实施例5制备的CS-HEC-HA(60)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的成胶时间大概为0.9分钟，成胶时间过短，内部结构太过紧致，可能不利用NGF的释放。
(4)生物相容性测试
测试方法：采用CCK8定量分析水凝胶表面细胞的存活率。在指定的时间间隔取出相应的孔板，每孔加100μL CCK8工作液，，在37℃恒温二氧化碳培养箱(含5％的CO2)中孵育1～2h后，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度(OD)。
实施例3～5制备的水凝胶对海马神经元细胞的细胞毒性统计图如图8所示，实施例3制备的CS-HEC-HA(20)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的细胞存活率为98.9±3.4％，实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的细胞存活率为103.5±0.56％，实施例5制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的细胞存活率为101.8±1.23％，实施例3～5制备的水凝胶均不会对PKN-012细胞产生毒副作用。
(5)在人工脑脊液(ACSF)中NGF的释放情况
通过以上结果分析可知，胶凝时间与HA的浓度呈负相关，实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶的成胶时间最为适宜。各组水凝胶含水率均在90％以上，水凝胶含水率随HA的浓度增加而增加。以实施例4制备的CS-HEC-HA(40)/GP(PLGA@NGF)水凝胶为例，考察在人工脑脊液中NGF的释放情况。
测试方法：将水凝胶沉浸在20mL的ACSF溶液中，密封后置于37℃、100rpm的恒温摇床中模拟体外释放。在指定的时间点取出100μL释放液，同时补加100μL同温度的新鲜的ACSF溶液。采用直接紫外光谱法分别测定释放液中NGF含量，计算药物累计释放量。
实施例4制备的水凝胶在人工脑脊液中NGF的释放情况如图9所示，其中，A为NGF在PBS中测得的标准曲线，B为实施例4制备的水凝胶在模拟体内环境条件下NGF随时间的累计释放量。可以看出，第一天NGF释放较快，之后NGF释放速率降低，七天之后还在持续释放。原因是NGF在水凝胶表面区域的快速脱附(吸附)(释放)，然后由于水凝胶中的网络结构延缓NGF的释放。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于周围神经损伤修复的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.2％～0.6％、羟乙基纤维素钠0.18％～0.22％、壳聚糖1.5％～2.5％、β-甘油磷酸钠2.5％～3.5％、PLGA载药微球0.8％～1.2％、余量为水。
2.如权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含如下质量百分比的组分：透明质酸0.4％、羟乙基纤维素钠0.2％、壳聚糖2％、β-甘油磷酸钠3％、PLGA载药微球1％、余量为水。
3.如权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，所述PLGA载药微球为负载神经生长因子NGF的PLGA微球。
4.如权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述PLGA载药微球的制备方法为：
(1)将PVA溶于去离子水中形成PVA溶液；
(2)将PLGA溶于二氯甲烷溶液中形成PLGA溶液；
(3)将NGF溶解在PBS缓冲溶液中形成NGF溶液，将NGF溶液滴入PLGA溶液中，得PLGA/NGF混合溶液；
(4)将PVA溶液和PLGA/NGF混合溶液在冰浴下降温，将PBS缓冲溶液加入PLGA/NGF混合溶液中得PLGA/NGF的PBS混合溶液，超声分散后加入到PVA溶液中，继续超声至液体呈淡乳白色后，搅拌使二氯甲烷挥发完全；
(5)待微球成型后，离心，弃去上清，用去离子水清洗沉淀，冷冻、干燥，即得PLGA载药微球。
5.如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述PVA溶液的浓度为0.1％，所述PLGA溶液的浓度为8％～10％，所述NGF溶液的浓度为170～250ng/mL。
6.如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述步骤(3)中，NGF溶液与PLGA溶液的体积比为1:6；所述步骤(4)中，PBS缓冲溶液与PLGA/NGF混合溶液的体积比为1:7，所述PVA溶液与PLGA/NGF的PBS混合溶液的体积比为6:1。
7.如权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，所述步骤(4)中，超声分散时间为15～25s，搅拌时间为4～6h；所述步骤(5)中，离心时间为3～5min，冷冻温度为-20℃。
8.如权利要求1～7任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将透明质酸溶于蒸馏水中，形成透明质酸溶液；
(2)将羟乙基纤维素钠加入透明质酸溶液中，搅拌至完全溶解，形成混合溶液；
(3)将壳聚糖加入到步骤(2)所得的混合溶液中，搅拌均匀后加入盐酸溶液，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，形成壳聚糖/羟乙基纤维素钠/透明质酸混合溶液，保存备用；
(4)将β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴加到步骤(3)所得的壳聚糖/羟乙基纤维素钠/透明质酸混合溶液中，滴加完成后继续冰浴搅拌，混合均匀后保存备用；
(5)加入PLGA载药微球，摇匀、注入模具、冷冻、干燥，即得用于周围神经损伤修复的水凝胶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，盐酸溶液的浓度为1mol/L，保存温度为4℃。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，β-甘油磷酸钠溶液的浓度为25％～35％，冰浴搅拌时间为10min，保存温度为4℃；所述步骤(5)中，冷冻温度为-80℃。
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