CN107638590A - 一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料及其构建方法，属于组织工程材料领域。在通过连通管水平连通容器A和容器B中分别加入等体积的Cs/GP/Gel溶液、乙酸溶液，Cs/GP/Gel溶液连续流入支架模具，乙酸溶液连续流入容器B中；当两个容器中溶液均流入支架模具时，预冻处理后取出支架预产物，制备得到Cs/GP/Gel梯度复合支架；制备Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架时，当容器B中液体剩余1/4～1/5时，向容器B中加入Cs/GP/Gel/nHAp溶液，其它步骤与Cs/GP/Gel梯度复合支架相同。本发明制备得到的梯度复合支架的孔径呈现出明显的梯度渐进性，而且孔隙相互贯通，nHAp模拟的软骨钙化层与软骨层连接效果良好，适用于软骨组织工程领域。
Description
技术领域
本发明属于组织工程材料领域，特别涉及一种由壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、纳米羟基磷灰石复合构建组织工程梯度仿生软骨支架的方法。
背景技术
正常关节的骨软骨组织结构，主要由透明软骨、界面结构(软骨钙化层)和软骨下骨三部分组成，在结构上呈现出明显的梯度渐进性和复杂的生理学特性。关节软骨因在各种活动中使用量巨大，极易在创伤及急慢性炎症中导致损伤，且由于受力的突发性和复杂性，多现为软骨磨损、撕裂、断裂和粉碎性损伤等。关节假体置换为目前有效的治疗方法之一，但手术置换关节，不仅价格昂贵，且存在并发症危险。此外，关节软骨极脆弱且自身修复能力低下，软骨组织自身无血液供应，营养主要来自周围关节滑液的滋润，一旦出现病变或缺损，软骨下骨层常伴随发生硬化等退行病变，逐步恶化并导致运动功能障碍，严重影响生活质量。软骨组织工程作为一种新型、高效的软骨组织缺损的修复方法，近年来逐渐受到广泛关注。软骨组织工程修复策略的关键步骤之一，是制备出无毒、可降解、生物相容性好、具有软骨诱导性、具有可塑性、适宜机械强度、三维孔隙结构的组织工程生理分层支架材料。但几乎没有一种单一材料能够同时满足以上所有功能，因此有必要将不同种类、具有互补特性的材料按照一定比例和方式进行复合，协同发挥每一种材料的优点和功能，以构建适宜的软骨修复材料。
壳聚糖(Chitosan，Cs)是天然的高分子聚合物，由甲壳素经过脱乙酰化得到，结构与软骨基质糖氨多糖相似，降解产物为氨基葡萄糖单体，对人体无不良反应，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性和免疫原性，而且能够抗菌和抑制炎症，能够促进生物组织细胞的粘附、增殖、分化，是常见的软骨组织工程的支架材料。β-甘油磷酸钠(Sodiumβ-Glycerol Phosphate，GP)在医疗上广泛用于人静脉营养的磷补充剂和各种磷缺乏症状，用以满足人体每天对磷元素的需要。磷元素参与骨质的形成，以磷脂形式参与细胞膜的组成，同时磷与许多代谢中的酶活性有关，在能量代谢中的作用至关重要。明胶(Gelatin，Gel)是一种天然高分子材料，其结构与生物体组织结构相似，可以通过胶原部分水解得到，具有优良的生物相容性、生物活性和可降解性，普遍应用于临床医学、医药工业中，明胶基复合材料用作组织工程支架材料和信号分子载体是目前生物材料的研究热点之一。纳米羟基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite，nHAp)是天然骨的主要成分之一，具有良好的骨传导性和骨诱导性，研究发现nHAp能够诱导新骨的发生，并会随着新骨的发生和发育而被吸收利用，且nHAp中的钙离子能与壳聚糖的氨基发生螯合作用，羟基能与氨基产生氢键作用。因此Cs/nHAp体系是一种较理想的骨组织工程材料。专利CN106693065 A“一种梯度组织工程支架制作方法”，采用生物高分子材料PLGA和水凝胶，利用低温沉积3D打印机打印三种网格，形成分层结构和网格支架，获得具有接近正常软骨定向微观组织的复合梯度组织工程支架。专利CN105920679 A“一种具有三维梯度孔结构的皮肤支架材料的制备方法”，以壳聚糖为主要基材，以京尼平为交联剂，在专用成型模具中，通过形成垂直方向的温度梯度冷冻成型，制备了一种具有三维梯度孔结构的皮肤支架材料。专利CN106512099 A“壳聚糖基仿生骨组织工程支架及其制备方法”，以壳聚糖为骨架，骨架内均匀分散纳米针状羟基磷灰石，形成多孔结构的仿生骨组织工程支架。但将壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、纳米羟基磷灰石四种材料复合用于软骨组织工程仿生梯度修复支架材料则未见相关报道。
基于上述四种材料的优点和研究现状，本发明以壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、羟基磷灰石四种天然材料为原料，协同发挥每一种材料的优点与功能，采用冷冻干燥法制备梯度仿生复合支架材料，并将骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)接种于复合支架材料上构建细胞-支架复合物，对BMSCs在支架上的分布、黏附、细胞外基质分泌情况进行检测，以验证复合支架材料的生物相容性，为将来临床应用奠定科学基础。因此本发明构建一种生物相容性高的壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶/纳米羟基磷灰石梯度仿生复合支架材料，用于软骨组织修复领域具有十分重要的意义。
发明内容
单一或复合壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、纳米羟基磷灰石所制备的水凝胶在组织工程领域已得到充分的认可和广泛的研究，但是目前将这几种材料制作成软骨仿生梯度复合支架材料还未见报道。针对现有技术的不足，本发明提出了一种壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶/纳米羟基磷灰石梯度复合支架材料的构建方法，制备与软骨组织天然构造和性能更加吻合而且具有良好生物相容性和物化特性的软骨仿生梯度复合支架材料，以支持BMSCs的体外增殖和功能实现，是本发明的主要目的。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其中，壳聚糖基梯度复合支架材料包括Cs/GP/Gel梯度复合支架材料、Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料(区别在于nHAp作为软骨钙化层)，包括以下步骤：
(1)称取一定质量的壳聚糖Cs粉末，加入到浓度为0.1mol/L的乙酸溶液中，在40～60℃条件下，磁力搅拌2～4h使其均匀溶解，得到Cs乙酸溶液，Cs乙酸溶液中的壳聚糖浓度为2～3％w/v；将Cs乙酸溶液以1000rpm/min转速离心0.5～1h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。
(2)称取β-甘油磷酸钠GP粉末加入到去离子水中，室温下磁力搅拌30～60min使其均匀溶解，得到浓度为100～300％w/v的GP水溶液。
(3)称取明胶Gel颗粒加入到去离子水中，40～60℃下，磁力搅拌30～60min使其均匀溶解，得到浓度为5～8％w/v的Gel水溶液。
(4)室温下，将步骤(1)制备得到的Cs乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加步骤(2)制备的GP溶液，充分搅拌30～60min后制备成Cs/GP溶液A。滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败。所述的Cs乙酸溶液和GP水溶液的体积比为3:1～12:1。
(5)室温下，将步骤(3)制备的Gel水溶液加入到步骤(4)制备得到的Cs/GP溶液中，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。所述的Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1～3:1。
(6)室温下，取一部分步骤(5)制备的Cs/GP/Gel溶液，加入纳米羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散30～60min，至nHAp均匀地分散在溶液B中，得到Cs/GP/Gel/nHAp溶液。所述的Cs/GP/Gel/nHAp溶液中nHAp的含量为10～20％w/v。
(7)制备得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料，作为梯度仿生软骨。
7.1)将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。
7.2)将步骤(5)中制备的Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。当B瓶出口处的阀门打开时，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。这种操作使得开始时滴入模具中溶液的浓度较高，冷冻干燥形成的孔径较小；然后随着乙酸溶液的不断加入，滴入模具中溶液的浓度逐渐降低，冷冻干燥形成的孔径逐渐变大。
7.3)当容器A和容器B中溶液均流入到支架模具时，取出盛有样品的支架模具；
7.4)将盛有样品的支架模具在-20～-40℃条件下预冻20～30h后，转移至冷冻干燥机中冷冻干燥20～40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层；然后将其浸置于交联液中交联反应6～12h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤4～6h，置于无水甲醇中6～12h以将溶剂萃取干净；最后将材料于-20～-40℃条件下预冻成型，冷冻干燥机中继续干燥20～40h得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料。所述的冷冻干燥温度均为-40～-60℃。
(8)制备得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料，作为梯度仿生软骨(含软骨钙化层)。
重复步骤7.1)、7.2)；当容器B中液体剩余1/4～1/5时，关闭阀门；向容器B中加入步骤(6)制备的Cs/GP/Gel/nHAp溶液；打开阀门，待A、B瓶中的液体全部流入支架模具后，取出盛有样品的支架模具，采用步骤7.4)的方法制备得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料。
所述的交联液为碳化二亚胺EDC、羟基琥珀酰胺NHS、吗啉乙烷磺酸MES在40％乙醇溶液中的混合溶液。其中，三种组分EDC、NHS、MES的浓度均为50mmol/L。
所述的Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:(5～18):(1～4)。Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料孔径较均匀，孔道相互贯通，孔径大部分介于50～200μm之间，孔隙率89.10～91.71％，吸水率379.22～558.35％，弹性模量为8.07～9.69MPa，在溶菌酶溶液中第15天降解率达到63.21～78.41％。
所述的Cs/GP/Gel梯度复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:(5～18):(1～4)。Cs/GP/Gel梯度复合支架材料的孔径呈现明显的梯度渐进性，同时保留了物理共混支架材料良好的孔道结构，孔隙率92.19～95.20％，吸水率587.79～677.47％，弹性模量为6.81～8.12MPa，在溶菌酶溶液中第15天降解率达到92.28～97.53％；Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料中nHAp模拟的软骨钙化层与软骨层连接效果良好。
所述的Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:(5～18):(1～4)，软骨钙化层中nHAp含量为10％～20％w/w。
上述方案中的壳聚糖基梯度仿生软骨复合支架材料的构建方法，所制备的Cs/GP/Gel/nHAp梯度仿生软骨复合支架材料，对骨髓间充质干细胞表现出良好的生物学性能，适用于软骨组织工程领域。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果：
本发明选用壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、羟基磷灰石制备复合多孔支架，实现材料功能优势互补。首先，以壳聚糖为基体保证支架的吸水性、生物相容性和生物降解性；复合β-甘油磷酸钠来提供磷元素，从而保证骨质、细胞膜的形成，保证代谢中的各种酶的活性；复合明胶来保证支架的生物相容性、生物活性和生物可降解性，促进细胞在支架上的黏附和增殖；复合以羟基磷灰石在提高支架的骨诱导性和骨传导性的同时，缓解代谢环境的酸化。本发明制备工艺简单、易控，制造成本较低，所制得的支架产品分层结构接近真实软骨结构，显著优化了仿生效果。通过化学交联，获得了结构更加稳定的复合支架；通过调节复合支架材料中四种原料的配比，来调控复合支架的孔隙率、吸水率和机械性能等，获得了孔隙率高、吸水率高、生物相容性好、结构稳定的复合支架材料。
本发明制得的物理共混复合支架材料的孔径较均匀，孔道相互贯通，而梯度复合支架材料的孔径呈现出明显的梯度渐进性，而且孔隙相互贯通，纳米羟基磷灰石模拟的软骨钙化层与软骨层连接效果良好。大孔直径在200μm左右，能够为细胞提供足够的增殖空间并适宜于实体软骨组织的生成和发育；小孔直径在50μm左右，小孔的存在能够增强支架的传质能力并为细胞提供更丰富的附着位点。
扫描电镜、吸水率测试、孔隙率测试、机械强度测试、降解率测试和细胞相容性实验检测都证明了该梯度复合支架材料能够满足软骨组织工程对于支架材料的需求，并且梯度复合支架材料更接近于软骨组织天然构造，性能更佳。
附图说明
图1为本发明壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶物理共混复合支架材料电镜图。a1-a3为Cs/GP/Gel(质量比为1:15.2:1.8，实施例1)物理共混支架：(a1)×200，(a2)×400，(a3)×800；b1-b3为Cs/GP/Gel(质量比为1:8.4:1.5，实施例3)物理共混支架：(b1)×200，(b2)×400，(b3)×800。
图2为本发明Cs/GP/Gel(质量比为1:15.2:1.8，实施例4)梯度复合支架材料电镜图。(a)材料整体形貌，×50；(b)材料上部形貌，×200；(c)材料中部形貌，×200；(d)材料下部形貌，×200。
图3为本发明Cs/GP/Gel/nHAp(质量比为1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w，实施例7)梯度复合支架材料电镜图，材料整体形貌，×50。
图4为本发明Cs/GP/Gel/nHAp(质量比为1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w，实施例7)梯度复合支架材料电镜图，材料上部仿生软骨层，×200。
图5为本发明Cs/GP/Gel/nHAp(质量比为1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w，实施例7)梯度复合支架材料电镜图，材料中部连接处，×100。
图6为本发明Cs/GP/Gel/nHAp(质量比为1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w，实施例7)梯度复合支架材料电镜图，材料下部软骨钙化层，×200。
图7为骨髓间充质干细胞在复合支架上的分布及活性：Cs/GP/Gel(质量比为1:15.2:1.8，实施例1)物理共混支架：(a1)Calcein-AM染色，×100；(a2)PI染色，×100，(a3)Hochest染色，×100。Cs/GP/Gel(质量比为1:15.2:1.8，实施例4)梯度支架：(b1)Calcein-AM染色，×100；(b2)PI染色，×100；(b3)Hochest染色，×100。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。但本发明并不限于下述实施例，在不脱离前后所述宗旨的范围内，所有基于本发明基本思想的修改和变动，都属于本发明请求保护的技术范围内。
实施例1 Cs/GP/Gel(质量比1:15.2:1.8)物理共混复合支架材料制备(作为对比例)
称取2.2g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，40℃下，磁力搅拌2h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取20.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到20mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min使其均匀溶解。称取6.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，40℃下，磁力搅拌30min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为3:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成溶液Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液浇注在模具中，将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻20h，然后转移至冷冻干燥机中-40℃冻干40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应6h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤4h，置于无水甲醇中6h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-40℃下继续干燥40h得到Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料。
实施例2 Cs/GP/Gel(质量比1:6.7:3.1)物理共混复合支架材料制备(作为对比例)
称取2.5g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌3h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取24.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到16mL的去离子水中，室温下磁力搅拌40min使其均匀溶解。称取7.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，50℃下，磁力搅拌40min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为9:1。室温下，按照Cs/GP溶液与明胶溶液的体积比为1:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液浇注在模具中，将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻30h，然后转移至冷冻干燥机中-50℃干燥30h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应9h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤5h，置于无水甲醇中9h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-50℃下继续干燥30h得到Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料。
实施例3 Cs/GP/Gel(质量比1:8.4:1.5)物理共混复合支架材料制备(作为对比例)
称取3.0g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌4h使其混合均匀。以1000rpm转速离心1h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取30.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌60min使其均匀溶解。称取8.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，60℃下，磁力搅拌器60min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为12:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液浇注在模具中，将盛有样品的模具在-40℃冰箱中预冻20h，然后转移至冷冻干燥机中-60℃干燥20h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应12h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤6h，置于无水甲醇中12h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-40℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-60℃下继续干燥20h得到Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料。
实施例4 Cs/GP/Gel(质量比1:15.2:1.8)梯度复合支架材料制备
称取2.2g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，40℃下，磁力搅拌2h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取20.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到20mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min使其均匀溶解。称取6.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，40℃下，磁力搅拌30min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为3:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。将Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。打开B瓶出口处的阀门，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。当容器A和容器B中溶液均流入到支架模具时，取出盛有样品的支架模具。将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻20h后，转移至冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应6h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤4h，置于无水甲醇中6h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-40℃下继续干燥40h得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料。
实施例5 Cs/GP/Gel(质量比1:6.7:3.1)梯度复合支架材料制备
称取2.5g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌3h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取24.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到16mL的去离子水中，室温下磁力搅拌40min使其均匀溶解。称取7.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，50℃下磁力搅拌40min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为9:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。将Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。打开B瓶出口处的阀门，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。当容器A和容器B中溶液均流入到支架模具时，取出盛有样品的支架模具。将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻30h，然后转移至冷冻干燥机中-50℃干燥30h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应9h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤5h，置于无水甲醇中9h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-50℃下继续干燥30h得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料。
实施例6 Cs/GP/Gel(质量比1:8.4:1.5)梯度复合支架材料制备
称取3.0g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌4h使其混合均匀。以1000rpm转速离心1h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取30.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌60min使其均匀溶解。称取8.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，60℃下磁力搅拌60min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为12:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。将Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。打开B瓶出口处的阀门，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。当容器A和容器B中溶液均流入到支架模具时，取出盛有样品的支架模具。将盛有样品的模具在-40℃冰箱中预冻20h后，转移至冷冻干燥机中-60℃冷冻干燥20h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应12h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤6h，置于无水甲醇中12h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-40℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-60℃下继续干燥20h得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料。
实施例7 Cs/GP/Gel/nHAp(质量比1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w)梯度复合支架材料制备
称取2.5g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌2h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取24.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到16mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min使其均匀溶解。称取7.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，50℃下，磁力搅拌30min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为6:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。室温下，取8mL的Cs/GP/Gel溶液，加入2.0g的纳米羟基磷灰石，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散30min混合至纳米羟基磷灰石均匀地分散在溶液中，得到纳米羟基磷灰石含量为20％(w/w)的Cs/GP/Gel/nHAp溶液。将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。将Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。打开B瓶出口处的阀门，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。当容器B中液体剩余1/4时，关闭阀门；向容器B中加入上述制备的Cs/GP/Gel/nHAp溶液；打开阀门，待A、B瓶中的液体全部流入支架模具后，取出盛有样品的支架模具。将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻30h后，转移至冷冻干燥机中-50℃冷冻干燥30h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应9h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤5h，置于无水甲醇中9h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-50℃下继续干燥30h得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料。
实施例8 Cs/GP/Gel/nHAp(质量比1:11.1:3.0，软骨钙化层中nHAp含量为10％w/w)梯度复合支架材料制备
称取3.0g的壳聚糖粉末，加入到100mL 0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下，磁力搅拌3h使其混合均匀。以1000rpm转速离心1h，使壳聚糖溶液脱气、脱渣。称取30.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌40min使其均匀溶解。称取8.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，60℃下，磁力搅拌40min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为9:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。室温下，取9mL的Cs/GP/Gel溶液，加入1.0g的纳米羟基磷灰石，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散40min混合至纳米羟基磷灰石均匀地分散在溶液中，得到纳米羟基磷灰石含量为10％(w/w)的Cs/GP/Gel/nHAp溶液。将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；同时将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中。将Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将0.1mol/L的乙酸溶液加入到容器A中，乙酸溶液用于稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；其中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同。打开B瓶出口处的阀门，在重力作用下或在容器A瓶口施加压力下，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入到支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液。整个过程尽可能快速进行，减少乙酸溶液挥发。配置过程是连续进行的，由于连通器原理，两瓶中液体参与配制的体积始终相等。当容器B中液体剩余1/5时，关闭阀门；向容器B中加入上述制备的Cs/GP/Gel/nHAp溶液；打开阀门，待A、B瓶中的液体全部流入支架模具后，取出盛有样品的支架模具。将盛有样品的模具在-40℃冰箱中预冻20h后，转移至冷冻干燥机中-60℃干燥20h冻干，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将其浸置于100mL碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)的交联液中交联反应12h，随后将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤6h，置于无水甲醇中12h以将溶剂萃取干净；最后将材料置于-40℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-60℃下继续干燥20h得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料。
实施例9 Cs/GP/Gel(以质量比为1:15.2:1.8为例，实施例1)物理共混复合支架、Cs/GP/Gel(以质量比为1:15.2:1.8为例，实施例4)梯度复合支架、Cs/GP/Gel/nHAp(以质量比为1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w为例，实施例7)梯度复合支架的性能测试
(1)支架形貌电镜观察
用薄刀片将支架材料切成1mm×1mm的薄片，用导电胶固定在载物台上，用氮气吹扫样品表面，吹去表面杂质，真空喷金，置于钨灯丝扫描电子显微镜下观察支架形貌。
结果表明，复合支架材料孔道相互贯通，孔径大部分介于50～200μm之间，最大孔径在200μm左右，为细胞的黏附、增殖提供了充足的空间，适宜于实体软骨组织的生长和发育。放大观察后发现，在大孔的孔壁上有直径在50μm左右的微孔结构，这些微孔结构能够提高支架材料的传质性能，有利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞提供平衡的生长环境，并为细胞提供更丰富的附着位点；在孔壁上能够观察到参差不齐的片状和纤维状外伸结构，这些结构能够进一步增加支架表面的附着位点。Cs/GP/Gel物理共混复合支架材料孔径较均匀，Cs/GP/Gel梯度复合支架材料的孔径呈现出明显的梯度渐进性，Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料的孔径呈现出明显的梯度渐进性，而且nHAp模拟的软骨钙化层与软骨层连接效果良好。
(2)支架孔隙率测试
采用比重瓶法测量支架材料的孔隙率。将支架用薄刀片切成边长为0.5cm的均匀立方体，将比重瓶装满无水乙醇，称重为W1，将质量为Ws的样品浸入乙醇中，真空脱除支架中的气泡，使材料完全被无水乙醇浸润，然后再加满乙醇，称重为W2。将浸满无水乙醇的支架样品从无水乙醇中取出，剩余的无水乙醇与比重瓶称重为W3。测试温度下乙醇密度为ρ。由此可求得，样品支架本身体积为Vs＝(W1-W2+Ws)/ρ，样品支架孔体积为Vp＝(W2-W3-Ws)/ρ。支架材料的孔隙率可用如下公式计算。
结果表明，Cs/GP/Gel物理共混支架的孔隙率为89.10％，而Cs/GP/Gel梯度支架由于在高度方向上呈现出梯度孔径，具有更加复杂的孔道分布，所以孔隙率提高到92.19％，但是从统计学上来看两者并无显著性差异。
(3)支架吸水率测试
取一小块支架材料，在干燥条件下称其质量为m1，置于24孔板中，向孔中注入没过支架的磷酸盐缓冲溶液，将支架置于真空干燥箱中抽取气泡使其下沉。在37℃环境中浸泡一段时间，用镊子轻轻夹取支架，注意不要用力以避免支架中水分流失，用吸水纸擦去支架外表面水分，分析天平称重，记为m2。材料的吸水率可通过如下公式计算而得。
结果表明，Cs/GP/Gel物理共混支架的吸水率为379.22％；在相同的配比下，Cs/GP/Gel梯度支架的吸水率有了很大的提高，高达587.79％，这是由于梯度支架呈现出的梯度孔径增加了支架孔道中的孔密度，从而增强了支架材料的吸水能力。支架材料良好的吸水性能有利于细胞的粘附增殖，所以从吸水率来看，梯度支架更加适宜于做软骨仿生材料。
(4)支架弹性模量测试
利用万能实验机测定支架材料的弹性模量与强度，样品规格为5mm×5mm×5mm，支架上下截面要尽量平整，以避免表面凸起造成的压力异常，实验前确保加载装置力线垂直于支架材料表面。根据其结果绘制支架的负荷位移图，支架材料的位移控制加载速度为1mm/min。根据所获得的数据计算复合支架的弹性模量，公式如下：
式中，E为弹性模量，单位为MPa；L1、L2为线性段(弹性形变段)开始前后的压力负荷，单位为N；a、b、h分别代表试样材料的长、宽和高，单位为cm；D1、D2代表支架材料在压力负荷下的位移，单位为mm。
结果表明，Cs/GP/Gel物理共混支架的弹性模量为9.27MPa，Cs/GP/Gel梯度支架的弹性模量为7.88MPa。梯度支架孔径的梯度渐进性使得材料孔壁的机械支撑力低于物理共混支架均匀孔径的支撑力，从而使得梯度支架的机械强度有所降低。
(5)支架降解性能测试
取一小块的支架材料，称其质量为m0，置于24孔板中，加入含有溶菌酶(2mg/mL)的磷酸盐缓冲溶液中，在37℃保温箱中进行支架的体外降解实验，并对复合支架的质量降解率进行分析。每隔3天取出，先用吸水纸吸去表面的液体，然后放入真空干燥箱中抽干材料中的水分，称重，记为mt。则复合支架的质量降解率Dt可用以下公式计算得到。
结果表明，在溶菌酶溶液中第15天Cs/GP/Gel物理共混支架的降解率为69.08％，Cs/GP/Gel梯度支架的降解率远远高于物理共混支架的降解率，可达95.45％。造成这种巨大差异的原因是：梯度支架具有较好的吸水性，从而保证了在降解过程中溶菌酶和水分子充分与支架材料的孔壁接触，另外，梯度支架本身在高度方向上的孔径梯度渐进性也使支架材料更容易解体成更小的支架片层而增大了与溶菌酶和水分子接触的概率。如此往复，支架材料逐渐细化、分散，从而加速了降解的进程。
实施例10 Cs/GP/Gel(以质量比1:15.2:1.8为例，实施例1)物理共混复合支架、Cs/GP/Gel(以质量比1:15.2:1.8为例，实施例4)梯度复合支架和Cs/GP/Gel/nHAp(以质量比1:10:1.6，软骨钙化层中nHAp含量为20％w/w为例，实施例7)梯度复合支架的细胞相容性检测
本发明从70～120g的SD大鼠股骨中提取原代骨髓间充质干细胞，其生长状态良好，呈多边形和长梭形，细胞之间存在突触相连，且具有良好的增殖能力和多向分化能力。
骨髓间充质干细胞-支架复合物的体外构建：将复合支架切成长宽都为0.5cm2，厚度为1mm的薄片，放入6孔板中用75％乙醇浸泡12h，将其放在超净工作台中，紫外线照射12h，浸泡结束后，换用含有磷酸盐缓冲溶液浸泡6h，再换用少量含有1％双抗的完全培养基浸泡支架1h，确保支架沉底，弃去培养基后风干支架至半干状态，准备接种。消化骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，利用血球计数板调整细胞密度为106cells/mL，向支架正反面上分别均匀滴加5μL细胞悬液，将其放入96孔板中，加入100μL的完全培养基，随后将该孔板置于培养箱(37℃，5％CO2)中培养，定期置于显微镜下观察，视细胞生长情况决定是否换液。
细胞-支架复合培养物培养一周后，将其置于孔板当中，用2％戊二醛在室温下固定12h，再依次使用浓度梯度为50％、70％、90％、100％、100％的酒精进行脱水，每级脱水时间都为30min，脱水完成后进行真空干燥，最后用扫描电镜观察复合支架上细胞粘附及胞外基质分泌情况。对细胞-支架进行扫描电镜观察发现，骨髓间充质干细胞在两种支架上生长状态良好，且观察到细胞间存在细胞突触的连接。
用手术镊子将在孔板中培养一周的软骨仿生支架-细胞复合物取出，移至24孔板中，进行Dead/Live荧光染色以观察细胞在软骨仿生支架中的生长情况，亦即考察支架的生物相容性。
软骨仿生支架材料-细胞复合物中细胞的Dead/Live荧光染色检测：配置Calcein-Hochest-PI染色液(2μL Calcein储备液，5μL Hochest储备液，1μL PI储备液溶解在1mLPBS中)；PBS冲洗支架两次，加入染色液，染色液加入量以覆盖支架为宜；培养箱(37℃、5％CO2)中孵育30min，PBS冲洗后，移至荧光显微镜下观察。Calcein-AM染色发现，细胞在物理共混复合支架上均匀分布，细胞大量存活且具有良好的活性；在梯度复合支架上，沿孔径大小方向细胞数目也呈现出梯度分布，细胞大量存活且具有良好的活性；纳米羟基磷灰石模拟的软骨钙化层中细胞数量较少，而且细胞比较肥大。PI染色只出现少量被染成红色的死细胞，Hoechst染色可观察到大面积被染成蓝色荧光的细胞核。这说明所制备的复合支架适合细胞的粘附生长，而且梯度复合支架更接近于真实软骨中的细胞分布情况，更适合于做软骨仿生材料。
Claims (8)
1.一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，用于制备Cs/GP/Gel梯度复合支架材料、Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料，其特征在于以下步骤：
(1)将壳聚糖Cs粉末加入乙酸溶液中，在40～60℃条件下，搅拌至其溶解均匀，得到Cs乙酸溶液，Cs乙酸溶液中的壳聚糖浓度为2～3％w/v；将Cs乙酸溶液离心处理，使壳聚糖溶液脱气、脱渣；
(2)将β-甘油磷酸钠GP粉末加入去离子水中，室温下搅拌使其溶解均匀，得到浓度为100～300％w/v的GP水溶液；
(3)将明胶Gel颗粒加入去离子水中，40～60℃下，搅拌使其溶解均匀，得到浓度为5～8％w/v的Gel水溶液；
(4)室温下，将步骤(1)制备得到的Cs乙酸溶液搅拌，搅拌过程中逐滴滴加步骤(2)制备的GP溶液，继续搅拌后制成Cs/GP溶液A；滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败；所述的Cs乙酸溶液和GP水溶液的体积比为3:1～12:1；
(5)室温下，将步骤(3)制备的Gel水溶液加入步骤(4)制备得到的Cs/GP溶液中，搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液；所述的Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1～3:1；
(6)室温下，将纳米羟基磷灰石nHAp加入步骤(5)制备的Cs/GP/Gel溶液中，搅拌预混后，进一步超声分散至nHAp均匀地分散在溶液B中，得到Cs/GP/Gel/nHAp溶液；所述的Cs/GP/Gel/nHAp溶液中nHAp的含量为10～20％w/v；
(7)制备得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料，作为梯度仿生软骨；
7.1)将容器A和容器B底部通过带有阀门的连通管水平连通，B瓶放于磁力搅拌器上，容器A和容器B位于同一水平面；将容器B下方与支架模具上方通过带有阀门的导液管连接，支架模具位于上述水平面的下方，且放置于恒温冷冻装置中；
7.2)将步骤(5)中制备的Cs/GP/Gel溶液转移到容器B中，磁力搅拌使其混合均匀；将乙酸溶液加入容器A中，容器B中的Cs/GP/Gel溶液与容器A中的乙酸溶液体积相同；打开B瓶出口处阀门，容器B中的Cs/GP/Gel溶液连续流入支架模具内，此时，容器A中的乙酸溶液连续流入到容器B中，在磁力搅拌作用下将容器B内的溶液混合均匀，稀释容器B中的Cs/GP/Gel溶液；
7.3)当容器A和容器B中溶液均流入到支架模具时，取出盛有样品的支架模具；
7.4)将盛有样品的支架模具在-20～-40℃条件下预冻20～30h，进行冷冻干燥处理后，取出支架预产物去除表面致密层后，将其浸置于交联液中交联反应6～12h，再将支架预产物置于Na2HPO4溶液中洗涤4～6h，置于无水甲醇中6～12h以将溶剂萃取干净；最后将材料于-20～-40℃条件下预冻成型后，继续冷冻干燥处理得到Cs/GP/Gel梯度复合支架材料；
(8)制备得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料，作为含软骨钙化层的梯度仿生软骨；
重复步骤7.1)、7.2)；当容器B中液体剩余1/4～1/5时，关闭容器B出口处阀门；向容器B中加入步骤(6)制备的Cs/GP/Gel/nHAp溶液，打开阀门，待A、B瓶中的液体全部流入支架模具后，取出盛有样品的支架模具，采用步骤7.4)的方法制备得到Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤7.4)中所述的交联液为碳化二亚胺EDC、羟基琥珀酰胺NHS、吗啉乙烷磺酸MES在40％乙醇溶液中的混合溶液；其中，三种组分EDC、NHS、MES的浓度均为50mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(1)、步骤7.2)中所述的乙酸溶液的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤7.4)中冷冻干燥温度均为-40～-60℃、时间均为20～40h。
5.根据权利要求3所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤7.4)中冷冻干燥温度均为-40～-60℃、时间均为20～40h。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(1)中Cs乙酸溶液的离心转速为1000rpm/min，离心时间为0.5～1h；步骤(1)中所述的搅拌时间为30～60min；步骤(1)中所述的超声分散时间为30～60min。
7.根据权利要求3所述的一种壳聚糖基梯度仿生复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(1)中Cs乙酸溶液的离心转速为1000rpm/min，离心时间为0.5～1h；步骤(1)中所述的搅拌时间为30～60min；步骤(1)中所述的超声分散时间为30～60min。
8.采用权利要求1-7任一所述的制备方法得到的壳聚糖基梯度仿生复合支架材料，其特征在于，所述的Cs/GP/Gel梯度复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:5～18:1～4；Cs/GP/Gel梯度复合支架材料的孔径呈现明显的梯度渐进性，同时保留物理共混支架材料的孔道结构，孔隙率92.19～95.20％，吸水率587.79～677.47％，弹性模量为6.81～8.12MPa；
所述的Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:5～18:1～4，nHAp含量为10％～20％w/w；Cs/GP/Gel/nHAp梯度复合支架材料中nHAp模拟的软骨钙化层与软骨层连接效果良好。
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