CN113549227A - 化学交联水凝胶及其微球、制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学交联水凝胶及其微球、制备方法与应用。本发明的化学交联水凝胶为蚕丝蛋白水凝胶，交联剂为二缩水甘油醚类交联剂；水凝胶是通过蚕丝在溴化锂溶液中溶解，经由二缩水甘油醚类化学交联剂交联得到。本发明的水凝胶具有良好的弹性，并在20％压缩下压缩100循环，可恢复超过90％的体积/高度；蚕丝蛋白基质结构和力学性质非常稳定，在37℃PBS中孵育30天，蚕丝蛋白二级结构中β‑折叠含量≤40％，压缩模量变化≤100％(20％压缩)。本发明的水凝胶具有良好的生物相容性和可调控的生物降解性，可用于受试者修复或者填充组织。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学交联水凝胶及其微球、制备方法与应用，属于材料技术领域。
背景技术
组织填充剂是修复组织先天性缺陷、创伤缺陷和术后缺陷的重要材料。近年来，以医疗和医美为目的的填充逐渐被大众广泛接收，随之而来的是市场需求的急剧扩大，然而，目前组织填充剂注射频率高且价格昂贵，其中主要有以下几个方面原因：水凝胶制备方法，工艺交联效率低导致的材料体内降解时间短，产品生产成本高；基质原料相对单一，主要以透明质酸和胶原为主，其中交联透明质酸钠占绝大多数市场份额；产品凝胶块界面应力较大，容易引起炎症反应。因此，寻找一种新型高效交联、界面圆润水凝胶球及其制备方法是解决目前组织填充剂领域材料需求和成本降低的关键。
蚕丝蛋白来源广泛，具有良好生物相容性、可调节力学性质和可调节降解性质，被广泛应用于生物医用材料研究，目前已有产品获得FDA和CFDA批准。蚕丝蛋白可以经过简单的温度、pH、超声处理、剪切力、表面活性剂以及阳离子试剂(例如Ca2+和K+离子)等处理形成物理交联水凝胶，但物理交联过程难以控制，凝胶硬度高而韧性不足。多种化学交联蚕丝蛋白水凝胶被报道，包括辣根过氧化物酶(含仿生酶)催化过氧化氢反应、紫外光照射核黄素、伽玛射线辐照等产生的超氧根离子介导的蚕丝蛋白分子内酪氨酸之间形成双酪氨酸和三酪氨酸结合体，但蚕丝蛋白分子内酪氨酸含量较低(约5％)，对蚕丝蛋白分子二级结构稳定性作用有限，该凝胶随时间推移，二级结构中α-螺旋和无规则卷曲结构逐渐转变为β-折叠，从而失去新制备化学交联水凝胶的弹性和透光性等性质。此外辣根过氧化物酶(含仿生酶)在内体会引起免疫反应和代谢紊乱。多聚甲醛可以与蚕丝蛋白分子中赖氨酸的氨基和酪氨酸的酚基反应形成化学交联水凝胶，但多聚甲醛的细胞毒性限制了它的应用。京尼平是一种天然的交联剂，可以通过赖氨酸和精氨酸反应形成化学交联水凝胶，但赖氨酸和精氨酸在蚕丝蛋白的组成中所占的百分比较低，每种氨基酸约为0.6mol％，导致交联效率并不高。
1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)为代表的二缩水甘油醚类交联剂作为FDA批准的交联剂，具有低毒性(相对于二乙烯基砜，DVS)、可生物降解的性能，在一定条件下与游离羟基和羧基形成稳定的共价醚键，在交联透明质酸可注射凝胶中广泛应用，如WO2017001056A1，WO2014206701A1，Dermatol Surg.2013Dec；39(12):1758–1766.A Reviewof the Metabolism of 1,4-Butanediol Diglycidyl Ether–Crosslinked HyaluronicAcid Dermal Fillers等。假设BDDE可以与蚕丝蛋白分子内含游离羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等)，含量约19.47％，和游离含羧基氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸等)，含量约2.52％，及其分子C端羧基，发生交联反应，可以将丝素蛋白分子牢牢锁住，形成较利用含量约5％的酪氨酸的HRP凝胶二级结构和力学性质更加稳定的化学交联水凝胶。这对丝素蛋白材料的研究和应用均非常重要。但发明人未检索到使用BDDE作为交联剂交联纯蚕丝蛋白形成水凝胶的报道。专利US20140315828A1中报道了可以采用BDDE交联HA的方法将蚕丝蛋白和HA共交联形成复合水凝胶，但未提及BDDE交联纯再生蚕丝蛋白形成水凝胶，而发明人团队根据该专利方法，在碱性环境下(0.25M NaOH溶液)BDDE无法交联纯再生蚕丝蛋白形成水凝胶。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种化学交联蚕丝蛋白水凝胶，其微球，制备方法及应用。本发明的水凝胶，由化学交联剂与蚕丝蛋白发生化学反应，通过化学键形成基质网络而固化得到。
本发明的第一个目的是提供一种化学交联水凝胶，该化学交联水凝胶为蚕丝蛋白水凝胶，其中交联剂为二缩水甘油醚类交联剂，丝素蛋白占干重的比例≥70％。
进一步地，二缩水甘油醚类交联剂为二环氧甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚及其衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、三(4-羟基苯基)甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种组合。
本发明的第二个目的是提供上述化学交联水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1、将蚕丝溶于溴化锂水溶液中，得到含有蚕丝蛋白的混合溶液；
S2、将二缩水甘油醚类交联剂添加到S1步骤中的所述混合溶液中，进行交联反应，得到所述化学交联水凝胶。
采用本发明的方法，可以获得由常规、安全和FDA批准的BDDE等二缩水甘油醚类交联剂交联100％蚕丝蛋白水凝胶。
进一步地，在步骤S2之后，还包括去除溴化锂、未反应的化学交联剂和游离蚕丝蛋白的步骤。
进一步地，步骤S2中，添加二缩水甘油醚类交联剂后，溴化锂浓度为1-10M。优选2-9.8M。
进一步地，步骤S2中，添加二缩水甘油醚类交联剂后，蚕丝蛋白质量分数为1-300mg/mL。优选10～250mg/mL。
进一步地，步骤S2中，蚕丝蛋白质量与化学交联剂体积比为1g：0.5μL-1mL。优选，1g：0.5μL-500μL。
进一步地，步骤S2中，交联反应的温度为10-100℃。进一步优选25-80℃。
进一步地，步骤S2中，交联反应时间为3分钟-24小时。优选5分钟-12小时。更优选1小时-6小时。
进一步地，步骤S1中，所述蚕丝中丝素蛋白的质量分数≥70％。
进一步地，蚕丝中丝胶蛋白的质量分数≤30％。
在本发明中，选用的蚕丝为脱胶丝或基因工程蚕丝，脱胶丝为部分脱胶天然蚕丝或完全脱胶天然蚕丝，其中蚕丝中丝胶含量小于总蚕丝重量的30％。
当脱胶丝为完全脱胶天然蚕丝时，S1中所得到的含有蚕丝蛋白的混合溶液中不含丝胶蛋白；
当脱胶丝为部分脱胶天然蚕丝时，S1中所得到的含有蚕丝蛋白的混合溶液中含丝胶蛋白；
当丝源为基因工程蚕丝时，S1中所得到的含有蚕丝蛋白的混合溶液中含丝胶蛋白。
本发明的第三个目的是提供一种化学交联水凝胶微球，所述微球为蚕丝蛋白水凝胶微球，其中交联剂为二缩水甘油醚类交联剂。
进一步地，所述的二缩水甘油醚类交联剂为二环氧甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚及其衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、三(4-羟基苯基)甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种组合。
进一步地，上述化学交联水凝胶微球粒径范围100-300μm。
本发明的第四个目的是提供上述化学交联水凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：
S01、将蚕丝溶于溴化锂水溶液中，得到含有蚕丝蛋白的混合溶液；
S02、将二缩水甘油醚类交联剂添加到S01步骤中的所述混合溶液中，混匀得到反应液；
S03、将步骤S02中的反应液加入油相体系中，在搅拌条件下进行交联反应，得到所述化学交联水凝胶微球。
进一步地，在步骤S03之后，还包括去除溴化锂、未反应的化学交联剂和游离蚕丝蛋白的步骤。
进一步地，步骤S02中，反应液中溴化锂浓度为1-10M。优选2-9.8M。
进一步地，步骤S02中，反应液中蚕丝蛋白质量分数为1-300mg/mL。优选10-250mg/mL。
进一步地，步骤S02中，蚕丝蛋白质量与化学交联剂体积比为1g：0.5μL-1mL。优选1g：0.5μL-500μL。
进一步地，步骤S03中，交联反应的温度为10-100℃。进一步优选25-80℃。
进一步地，S03步骤中，交联反应时间为3分钟-24小时。优选5分钟-12小时。更优选5分钟-6小时。
进一步地，步骤S01中，蚕丝中丝素蛋白的质量分数≥70％。
进一步地，步骤S03中，油相体系与反应液体积比大于1:1，搅拌转速为100-15000rpm。优选地，油相体系与反应液体积比为2:1-500:1。
进一步地，步骤S03中，油相体系包括但不限于：动物油，例如，脂肪酸；植物油，例如，大豆油，蓖麻子油，玉米油等；矿物油，例如凡士林、石蜡、地蜡等；或有机溶剂，例如，氯仿，乙酸乙酯，乙腈。
本发明的第五个目的是提供所述的化学交联水凝胶和/或所述的化学交联水凝胶微球在组织工程填充、修复和/或药物递送中的应用。
进一步地，所述应用包括在制备用于关节炎治疗、医美整形或眼科疾病治疗的组合物中的应用。
本发明所述的眼科疾病治疗包括在眼球内注射给药、眼球表面润滑滴剂。
本发明所述的关节炎治疗包括关节腔内注射给药，关节腔内注射润滑，以及对软骨、骨组织有一定的修复作用。
本发明所述的医美整形包括组织填充、组织修复。
进一步地，所述组合物中化学交联水凝胶制得的凝胶颗粒和/或化学交联水凝胶微球的体积分数为50-100％，蚕丝蛋白的质量分数为5-20％。
进一步地，所述组合物还包括稳定剂、润滑剂和渗透压调节剂中的一种或多种。
本发明中，稳定剂可包括玻尿酸、纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇、甘露醇、甘油等。
本发明中，润滑剂可包括玻尿酸、聚乙二醇、丙二醇、磷脂、脂质体及矿物油、玉米油、大豆油等油类物质胶原蛋白、壳聚糖、纤维素等。
本发明中，渗透压调节剂可包括甘露醇、山梨醇、甘油、氯化钠、葡萄糖等。
进一步地，所述的组合物中还包含生物活性剂、细胞外基质、细胞和药物中的一种或多种的组合。
本发明中，生物活性剂可包括羟基磷灰石、细胞因子、生长因子、肽、拟肽、抗体、核酸物质、细胞等。
本发明中，药物可包括治疗剂、营养剂、麻醉剂、消炎止痛剂、抗生素等。
本发明水凝胶中搭载的功效成分(稳定剂、润滑剂、渗透压调节剂、生物活性剂、细胞外基质、细胞、药物中的一种或多种)可以采用前载(反应前与蚕丝蛋白共混合)模式，也可以采用后载(反应后通过渗透吸附作用加载到水凝胶中)模式，也可以采用前载-后载组合模式。
本发明的第六个目的是提供所述的化学交联水凝胶和/或所述的化学交联水凝胶微球在制备薄膜、支架或硬骨材料中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的蚕丝蛋白水凝胶的丝素蛋白二级结构中，经红外光谱测定β-折叠含量≤32％；水凝胶具有良好的弹性，并在20％压缩下压缩100循环，可恢复超过90％的体积/高度。蚕丝蛋白基质结构和力学性质非常稳定，在37℃PBS中孵育30天，丝素蛋白二级结构中β-折叠含量≤40％，压缩模量增高≤1倍(20％压缩)。本发明的蚕丝蛋白水凝胶之所以具有上述优异的力学性能，主要是由于本发明在发生交联反应时，反应位点有含羟基氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等，含量约19.47％)和含羧基氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸等，含量2.52％)，多反应位点能够通过化学键形成基质网络而固化，形成的结构较常规方法更加稳定。
(2)本发明所述水凝胶具有良好的生物相容性和可调控的生物降解性，可用于受试者修复或者填充组织。
(3)本发明反应体系蚕丝蛋白、溴化锂和交联剂可以在油相封闭体系中反应形成大小均一凝胶微球，其水凝胶可注射性、外援物质引起炎症反应性、体内降解性、诱导胶原沉积性和植入体结构稳定性进一步提升。并且利用凝胶球润滑特性–球本身所具有的粘弹性和韧性使其可通过“轴承滚珠”原理作用于物体界面，起促进润滑作用，本发明的水凝胶微球可应用于人体可对骨和软骨界面、眼角膜表面等起润滑作用，可作为关节腔注射液和滴眼液成分用于关节炎和干眼病等的治疗修复。本发明的水凝胶具有良好的生物相容性、可调节力学性质和结构稳定性。
附图说明：
图1为蚕丝蛋白在不同溶丝体系中交联情况及反应效率。A：蚕丝蛋白在不同溶丝体系中交联情况；B：蚕丝蛋白在不同溶丝体系中的反应效率。
图2为脱胶丝添加浓度对BDDE交联蚕丝蛋白的影响。A：不同蚕丝蛋白浓度水凝胶的反应效率；B：不同蚕丝蛋白浓度水凝胶的压缩模量；C：400-700nm的OD值曲线；D：550nm处的OD值；E：不同蚕丝蛋白浓度的水凝胶实物图。
图3为脱胶丝添加浓度对BDDE交联蚕丝蛋白微结构的影响。A：250mg/mL；B：200mg/mL；C：150mg/mL；D：100mg/mL；E：75mg/mL。
图4为BDDE添加量对BDDE交联蚕丝蛋白的影响。A：不同Silk/BDDE比例的水凝胶的反应效率；B：不同Silk/BDDE比例的水凝胶的压缩模量；C：不同Silk/BDDE比例的水凝胶在400-700nm的OD值曲线；D：不同Silk/BDDE比例的水凝胶在550nm处的OD值；E：不同Silk/BDDE比例的水凝胶实物图。
图5为BDDE添加量对BDDE交联蚕丝蛋白微结构的影响。A：1g：32.5μL、B：1g：62.5μL、C：1g：125μL、D：1g：200μL、E：1g：250μL、F：1g：350μL、G：1g：1000μL。
图6为BDDE交联蚕丝9.3M溴化锂溶液中的稳定性评价。
图7为BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶体外降解。a：蛋白酶XIV中的Silk/BDDE水凝胶；b：PBS中的Silk/BDDE水凝胶；c：蛋白酶XIV中的Silk/Sonciation水凝胶；d：PBS中的Silk/Sonciation水凝胶；e：蛋白酶XIV中的Silk/HRP水凝胶；f：PBS中的Silk/HRP水凝胶。
图8为BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶体外细胞水平生物安全性评价。A：干细胞在不同水凝胶上第5、7天的细胞形态；B：干细胞在不同水凝胶上增长倍数图。
图9为BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶接触角。A：不同水凝胶的表面接触图，Silk/Sonciation水凝胶(a)，Silk/BDDE水凝胶(b)；B：水凝胶的初始接触角对比图；C：水凝胶的表面接触角动态变化趋势图。
图10为BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶动物水平生物安全性评价。A：Silk/BDDE的HE染色；B：Silk/Sonciation水凝胶的HE染色。
图11为化学交联蚕丝蛋白凝胶球的形貌。
图12为化学交联蚕丝蛋白凝胶球皮下注射生物安全性(HE染色)。
图13为化学交联蚕丝蛋白凝胶球皮下注射生物安全性(MASSON染色)。
图14为OA模型大鼠造模后第1、2、3、4、5、6周膝关节压痛阈值。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
称取60g生丝和25.44g的无水碳酸钠备用，量取12L的去离子水倒入不锈钢桶中，并用电磁炉加热。在去离子水即将沸腾时，加入称量好的无水碳酸钠，继续加热并搅拌至沸腾，使得无水碳酸钠充分溶解，再加入称量好的生丝，保持沸腾煮30min，每隔5min搅拌一次，以溶解生丝表面的丝胶。将脱胶后的生丝用去离子水揉搓4遍，使得生丝表面的丝胶充分清除，最后将脱胶丝拧干，置于通风橱过夜干燥。根据文献报道该条件下丝胶去除率100％。
将干燥的脱胶蚕丝取10g放到盛有9.3M的40mL溴化锂中并用玻璃棒搅拌均匀。将溴化锂溶液和蚕丝混合后在60℃烘箱中加热4小时以促进蚕丝溶解。接下来，将完全溶解的丝素溶液倒入透析袋(截留分子量3500Da)中并封口。将载有丝素溶液的透析袋放入盛有5L去离子水的容器中，使用磁力搅拌器不断在容器底部搅拌以稀释透出的溴化锂，透析时间为3天，总共换水7-8次。除盐完全后，将蚕丝蛋白溶液放置于离心瓶中并在转速为9000rpm和4℃低温条件下下反复离心两次，最后得到干净的蚕丝蛋白溶液，放置于4℃冰箱保存。
进一步通过称重法测定蚕丝蛋白溶液浓度，即取称重皿称重记为W，在皿中加入1mL蚕丝蛋白溶液后称重并标记为W1，将盛有蚕丝蛋白溶液的皿放入烘箱中干燥24小时后再次称重并标记为W2。依据公式(2-1)计算出蚕丝蛋白溶液的浓度(w/w)。
浓度＝(W2-W1)/W1×100％
a、溴化锂溶丝体系：量取10mL9.3M溴化锂，将1.5g脱胶丝充分浸润后，置于60℃下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为150mg/mL的溴化锂溶丝液。
b、三元混合液溶丝体系：将111g CaCl2、92.12mL无水乙醇、114mL超纯水混合均匀，制得三元混合液。量取10mL三元混合液，将1.5g脱胶丝充分浸润后，置于80℃下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为150mg/mL的三元混合溶丝液。
c、甲酸/氯化钙溶丝体系：将4g氯化钙溶解在100mL甲酸中，制得甲酸/氯化钙混合溶液。量取10mL甲酸/氯化钙混合溶液，将1.5g脱胶丝充分浸润后，置于室温下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为150mg/mL的甲酸/氯化钙溶丝液。
d、甲酸/溴化锂溶丝体系：将1mL甲酸与13.3mL 8M溴化锂混合均匀，制得甲酸/溴化锂混合溶液。量取10mL甲酸/溴化锂混合溶液，将1.5g脱胶丝充分浸润后，置于室温下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为150mg/mL的甲酸/溴化锂溶丝液，再加入400μL的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，混合均匀，于60℃烘箱中静置3h反应。
e、取4℃冰箱保存风干发浓缩至150mg/mL再生蚕丝蛋白溶液，加入400μL的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)进行反应，混合均匀，置于60℃烘箱中，静置3h成胶。
f、碱性反应体系：取4℃冰箱保存风干发浓缩至200mg/mL再生蚕丝蛋白溶液加入1.25mL 1M NaOH，使得蚕丝蛋白浓度150mg/mL，NaOH浓度0.25M，加入400μL的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)与的混合溶液，混合均匀，置于60℃烘箱中，静置3h反应。
g、溴化锂反应体系下，再生蚕丝蛋白丝源：取4℃冰箱保存风干发浓缩至200mg/mL再生蚕丝蛋白溶液加入溴化锂粉末，使得蚕丝蛋白浓度150mg/mL，溴化锂浓度9.3M，加入400μL的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，混合均匀，置于60℃烘箱中，静置3h反应。
h、溴化锂反应体系下，三元混合液溶丝所得蚕丝蛋白丝源：将111gCaCl2、92.12mL无水乙醇、114mL超纯水混合均匀，制得三元混合液。量取10mL三元混合液，将2g脱胶丝充分浸润后，置于60℃下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为200mg/mL的三元混合溶丝液，再生蚕丝蛋白溶液加入溴化锂粉末，使得蚕丝蛋白浓度150mg/mL，溴化锂浓度9.3M，混合均匀，置于60℃烘箱中，静置3h反应。
观察反应体系中是否有块状凝胶形成，收集块状凝胶，水洗、冻干称重，计算交联效率。
反应效率＝W2/W1*100％
其中，W2为交联透明质酸，W1为交联前加入到反应体系中的透明质酸。
a、b、c、d组为已报道溶解脱胶蚕丝溶丝体系；e空白对照组、f已报道丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)与透明质酸或者透明质酸和再生蚕丝蛋白可以在碱性调价下反应形成凝胶的碱性条件。g为溴化锂反应体系下，再生蚕丝蛋白丝源，f为溴化锂反应体系下，三元混合液溶丝所得蚕丝蛋白丝源。结果如图1所示。
从图1中可以看出仅9.3M溴化锂溶丝体系中，蚕丝蛋白交联形成凝胶，其他溶丝体系中并未形成凝胶，由此可见脱胶蚕丝作为丝源、BDDE与蚕丝蛋白在溴化锂溶丝体系发生化学交联形成纯蚕丝蛋白化学交联水凝胶中具有特异性。
发明人按照实施例1的实验方案对二缩水甘油醚类，如二环氧甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚及其衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、三(4-羟基苯基)甲烷三缩水甘油基醚、新戊二醇二缩水甘油醚等具有结构通式的物质中的一种或者各种组合，进行实验，得到与实施例1类似的实验现象与结论。
实施例2：
发明人对脱胶丝丝胶残留量、溴化锂浓度、溴化锂溶丝浴比、BDDE添加量、反应温度和反应时间进行了正交测试。
脱胶丝丝胶残留量：100％(脱胶率30％)、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、0％。
反应时溴化锂浓度：1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9.3M、9.5M、9.8M
溴化锂溶丝浴比：0.5mg/mL、1mg/mL、4mg/mL、7mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL。
蚕丝蛋白与BDDE比例：1g：0.2μL、1g：0.5μL、1g：0.75μL、1g：1μL、1g：2μL、1g：5μL、1g：10μL、1g：20μL、1g：50μL、1g：100μL、1g：120μL、1g：150μL、1g：300μL、1g：500μL、1g：750μL、1g：1000μL。
反应温度：-20℃、0℃、4℃、25℃、37℃、60℃、80℃。
反应时间：1分钟、3分钟、5分钟、7分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、1小时、1.5小时、3小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时。
(1)固定反应体系溴化锂浓度、丝素与BDDE比例、反应温度和反应时间的情况下，变化蚕丝蛋白浓度，发明人员列举了将2.5、2、1.5、1、0.75g脱胶蚕丝溶于10mL 9.3M溴化锂中(250mg/mL、200mg/mL、150mg/mL、75mg/mL)，置于60℃烘箱中孵育1小时，向反应体系中加入500μL BDDE，置于60℃烘箱中反应3小时，观察反应体系中是否有块状凝胶形成，收集块状凝胶，水洗、冻干称重，计算交联效率。
交联效率＝W2/W1*100％
其中，W2为交联蚕丝蛋白，W1为交联前加入到反应体系中的蚕丝蛋白。从图2中可以得出蚕丝蛋白反应浓度为250mg/mL时，回收率最高，达到了77.3±5.9％；反应浓度为200-100mg/mL时，回收率差异不大在56.11±2.45-67.17±4.72％；而反应浓度为75mg/mL时，回收率较低，约30％。蚕丝蛋白浓度在100-250mg/mL压缩模量的范围为19±1Kpa-122±3Kpa，蚕丝蛋白浓度为200mg/mL时，压缩模量最大，达到122±3Kpa。从凝胶照片可以看出，BDDE交联蚕丝蛋白无色透明，与物理交联蚕丝蛋白白色有明显不同。随后，发明人员对BDDE交联水凝胶透光性进行了研究。研究发现反应浓度为250mg/mL时透光性较差，这是由于凝胶中残存部分未完全溶解脱胶丝导致的，这对水凝胶有透光性要求的眼科应用中存在一定的影响。反应浓度为200mg/mL及其以下时透光非常好。综合反应回收率和水凝胶透光性，反应浓度为200mg/mL为最佳反应浓度。在1-300mg/mL范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶。在10-250mg/mL范围内，蚕丝蛋白水凝胶更加优异。
对BDDE交联水凝胶微观形貌进行了研究。将上述冻干后的水凝胶喷金，SEM观察，如图3所示，研究发现，水凝胶孔径随蚕丝蛋白浓度降低而增大；尺寸大于100μm的孔比例也随蚕丝蛋白浓度降低而提高，从32％提高到83％；当蚕丝蛋白浓度为10和7.5mg/mL，水凝胶内部平均孔径达200μm。本发明所得蚕丝蛋白水凝胶孔径结构较已报道等浓度蚕丝蛋白制备的水凝胶大，这对该水凝胶在组织再生材料领域的研究和应用是非常重要的。
(2)固定反应体系溴化锂浓度、蚕丝蛋白浓度、反应温度和反应时间的情况下，变化蚕丝与BDDE比例，研究人员列举了将分别将2g脱胶蚕丝溶于10mL 9.3M溴化锂中，置于60℃烘箱中孵育1小时，向反应体系中加入65、125、250、400、500、700、1000μL BDDE，使蚕丝蛋白：BDDE比为1g：32.5μL、1g：62.5μL、1g：125μL、1g：200μL、1g：250μL、1g：350μL、1g：1000μL。置于60℃烘箱中反应3小时，观察反应体系中是否有块状凝胶形成，收集块状凝胶，水洗、冻干称重，计算交联回收率。
回收率＝W2/W1*100％
其中，W2为交联透明质酸，W1为交联前加入到反应体系中的透明质酸。从图4中可以得出回收率从随BDDE的添加量增大，先升高后下降。当BDDE添加量从蚕丝蛋白：BDDE从1g：32.5μL升高到1g：1000μL时，回收率从30％升高到67±7％。进一步增加交联剂BDDE，回收率不再提高，反而随BDDE添加量增大而降低。水凝胶压缩模量与回收率变化趋势相同，压缩模量的范围：4±0.3Kpa～109±5Kpa，当Silk:BDDE＝1g：200μL(W/W)时，压缩模量最大，达到109±5Kpa。随后，发明人员对BDDE交联水凝胶透光性进行了研究。研究发现蚕丝蛋白水凝胶透光性随BDDE添加量提高而提高，当比例为1g：200μL时透光性最好。综合反应回收率和水凝胶透光性，发明人认为当BDDE添加量从蚕丝蛋白：BDDE从1g：32.5μL升高到1g：200μL时，蚕丝蛋白交联效率随BDDE添加量提高而提高。BDDE添加量低于1g：200μL时，部分未交联蚕丝蛋白被包裹在化学交联水凝胶内形成了物理交联水凝胶，降低了水凝胶的透光性。而当BDDE添加量进一步提高，蚕丝蛋白交联效率降低。当蚕丝蛋白反应浓度为200mg/mL时，BDDE添加量为蚕丝蛋白：BDDE 1g：200μL是最佳反应条件。在1g：0.5μL-1000μL范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶。在1g：0.5μL-500μL范围内，蚕丝蛋白水凝胶性能更加优异。
对BDDE交联水凝胶微观形貌进行了研究。将上述冻干后的水凝胶喷金，SEM观察，如图5所示，研究发现，水凝胶孔径随BDDE添加量增大先减小后增大，当比例为1g：200μL时，孔最小。相同条件下蚕丝蛋白浓度越高，所得材料孔径越小，结合上述回收率结果，进一步证明了当比例为1g：200μL时蚕丝蛋白交联效率最高，水凝胶密度最大。在1g：0.5μL-500μL范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶。在1g：0.5μL-500μL范围内，蚕丝蛋白水凝胶性能更加优异。
(3)固定反应体系溴化锂浓度、蚕丝蛋白浓度、反应温度和蚕丝与BDDE比例的情况下，变化反应时间，研究人员列举了将分别量取4份10mL 9.3M溴化锂于50mL离心管中，分别加入2g脱胶丝，充分浸润后，置于60℃下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为200mg/mL的溴化锂溶丝液。再分别加入400μL的BDDE，混合均匀，于60℃烘箱中分别静置1、3、6、24h反应。观察各组成凝胶状态及透析后测定产率、压缩模量。
研究发现，当交联时间在1、3、6、24h时，各组水凝胶无多大差异，均无色透明且有一定成型性。随着交联时间的增加，水凝胶产率变化不大。当溶丝时间为0.25h时，水凝胶的产率为67.78±8.76％，当溶丝时间为3h时，水凝胶的产率为70.77±9.82％，当溶丝时间为6h时，水凝胶的产率为68.99±3.24％，当溶丝时间为24h时，水凝胶的产率为65.99±5.57％。不同交联时间的水凝胶压缩模量也无明显差异。当交联时间为1h时，水凝胶的压缩模量为102.30±2.17kPa，当交联时间为3h时，水凝胶的压缩模量为108.98±5.16kPa，当交联时间为6h时，水凝胶的压缩模量为99.79±3.66kPa，当交联时间为24h时，水凝胶的压缩模量为104.37±5.27kPa。综合产率、压缩模量测试结果可知，随着交联时间的延长，凝胶的产率和压缩模量均差距不大，交联时间为1h时已完成交联，但交联时间为3h时的产率与压缩模量最大。在3分钟24小时范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶。在3分钟-12小时范围内，蚕丝蛋白水凝胶性能更加优异。
(4)固定反应时间、蚕丝蛋白浓度、反应温度和丝素与BDDE比例的情况下，变化反应体系溴化锂浓度，研究人员列举了将分别量取50mL 9.3M溴化锂于100mL烧杯中，加入12.5g脱胶丝，充分浸润后，置于60℃下溶解，溶解时间为1.5h，得到浓度为25wt％的溴化锂溶丝液。分别吸取6、7、8、9、10mL溶丝液于50mL离心管中，再分别加入4、3、2、1、0mL的纯水，混合均匀，得到5份浓度为15wt％的溴化锂溶丝液，溴化锂浓度分别稀释至：5.58、6.51、7.44、8.37、9.3M。再分别加入400μL的BDDE进行反应，混合均匀，置于60℃烘箱中，静置3h成胶。本发明采用250mg/mL溶丝液作为蚕丝蛋白母液，采用蚕丝蛋白浓度150mg/mL作为反应浓度可以更大范围研究溴化锂浓度对化学交联效率的影响，改变溴化锂溶丝液中溴化锂溶液浓度，制备不同溴化锂溶液浓度下的蚕丝蛋白水凝胶，观察各组成凝胶状态及透析后测定产率、压缩模量。
研究发现，水凝胶均为无色透明，当溴化锂浓度为9.3、8.37、7.44、6.51、5.58M时，水凝胶均有一定的成型性。水凝胶产率随溴化锂浓度的降低而降低。当溴化锂浓度为9.3M时，产率为65.44±8.01％，当溴化锂浓度为8.37M时，产率为52.31±3.53％，当溴化锂浓度为7.44M时，产率为48.11±4.21％，当溴化锂浓度为6.51M时，产率为31.22±5.14％，当溴化锂浓度为5.58M时，产率为20.34±2.4％。溴化锂浓度为9.3M时，产率最高。不同溴化锂浓度水凝胶的压缩模量与产率的变化趋势一致，随溴化锂浓度的降低而降低。当溴化锂浓度为9.3M时，压缩模量为42.92±1.26kPa，当溴化锂浓度为8.37M时，压缩模量为14.63±0.97kPa，当溴化锂浓度为7.44M时，压缩模量为11.39±0.70kPa，当溴化锂浓度为6.51M时，压缩模量为8.98±0.57kPa，当溴化锂浓度为5.58M时，压缩模量为6.71±0.43kPa。当溴化锂浓度为9.3M时，凝胶的压缩模量最大。综合产率、压缩模量测试结果可知，当溴化锂浓度为9.3M时，水凝胶形态最好，且压缩模量与产率最高。在1-10M范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶。在2-9.8M范围内，蚕丝蛋白水凝胶性能更加优异。
发明人按照实施例2实验方案，发明人对脱胶丝丝胶残留量、反应体系溴化锂浓度、蚕丝蛋白总质量分数、蚕丝蛋白总质量与交联剂体积比、反应温度和反应时间进行了研究，研究发现丝胶残留量小于等于30％，反应体系溴化锂浓度≥1M，蚕丝蛋白总质量分数1mg/mL～300mg/mL。蚕丝蛋白总质量与交联剂体积比为1g：5μL～1mL。反应温度为25～80℃，反应时间3分钟～24小时。均可以制得本发明的水凝胶，超出这个范围无法形成凝胶或者水凝胶的性质有所下降。
实施例3：
将蚕丝蛋白化学交联水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)置于9.3M溴化锂溶液中，以超声诱导物理交联水凝胶为对照。在0.5、1、2、4、18、24小时和2、3和10天，观察凝胶块完整性。如图6所示，从图中可以得出超声诱导物理交联水凝胶随时间延长逐渐变小，4小时后完全被溶解，这是由于溴化锂溶丝机理是破坏蚕丝蛋白材料中的β-折叠(氢键)，而超声诱导物理交联结构稳定主要靠β-折叠(氢键)；而BDDE化学交联蚕丝蛋白缺不受氢键影响因此可以在溴化锂中保持稳定。其结构稳定性决定于化学交联位点的密度和分布，而非分子链上疏水β-折叠区的物理作用，因此可抵抗常规蚕丝蛋白溶解试剂对材料结构的破坏及诱导。组合物基质在常规溶解脱胶丝的溶液中具有非常高的稳定性，在9.3M溴化锂中60℃孵育72小时，质量损失率不超过10％。
实施例4：
将实施例2备的蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)，置于80％甲醇、80％乙醇和PBS中，室温条件下孵育，一定时间取出、水洗、冻干。以京尼平和HRP水凝胶作为化学交联蚕丝蛋白水凝胶对照，超声诱导蚕丝蛋白作为物理交联水凝胶对照。液氮冷冻条件下，使用研钵研磨，采用溴化钾压片法，在Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪(FTIR，美国，Nicolet)上用FTIR红外光谱测试二级结构，测试波长范围为400～4000cm-1，再用peakfit软件将曲线上酰胺I(1595～1705cm-1)区域分峰拟合得到β-折叠，α-螺旋，无规卷曲和β-转角的含量，结果：
从表中可以得出，本发明化学交联蚕丝蛋白二级结构中β-折叠含量明显低于超声诱导蚕丝蛋白(传统物理交联蚕丝蛋白凝胶)，其二级结构稳定性无论在甲醇、乙醇等常规物理交联蚕丝蛋白凝胶诱导下，还是PBS长时间浸泡条件下都优于HRP凝胶。蚕丝蛋白水凝胶的丝素蛋白二级结构中的β-折叠含量≤32％，可以是红外光谱等方法来测定。在37℃PBS中孵育30天，丝素蛋白二级结构中β-折叠含量≤40％。同时发明人对样品孵育前后压缩模型(60％压缩)进行了研究，发现本发明所公布的水凝胶在乙醇中孵育压缩模量有100kPa升高到218kPa，PBS中孵育变化为110kPa，增高≤1倍。
实施例5：
将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)，用打孔器将凝胶剪裁出直径为10mm，高度为8mm的圆柱体，通过质构仪(TMS-PRO，美国)进行评估。加载速度为30mm/min，压缩型变量为20％。当凝胶被压缩到原始高度的80％时停止压缩然后释放压力，当压力传感器回复到起始位置时再次压缩，重复进行压缩释放100个循环。研究发现，水凝胶具有良好的弹性，当形变量为60％时，Silk/BDDE水凝胶未出现任何破裂，且15次的压缩曲线几乎重叠到一起，说明Silk/BDDE水凝胶在60％的范围内具有很好的回弹性。随着压缩次数的增多，水凝胶压缩模量呈现小幅度的增大，重复压缩15次后，压缩模量的增长幅度仅为7％，高度回复超95％；当形变量为20％时，100次压缩循环，压缩模量的增长幅度小于20％，高度回复超80％。这是因为反复的压缩使水凝胶的内部孔隙缩小，从而改变水凝胶的压缩模量，但这并不影响Silk/BDDE水凝胶良好的回弹性。
实施例6：
将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶冻干(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)。先将2mL的空离心管称重记为W0，分别称取50mg的冻干样品悬浮在10mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)和5units/mL的蛋白酶溶液(10mmol/L，pH 7.4)中，再将悬浮液封装在离心管中(1mL/每个离心管，样品记重为W1)，每组4个平行样，密封好后置于37℃烘箱里的摇床上振荡。每隔1天更换新的降解液，在规定时间内(1、3、5、9、17、30天)取出样品，离心并用去离子水洗涤三次后将其置于60℃烘干至恒重，用精细天平称重记为W2。样品的重量残留率用公式计算得出。
重量残留率(％)＝(W2-W1)/W1*100
以超声诱导物理交联水凝胶和HRP酶促化学交联水凝胶为对照。如图7所示，从图中可以得出，BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶抗酶解性能优于酶促化学交联和超声诱导物理交联水凝胶，酶促降解17天和30天，BDDE交联蚕丝蛋白水凝胶抗酶解性能与酶促化学交联和超声诱导物理交联水凝胶有显著性差异。而酶促化学交联抗酶解性能优于超声诱导物理交联水凝胶但没有有显著性差异。这将对以医美填充方向的研究和应用具有非常重要的意义，将有效提高有效填充时间。
实施例7：
将加入交联剂的溴化锂溶丝液与超声后未成凝胶的蚕丝蛋白溶液(实施例2中反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)注入24孔板中，每孔200μL，每组6个平行样。交联后用透析液将Silk/BDDE水凝胶洗净，超净台风干2h，辐照灭菌，辐照剂量25kGy。
将SD大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)培养传代至第三代，用胰酶将细胞消化下来，并吹打成悬液，按1×104cells/mL接种到24孔板中，每孔加1mL，置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，对照组记为TCP。在第1、3、5、7、10天，将24孔板的培养基移除，添加1mL新鲜的含10％AlamarBlue的DMEM，放入培养箱中孵育2.5h后移取70μL培养液至黑色96孔板，每组6个平行样，用酶标仪检测在激发波长560nm，发射波长590nm下的荧光值。
活细胞染色(钙黄绿素)：细胞在24孔板的样品中分别培养5天和7天后，将孔板内的培养基吸出，弃掉，再分别对样品进行活细胞染色。将0.5μL的钙黄绿素(622.55Da，Gibco，美国)与1mL培养基混合均匀，作为染色液，然后向样品加入1mL染色液，全程避光操作，放入37℃的细胞培养箱中孵育35min后，弃去染液，再用10mmol的无菌PBS溶液清洗两次，弃去PBS，置于倒置荧光显微镜下观察细胞的生长形态。
以超声诱导物理交联水凝胶为对照。如图8所示，从图中可以得出，RMSCs在BDDE交联水凝胶和超声诱导物理交联水凝胶及TCP表面不断增值，细胞在BDDE交联水凝胶表面增值速率高于超声诱导物理交联水凝胶，在第3天和第5天时具有显著性差异。
发明人员进一步对BDDE交联水凝胶表面亲疏水性质进行了研究。如图9所示，研究发现BDDE交联水凝胶表面静态接触角为48.2±7.6°，低于超声诱导物理交联水凝胶(69.9±3.3°)。而材料表面亲水性利于细胞粘附和增值已被广泛报道，说明BDDE交联水凝胶不仅仅具有良好的生物安全性，较物理交联水凝胶，还能促进细胞增殖，这对该水凝胶在生物医用材料领域的应用是十分重要的。
实施例8：
选取体重60～150g的SPF级SD大鼠进行皮下包埋，共计9只。事先将样品(将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL))进行辐照灭菌，样品大小为0.5×0.5cm。皮下包埋前用和大鼠体重对应剂量的水合氯醛将大鼠麻醉，再将大鼠背上毛剃光。在大鼠背部的上皮剪开1.5～1.8cm的缺口，将样品放入皮下后缝合。缝合完毕后，涂抹碘伏消毒杀菌，再将大鼠放回鼠笼内继续饲养。在指定时间间隔中(3、7、28天)取出3只大鼠，注射过量水合氯醛处死大鼠并取出背部样品，将样品在福尔马林中固定，对样品进行组织学分析。
H&E染色：将样品切片先放入二甲苯内浸泡20min后，弃去二甲苯，再放入新的二甲苯内浸泡20min，弃去二甲苯。然后用无水乙醇浸泡5min，弃去无水乙醇，再放入新的无水乙醇中浸泡5min，弃去无水乙醇。再用75％乙醇浸泡5min，纯水洗净。用苏木素染液将切片染3～5min后用纯水洗净，再放入分化液，纯水洗净后放入返蓝液，纯水冲洗。用85％、95％的酒精再各将切片脱水5min，在伊红染液中染色，时间为5min。再将切片放入无水乙醇中浸泡5min，弃去无水乙醇，反复三次后，将样品切片先放入二甲苯内浸泡5min后，弃去二甲苯，再放入新的二甲苯内浸泡5min，弃去二甲苯。用中性树胶封片。在倒置荧光显微镜(Axio VertA1，德国)下观察并采集图像。
Masson染色：将样品切片先放入二甲苯内浸泡20min后，弃去二甲苯，再放入新的二甲苯内浸泡20min，弃去二甲苯。然后用无水乙醇浸泡5min，弃去无水乙醇，再放入新的无水乙醇中浸泡5min，弃去无水乙醇。再用75％乙醇浸泡5min，纯水洗净。用Masson A液浸泡切片，过夜后用纯水洗净。将Masson B液及Masson C液等比例混合均匀，把切片放入混合的染液中浸泡1min，纯水洗净。用无水乙醇将1mL盐酸定容至100mL，将切片丢入，分化后用纯水洗净。用Masson D液浸泡切片，6min后用纯水洗净，接着用Masson E液浸泡切片，1min后沥干放入Masson F液浸泡2～30s。拿出后，用1％冰醋酸洗净，然后放入无水乙醇中脱水。脱水结束后放入新的无水乙醇中浸泡5min，弃去无水乙醇，放入二甲苯内浸泡5min，拿出用中性树胶封片。在倒置荧光显微镜(Axio Vert A1，德国)下观察并采集图像，通过Image J软件分析胶原沉积情况。
免疫荧光染色：将样品切片先放入二甲苯内浸泡15min后，弃去二甲苯，再放入新的二甲苯内浸泡15min，弃去二甲苯。然后用无水乙醇浸泡5min，弃去无水乙醇，再放入新的无水乙醇中浸泡5min，弃去无水乙醇。再用75％乙醇浸泡5min，纯水洗净。用EDTA抗原修复缓冲液(PH＝8.0)将组织切片浸透，放入修复盒中于微波炉内进行抗原修复。先中火加热至沸腾，停止加热，再中低火缓慢加热7min。拿出，室温冷却后用PBS浸泡载玻片，放在脱色摇床上洗涤5min，重复三次。将切片拿出，稍干后在组织周围用组化笔画圈，然后甩干载玻片上的PBS，滴加浓度为3％BSA，封闭30min。拿出切片后，轻轻甩掉载玻片上的液体，滴加一抗，放入有少量水的湿盒中4℃孵育过夜。接着用PBS浸泡载玻片，放在脱色摇床上洗涤5min，重复三次后拿出，待切片稍干在圈内滴加二抗覆盖组织，避光等待50min。再用PBS浸泡载玻片，放在脱色摇床上洗涤5min，重复三次后拿出，待切片稍干后DAPI染液滴加在圈内，室温下避光等待10min。继续用PBS浸泡载玻片，放在脱色摇床上洗涤5min，重复三次后拿出，将自发荧光淬灭剂滴入圈内，5min后用纯水冲洗10min。待切片稍甩干，滴加抗荧光淬灭封片剂进行封片。在激光共聚焦下观察并采集图像，(DAPI紫外激发波长330～380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465～495nm，发射波长515～555nm，发绿光；CY 3激发波长510～560，发射波长590nm，发红光)通过Image J软件分析。
以超声诱导物理交联水凝胶为对照。如图10所示，从图中可以得出BDDE交联水凝胶与周围组织之间界面清晰，几乎无包膜形成。而超声诱导物理交联水凝胶破碎成小块，加速了周围细胞迁移，7天是形成约200μm的薄膜，28天是细胞几乎迁移到凝胶块间隙。
实施例9：
A将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)放入组织研磨器中研磨，研磨完成后倒出。
B按照实施例2筛选的凝胶交联反应条件蛋白浓度200mg/mL、丝素与BDDE比例为1g：200μL、反应体系溴化锂浓度9.3M来配置蚕丝蛋白溶丝液与BDDE混合液，并将该混合液作为水相立即滴加到已经60度预热的且处于运动状态油相中。
(1)固定油相运动转速为500rpm，改变油水比1∶1、2：1、5：1、10:1、100:1、500:1，油相与水相混合均匀后，置于60℃烘箱中反应3小时，观察反应体系中是否有球状凝胶形成。结果如下表：
| 油水比 | 凝胶形态 |
| 1:1 | 块状凝胶 |
| 2:1 | 块状凝胶 |
| 5:1 | 球状凝胶 |
| 10:1 | 球状凝胶 |
| 100:1 | 球状凝胶 |
| 500:1 | 球状凝胶 |
由表中结果可知，当油水比例为1:1和2:1时，由于水相体积过大，在运动的油相中形成的圆润凝胶球之间的间距过小，球与球之间极易发生聚集，未完全交联的凝胶球聚集体逐渐交联便形成块状凝胶，而非交联凝胶球。而油水比为5:1、10:1、100:1、500:1时均可形成凝胶球，考虑到造粒效率，发明人认为油水比为10:1为最佳反应条件。
(2)固定油相与水相的比例为10:1，变化油相运动转速：50rpm搅拌、100rpm搅拌、500rpm搅拌、1000rpm搅拌、5000rpm匀浆、10000rpm匀浆，油相与水相混合均匀后，置于60℃烘箱中反应3小时，观察反应体系中是否有凝胶球形成，结果如下表：
| 转速 | 凝胶形态 |
| 50 rpm | 块状凝胶 |
| 100 rpm | 球状凝胶 |
| 1000 rpm | 球状凝胶 |
| 5000 rpm | 球状凝胶 |
| 10000 rpm | 球状凝胶 |
由表中结果可知，当转速为50rpm时，由于油相运动较慢，油相中的凝胶球运动幅度及频率过小，球与球之间极易发生碰撞并聚集，未完全交联的凝胶球聚集体逐渐交联便形成块状凝胶，而非交联凝胶球。而当油相转速为100rpm、500rpm、1000rpm、5000rpm、10000rpm时，均可形成凝胶球。
将上述凝胶球从油相中过滤出来，先用有机溶剂洗去表明的油，再用水洗、将收集到的凝胶球用不同目数的筛网过滤，分别收集300μm以上、100-300μm、100微米以下的凝胶球，并冻干称重，计算产率。
凝胶球产率＝W2/W1*100％
W1为不同目数之间的凝胶球冻干后的重量总和，W2为不同目数之间的凝胶球冻干后重量。结果如下表：
| 300μm以上 | 100-300μm | 100μm以下 | |
| 100rpm搅拌 | 79.12％±2.42％ | 18.95％±0.78％ | 2.11％±0.87％ |
| 1000rpm搅拌 | 39.34％±3.25％ | 52.41％±2.21％ | 8.22％±5.10％ |
| 5000rpm匀浆 | 0 | 8.82±2.31％ | 92.21％±2.06％ |
| 10000rpm匀浆 | 0 | 3.31±1.35％ | 98.11％±1.12％ |
由表中数据可知，100rpm搅拌条件下产生的凝胶球粒径大多分布在300μm以上，为79.12％±2.42％，100-300μm及100μm以下的均较少；1000rpm搅拌条件下产生的凝胶球在100-300μm之间的产率最高，为52.41％±2.21％，其次是300μm以上，为39.34％±3.25％，100μm以下最少；而5000rpm、10000rpm匀浆条件下产生的凝胶球粒径则大多分布在100μm以下，分别为92.21％±2.06％和98.11％±1.12％。在100-10000rpm范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶微球。在油水比大于1：1范围内，均能得到较为理想的蚕丝蛋白水凝胶微球。在油水比大于2：1-500：1范围内，蚕丝蛋白水凝胶微球性能更加优异。
实施例10：
将实施例9方法制备的A凝胶颗粒和B凝胶球用不同目数的筛网过滤，分别收集300μm以上、100-300μm、100μm以下的凝胶球，并用滤纸尽可能吸去凝胶球表面水分，用烘干称重法测定凝胶球中的蚕丝蛋白含量。将凝胶球装入1毫升注射器中，通过27G针头以4mL/min的速度推注，并使用推拉力计记录推注过程中的注射力峰值及平均值，如无法注射出则无注射力数值记录。结果如下表：
| 300μm以上 | 100-300μm | 100μm以下 | |
| 注射力峰值(N) | / | / | 18.23±3.44 |
| 注射力平均值(N) | / | / | 15.34±3.21 |
由表可知，粒径300μm以上及100-300μm的凝胶球无法通过27G针头直接注射出来，而100微米以下的凝胶球可以通过27G针头注射出来，但注射力峰值及平均值均大于10N。
向100-300μm的凝胶球中加入少量的润滑剂，如透明质酸钠、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素等，得到化学交联蚕丝蛋白凝胶球组合物，其宏观及微观形貌如图11所示。该组合物中凝胶球占组合物总体积分数(v/v)、丝素蛋白占总质量分数(wt/v)以及注射力峰值及平均值如下表所示：
中国专利CN 102836465 B将蚕丝蛋白室温放置成胶后通过机械破碎的方法制得微粒，再将蚕丝蛋白微粒加入透明质酸溶液中，加入交联剂交联，得到可注射蚕丝蛋白透明质酸复合凝胶，这种复合凝胶中蚕丝蛋白与透明质酸的质量比最大为1：10，即蚕丝蛋白含量不超过10％，蚕丝蛋白室温自然放置形成凝胶是蚕丝蛋白中β-折叠结构的形成，属于物理交联，物理交联的蚕丝蛋白凝胶质硬，弹性差，在受到推挤时几乎没有空间压缩，难以产生滑动，要注射出来需使用大量的粘性介质来带动。而BDDE交联的蚕丝蛋白凝胶弹性佳，有一定的润滑性，在受到推挤时仅依靠其表面的润滑和其自身良好的弹性即可通过细针头注射出来。
实施例11：
将实施例10方法制得的蚕丝蛋白化学交联凝胶球组合物(凝胶球占组合物总体积90％，丝素蛋白占组合物总质量10％，粒径范围100-300μm，添加1％(w/v)透明质酸作为润滑剂)通过27G针头注射到大鼠背部皮下组织，每个点注射量为1毫升在第7、28、42、56天，将大鼠处死，取出样品及其周围组织，福尔马林固定、石蜡固定、切片，H&E染色(图12)、MASSON染色(图13)，显微镜观察。从图中可以得出蚕丝蛋白可注射凝胶球与周围组织之间界面清晰，几乎无包膜形成，即蚕丝蛋白凝胶球在大鼠皮下8周后几乎没有炎症反应现象。
实施例12：
关节内滑液减少、成分改变等会导致膝关节内环境发生改变，加剧关节软骨面的磨损。关节疼痛时，向关节内注射高弹性蚕丝蛋白凝胶球，可以使关节内环境发生改变，使病理状况下的滑液恢复至正常状态，达到润滑膝关节的目的。
将实施例10方法制得的化学交联蚕丝蛋白凝胶球组合物(凝胶球占总体积90％、占总质量10％，粒径范围100-300μm，添加1％透明质酸作为润滑剂)进行大鼠关节腔注射。SD大鼠(250g/只)24只，随机分为模型组和治疗组，每组各12只。所有大鼠通过ACLT模型构建方法建立骨关节炎模型(单侧造模)。造模后第3周开始，各组分别干预，模型组(生理盐水)、治疗组(化学交联蚕丝蛋白凝胶球)，注射量50μL。造模后采用了电子压痛仪测量大鼠膝关节电子压痛阈值的方法，来反映骨关节炎致疼痛症状，即将大鼠左右脚按在测试台上，大鼠挣扎时则压痛仪自动感应停止并计数，压痛阈值越低表明病情越严重。造模完成后每周测量一次，统计并比较差异。
测试结果如图14所示，结果分析可得，造模完成一周和两周时，模型组大鼠和治疗组大鼠造模侧压痛阈值不存在显著性差异，于造模后的第二周给药一次，第三周和第四周时模型组大鼠的压痛阈值以明显低于治疗组，且第四周模型组大鼠和治疗组大鼠压痛阈值存在显著性差异。这说明注射蚕丝蛋白凝胶球后对大鼠关节炎疼痛有改善作用。第四周测试压痛阈值后进行第二次给药，到第五周和第六周时，治疗组大鼠的压痛阈值仍高于模型组大鼠的压痛阈值，且第六周模型组大鼠和治疗组大鼠压痛阈值存在显著性差异。这可能是因为注射的高弹性蚕丝蛋白凝胶球对关节有一定的润滑作用，提高了关节液的粘度和弹性。
实施例13：
干眼是泪液和眼球表面的多因素疾病，能引起不适、视觉障碍和泪膜不稳定，正常机体眼表面的上皮细胞形状为杯状，它发挥的作用是分泌足够的粘蛋白，维持眼表面的湿润性，而干眼症患者的眼表上皮细胞则不能发挥这类作用。为了减少疼痛，使用高弹性蚕丝蛋白凝胶球滴眼液，可以润滑眼角膜表面，缓解眼部不适。
将实施例9方法制得的化学交联蚕丝蛋白凝胶球(凝胶球占总体积90％、占总质量10％，粒径范围50-100μm)，进行干眼症模型兔术后治疗。健康新西兰大白兔12只，雌雄各半，既往无任何病史，体重2.0-2.5kg，实验前检查无眼部疾病及异常并预先喂养7天，动物固定后经耳缘静脉进行全身麻醉，另用盐酸丙美卡因滴眼液(滴眼，3滴)进行眼部局麻。此后将动物置于试验台，右眼不进行任何操作，摘除左眼泪腺、哈氏腺及第三眼睑，建立泪液生成不足型兔干眼模型。术后14天将动物随机分成2组：蚕丝蛋白组、对照组，每组6只。对照组不做任何治疗，蚕丝蛋白组每日使用蚕丝蛋白凝胶球滴眼液点眼3次，每次2滴。给药28天。分别在给药前、给药后7天、14天、21天、28天进行Schirmer I试验，以评价泪液分泌量。Schirmer I试验在中等湿度和亮度的室内环境进行，取一条5X35mm滤纸，置于下结膜囊中外1/3交界处，5min后取出纸条，根据刻度读取滤纸湿润部分试纸长度并记录。取连续测量3次的平均值为Schirmer I试验结果。正常情况下滤纸湿润长度大于10mm/5min。
如下表所示，给药前对照组与蚕丝蛋白组泪液分泌量无差异，给药7天，蚕丝蛋白组泪液分泌量较对照组有所提高(P＜0.05)，给药14天，蚕丝蛋白组较对照组显著升高(P＜0.01)，且给药后21天、28天，泪液分泌量均与对照组存在显著性差异，这表明蚕丝蛋白凝胶球滴眼液对干眼症有改善效果。
给药前及给药后不同时间动物泪液分泌量的变化(Mean±SD,n＝6)
注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例14：
老年性黄斑变性(ange-related macular degeneration,AMD)是一种以中央视力丧失为特征的眼部疾病，是导致视力严重下降和不可逆丧失的主要原因。目前，抗VEGF药物已成为AMD的标准治疗方法。用蚕丝蛋白凝胶作为注射剂型载体，用于抗VEGF药物(如贝伐单抗)的持续传递，使抗VEGF药物(如贝伐单抗)的每日释放率维持在治疗范围内，降低给药频次，提高患者舒适度。
将实施例10方法制得的化学交联蚕丝蛋白凝胶球组合物(凝胶球占总体积90％、占总质量10％，粒径范围50-100μm)置于60度鼓风干燥箱干燥过夜，将干燥的蚕丝蛋白凝胶球放入贝伐单抗溶液中溶胀，待蚕丝蛋白凝胶球体积不再增大后取出，纯水洗去表面的贝伐单抗，得到装载贝伐单抗的蚕丝蛋白凝胶球。
健康新西兰大白兔12只，雌雄不限，体重3.0-3.5kg，行眼部检查，确认无前后节疾病，随机分成两组，蚕丝蛋白组和对照组各6只。将实验动物用盐酸氯酮胺35mg/kg联合盐酸甲苯噻嗪5mg/kg肌肉注射麻醉后，固定于手术台上，结膜囊内滴入0.4％盐酸奥布卡因滴眼液一滴，0.9％生理盐水冲洗结膜囊3分钟，铺无菌巾，开睑器开眼睑，在手术显微镜下先用穿刺刀刺入角膜约2/3厚度，再将1ml注射器刺入前房，抽出房水约0.05ml，拔针后立即用消毒棉签按住穿刺口，再用另1只1ml注射器注入0.05ml装载贝伐单抗的蚕丝蛋白凝胶球(贝伐单抗1.25mg/ml)或0.05ml生理盐水。注射完后快速出针并用棉棒按压注射孔片刻，防止药物外流。注药后泰利必妥滴眼液日4次点眼。注药后一周内每日行裂隙灯显微镜检查，散瞳后直接检眼镜眼底检查，1周后改为每周一次裂隙灯显微镜检查和直接检眼镜眼底检查。前房注射装载贝伐单抗的蚕丝蛋白凝胶球后不同时间点的结果显示：裂隙灯和眼底镜检查均未观察到眼前节组织炎性反应，角膜水肿，晶状体浑浊，玻璃体混浊，视网膜水肿、出血、渗出等现象，这说明注射装载贝伐单抗的蚕丝蛋白凝胶球对兔眼前节组织在观察期内没有明显的毒副作用，为临床安全应用蚕丝蛋白凝胶球前房注射提供了可靠的证据。
实施例15：
取实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)，用高速粉碎机打散后均匀薄铺于浅口平底容器底部，置于60度鼓风干燥箱烘干，得到BDDE交联蚕丝蛋白膜。BDDE交联蚕丝蛋白膜透明度高，水浸润后柔软且有一定弹性，是理想的隐形眼镜材料。
实施例16：
骨组织作为人体最重要的组织器官之一，承担了许多重要的功能，骨组织可自行修复，但当出现较大损伤时，骨组织无法通过自身修复达到理想状态，医疗人员主要通过自体移植、异体移植以及骨组织工程手段进行骨修复。作为骨组织工程用骨修复生物材料需要具有良好的生物相容性，与骨组织生长相匹配的生物降解性，一定的骨诱导和传导性，一定的力学性能，具有三维立体、相互连通的多孔结构来支持种子细胞的粘附、生长和增殖等。蚕丝蛋白多孔支架具有三维立体结构，相互连通的多孔结构不仅可以提供细胞的粘附、生长和增殖，还可以给代谢物质的排出提供通道。
将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)冷冻干燥，得到BDDE交联蚕丝蛋白多孔支架。对照组为相同浓度的蚕丝蛋白水溶液冷冻干燥后甲醇熏蒸2小时得到的蚕丝蛋白多孔支架。采用液体置换方式对多孔支架进行孔隙率测试，将冷冻干燥后的蚕丝支架样品放入天平称其质量为W，然后将蚕丝多孔支架置于体积为V1的己烷中浸泡，记录己烷此刻的总溶液体积为V2，浸泡15min，随后取出样品并记录剩余己烷体积V3，多孔支架孔隙率计算公式如下：P(％)＝(V1-V3)/(V2-V3)*100％，式中P表示蚕丝多孔支架孔隙率。采用质构仪对蚕丝蛋白多孔支架进行力学性能测试，将蚕丝蛋白多孔支架裁剪成边长为10mm的正方体，水平头速度设为10mm/min，压缩位移为5mm，每种样品重复5次试验。
蚕丝蛋白多孔支架的孔隙率及力学性能测试数据如下表：
由表可知，与丝素水溶液直接冷冻干燥得到的支架材料相比，BDDE交联蚕丝蛋白支架有更高的孔隙率，作为人体组织工程支架材料，通常而言，更高的孔隙率能为细胞的生长提供更多的空间，因此在保持一定力学性能的前提下，往往追求更高的孔隙率。从表中还可以看出，化学交联蚕丝蛋白支架的压缩强度为77.28，压缩模量为311.98，而甲醇熏蒸的蚕丝蛋白支架分别仅为65.32和233.84，表明的BDDE交联蚕丝蛋白支架有着更高的力学性能。
实施例17：
对于骨折的治疗，经历了由坚强固定到生物学固定的过程，传统的钉板系统存在感染、应力遮挡、钉板移位以及主观疼痛或感觉异常等问题，随着可吸收高分子聚合物材料研究的进展，如聚乙酸、聚羟基乙酸、聚乙酸乙醇酸可吸收接骨板的螺丝钉的应用等均可降低二次手术的风险，并且可以逐渐把应力转移到愈合的骨头上从而促进骨再生。使用低弹性模量、生物相容性好的固定材料是骨折治疗理念的进步对骨内植入物提出的新要求。
将实施例2备的含蚕丝蛋白水凝胶(反应体系溴化锂浓度9.3M、蚕丝蛋白浓度200mg/mL、反应温度60℃和反应时间1.5小时，蚕丝蛋白与BDDE比例为1g：200μL)置于4度鼓风干燥箱中缓慢干燥，干燥后打磨加工成圆柱棒，得到BDDE交联蚕丝蛋白硬骨材料。
采用生物力学测试仪对BDDE交联蚕丝蛋白硬骨材料的生物力学性能进行测试，用于测试的蚕丝蛋白圆柱棒长度17.5cm，直径0.45cm，三点弯测试跨距为5mm。试样安装在夹具一端(力值传感器)后，力传感器回零，然后夹持试样另一端，按一定的预紧力紧固样品，选择电压控制模式拉试样，设定实验参数后运行试验并保存数据，测试结果如下表。
BDDE交联蚕丝蛋白硬骨材料生物力学性能
| 抗弯强度(MPa) | 弹性模量(GPa) | 皮质骨弹性模量(GPa) | 不锈钢弹性模量(GPa) |
| 68.4±4.5 | 9.5±1.2 | 约18 | 约200 |
由表可知，BDDE交联的蚕丝蛋白硬骨材料的抗弯强度为68.4MPa，弹性模量为9.5GPa，远低于不锈钢材料(约200GPa)，相比金属材料而言更接近骨的弹性模量(约18GPa)，更加符合现在骨科内固定的理念。
取健康家兔6只，每2只为一组，称量体重后按重量用3％戊巴比妥钠作耳缘静脉注射麻醉。常规备皮、消毒，在兔双侧股骨踝部位切开皮肤后拨开肌肉暴露股骨，电钻钻穿对侧骨皮质，螺丝丝攻攻入，拧入BDDE交联的蚕丝蛋白硬骨材料，缝合皮下，消毒。术后3天肌注庆大霉素(1万单位/KG)。在第1,2,3个月时各处死2只动物，取出股骨。动物处死方法：用20ml注射器从兔耳缘静脉中快速打入20ml空气使其形成空气栓塞。试验共在6只兔双侧下肢股骨内植入12枚硬骨材料，均成功植入，伤口愈合良好，后期观察除了有一只家兔左后腿跛行外，其余兔活动功能均良好。于第1,2,3个月取出标本后可见硬骨材料仍牢固固定在股骨干内，未发生脱出或移位等情况，材料与骨质接触表面良好，未见颜色改变等不良反应。这表明BDDE交联的蚕丝蛋白硬骨材料具有较好的可加工性能，可顺利植入提前钻孔攻丝的家兔股骨干内，且从前三个月标本可观察到其外观相对完整，硬度和韧度仍相对较高，可初步判断材料固定效果可持续3个月以上。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (20)
1.一种化学交联水凝胶，其特征在于，所述的化学交联水凝胶为蚕丝蛋白水凝胶，其中交联剂为二缩水甘油醚类交联剂，丝素蛋白占干重的比例≥70％。
2.根据权利要求1所述的化学交联水凝胶，其特征在于，所述的二缩水甘油醚类交联剂为二环氧甘油醚、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚及其衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、三(4-羟基苯基)甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种组合。
3.一种化学交联水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将蚕丝溶于溴化锂水溶液中，得到含有蚕丝蛋白的混合溶液；
S2、将二缩水甘油醚类交联剂添加到S1步骤中的所述混合溶液中，进行交联反应，得到所述化学交联水凝胶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述蚕丝中丝素蛋白占干重的比例≥70％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，添加二缩水甘油醚类交联剂后，溴化锂浓度为1-10M。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，添加二缩水甘油醚类交联剂后，蚕丝蛋白质量分数为1-300mg/mL。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，蚕丝蛋白质量与化学交联剂体积比为1g：0.5μL-1mL。
8.一种化学交联水凝胶微球，其特征在于，所述微球为蚕丝蛋白水凝胶微球，其中交联剂为二缩水甘油醚类交联剂。
9.根据权利要求8所述的化学交联水凝胶微球，其特征在于，所述化学交联水凝胶微球粒径为100-300μm。
10.一种化学交联水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01、将蚕丝溶于溴化锂水溶液中，得到含有蚕丝蛋白的混合溶液；
S02、将二缩水甘油醚类交联剂添加到S01步骤中的所述混合溶液中，混匀得到反应液；
S03、将步骤S02中的所述反应液加入油相体系中，在搅拌条件下进行交联反应，得到所述化学交联水凝胶微球。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S02中，所述反应液中溴化锂浓度为1-10M。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S02中，所述反应液中蚕丝蛋白质量分数为1-300mg/mL。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S02中，蚕丝蛋白质量与化学交联剂体积比为1g：0.5μL-1mL。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤S03中，所述油相体系与所述反应液体积比大于1:1，搅拌转速为100-15000rpm。
15.权利要求1所述的化学交联水凝胶和/或权利要求8所述的化学交联水凝胶微球在组织工程填充、修复和/或药物递送中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备用于关节炎治疗、医美整形或眼科疾病治疗的组合物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述组合物中化学交联水凝胶制得的凝胶颗粒和/或化学交联水凝胶微球的体积分数为50-100％，蚕丝蛋白的质量分数为5-20％。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括稳定剂、润滑剂和渗透压调节剂中的一种或多种。
19.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述的组合物中还包含生物活性剂、细胞外基质、细胞和药物中的一种或多种的组合。
20.权利要求1所述的化学交联水凝胶和/或权利要求8所述的化学交联水凝胶微球制备薄膜、支架或硬骨材料的应用。
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