CN1943801A - 一种基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料及其制备方法。该叠层梯度复合支架材料，为三层或多层多孔结构，由透明质酸、PLGA、PLA、II胶原和纳米羟基磷灰石(nano－HA)、β－三磷酸三钙(β－TCP)制成。上层为仿软骨层，由II胶原/透明质或PLGA或/和PLA制成；中间为仿软骨钙化层，该层为一层或多层子层，由nano－HA或/和β－TCP与II胶原/透明质酸或PLGA或/和PLA制成；底层由nano－HA或/和β－TCP，与II胶原或PLGA或/和PLA制成。在其叠层中，由上至下，无机材料含量递增，其占各层质量百分比为0％～60％。本支架材料孔径50～450微米，孔隙率70％～93％。本方法制备的支架材料降解速率可调、力学性能和生物相容性好，能适应骨软骨细胞共同培养和生长因子或小分子多肽的复合，可用于骨软骨的同时修复。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，具体涉及用于骨软骨缺损修复的组织工程叠层复合支架材料的制备方法及其工艺。
背景技术
关节软骨缺损是很常见的疾病，其缺损模型有：I、小于4毫米，软骨小范围缺损，属轻微损伤，II、大于4毫米，难自身愈合，需借助外力，III、伤及软骨下骨，因骨内血管会穿透软骨下骨进入，会导致软骨坏死，有纤维组织长入。最常见的则是第三种损伤。由于关节软骨特殊的组织结构及生物学特性，虽然已知有许多治疗关节软骨缺损的方法，包括：软骨下骨钻孔，电刺激，激光，药物及细胞注射，基因治疗等等，但是所有这些方法都达不到满意的修复效果。组织工程技术的出现使软骨组织缺损的完全再生成为可能。其基本原理是，将体外分离培养的正常组织细胞接种到具有一定空间结构和良好的生物相容性的三维支架上，同时辅以特殊的生长因子，然后将细胞-支架的复合物体外培养一定时间后植入体内，随着细胞增殖，支架材料不断降解，被细胞外基质代替，逐渐形成具有正常功能的组织。其中支架材料是组织工程的关键要素之一。目前用于修复关节软骨的组织工程支架材料有透明质酸(Hyaluronate，HA)，聚乳酸(polylactic，PLA)，聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic)，PLGA)，胶原(collagen)，壳聚糖(chitosan)，硫酸软骨素或者是其中几种材料的复合等等。但使用这些支架材料不能得到很好的修复效果。例如，壳聚糖胶原复合支架，虽然生物活性良好，但其修复效果并不理想。尤其是对于伤及软骨下骨的关节软骨缺损，不仅需要支架材料提供软骨修复所需环境，还需要为软骨下骨和骨的修复提供具有合适降解性能和力学性能的环境，因此需要选择降解速率可调且能同时修复软骨，软骨下骨和骨组织的支架材料，不同修复部位的材料性能应能具体适应特定组织的生长。
II胶原和透明质酸均是软骨细胞外基质的成分，其中II胶原是主要成分，以这两种材料作为支架可有效促进软骨细胞黏附、增殖。具有不同比例PLGA的降解速率不同，对于调节支架降解速率有很大作用。纳米羟基磷灰石(nano-HA)和β-磷酸三钙(β-TCP)与人类自然骨中的主要无机成分类似，具有良好的生物相容性和生物活性，在普通合成的生物材料中添加少量纳米羟基磷灰石不仅可显著改善材料对成骨细胞的粘附和增殖能力、促进新骨形成，而且还可调节其降解速度。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料及制备方法。该叠层梯度复合支架材料，力学性能良好，生物相容性好，且能适应骨软骨细胞共同培养及生长因子或小分子多肽的复合，同时进行骨和软骨修复，并且依此方法制备的支架材料降解速率可调。
本发明目的是通过以下方案实现的：
一种基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料，其特征在于：所述的叠层梯度复合支架材料为三层或多层多孔结构，由有机材料和无机材料制成，所述的有机材料包括透明质酸，聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、II胶原，无机材料包括纳米羟基磷灰石(nano-HA)、β-磷酸三钙(β-TCP)，上层为仿软骨层，中间为仿软骨钙化层，底层为仿骨层。
上层由II胶原-透明质酸制成，中间层为一层或多层子层构成，由纳米羟基磷灰石或/和β-TCP与II胶原-透明质酸制成，底层由纳米羟基磷灰石或/和β-TCP与II胶原-透明质酸制成；或者，
上层为聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸，中间层为一层或多层子层构成，由纳米羟基磷灰石或/和β-TCP与聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸制成，底层由纳米羟基磷灰石或/和β-TCP与聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸制成；
在其叠层中，由上层至底层，无机材料成分从无到有，由少增多，形成梯度，优选等差梯度，无机材料成分占各层质量的百分比为0％～60％；
其中所述的聚乳酸-羟基乙酸中的聚乳酸与聚羟基乙酸比例为50～85∶50～15，所述的聚乳酸的分子量100000-1000000。
本发明的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料中，孔的孔径为50～450微米，孔隙率为70％～93％。
本发明的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法有两种。
一种制备方法的步骤为：
步骤1、以透明质酸、II胶原为原料，制备成醋酸水溶液，加入碳二亚胺(EDC)交联剂，得溶液A；
步骤2、按步骤1另制备A溶液，按溶液中透明质酸和II胶原含量等差减少分成n份，n为≥1的自然数，在每份中加入纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙，其加入量按1～n份依次等差增多，超声均质化，得溶液B1、B2…Bn，每份溶液中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙加透明质酸-II胶原总质量相等；
步骤3、按步骤1另制备A溶液，加入纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙，其加入量相对于溶液Bn中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的质量含量多一级差，超声均质化，得溶液C；
步骤4、将上述步骤1-3制备的A，B1、B2…Bn，C溶液分别注入模具中，预冻成型，然后将A，B1、B2…Bn，C从模具中取出，将A，B1、B2…Bn，C按顺序从上至下叠放，层与层之间涂上碳二亚胺交联剂或/和浸置于碳二亚胺交联剂中，于常压加热到25℃～40℃热烘1～3小时，使叠层内、层与层之间以及整体支架采用碳二亚胺固定，进行真空干燥后得到叠层梯度复合多孔支架材料，孔径50～450μm，孔隙率为70％～85％；
在溶液B1、B2…Bn，溶液C中，纳米羟基磷灰石或/和β-TCP质量占纳米羟基磷灰石或/和β-TCP加透明质酸-II胶原总质量的0％＜～60％。
另一种制备方法的步骤为：
步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸溶在二氯甲烷中，加入氯化钠(NaCl)颗粒制孔，搅拌均匀，得溶液A；
步骤2、将纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙分散在二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后，分成n份，n为≥1的自然数，其量按1～n份依次等差增多，然后分别加入到另配的n份聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸的二氯甲烷溶液中，其中聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸含量按1～n份依次等差减少，每份中加入NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，得溶液B1、B2…Bn；每份溶液中聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸加纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的总质量相等；
步骤3、将纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙分散在二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到另配的聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸的二氯甲烷溶液中，其加入量相对于溶液Bn中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的质量含量多一级差；加入NaCl颗粒作制孔剂，搅拌均匀，得溶液C，
步骤4、将上述步骤1-3制备的A，B1、B2…Bn，C溶液分别注入模具中，待溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏后，从模具中取出，再将A，B1、B2…Bn，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，即制得叠层梯度复合支架多孔材料，孔径50～450μm，孔隙率为80％～93％；
其中所述的聚乳酸-羟基乙酸中的乳酸与羟基乙酸的摩尔比50～85∶50～15；所述的聚乳酸的分子量100000-1000000；
在溶液B1、B2…Bn，溶液C中，纳米羟基磷灰石或/和β-TCP质量占纳米羟基磷灰石或/和β-TCP加聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸总质量的0％＜～60％。
本发明所用的聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50∶50，75∶25，85∶15。
依上述方法制备的三层至多层的叠层梯度复合材料有较好的通孔结构，孔径50～450微米，孔隙率为70％～93％。
本发明仿关节面软骨，软骨下骨和骨的过渡结构，分别采用II胶原-透明质酸和PLGA与nano-HA制备叠层梯度复合材料，可实现材料间的优势互补，为细胞培养及生长因子提供仿生的生物环境。透明质酸可选择分子量200000～1000000的产品及其衍生物酯化透明质酸。Nano-HA与β-TCP粉体材料粒度为50～200纳米，这两种无机材料的不同比例复合可调节降解速率。选择的交联剂碳二亚胺(EDC)不具细胞毒性，交联后的II胶原-透明质酸力学强度增强，其浓度范围选择为0.05％～6％。
本发明制备的叠层梯度复合支架材料降解速率可调，力学性能良好，生物相容性好，且能适应骨软骨细胞共同培养及生长因子或小分子多肽的复合，可同时进行骨和软骨修复。
具体实施方式
以下通过具体实例对本发明作进一步阐释。
实施例中的聚乳酸-羟基乙酸简写为PLGA，乳酸简写为LA，羟基乙酸简写为GA，纳米羟基磷灰石简写为nano-HA，β-磷酸三钙简写为β-TCP。
实施例1
取0.2克PLGA(LA∶GA的摩尔比为50∶50，分子量10W)溶解在2毫升二氯甲烷中，加入2克NaCl颗粒(粒径150-200微米)制孔，搅拌均匀，此为溶液A；取0.17克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.03克nano-HA分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B；取0.10克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.10克nano-HA分散在2毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入模具中，待三种溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏后，从模具中取出，再将A，B，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，室温下干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-350微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率为85％。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例2
取0.2克PLGA(LA∶GA的摩尔比为75∶25，分子量18W)溶解在2毫升二氯甲烷中，加入2.4克NaCl颗粒(粒径150-400微米)制孔，搅拌均匀，此为溶液A；取0.16克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.02克nano-HA与0.02克β-TCP分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入2.4克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B；取0.12克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.06克nano-HA与0.02克β-TCP分散在2毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入2.4克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入模具中，待三种溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏状后，从模具中取出，再将A，B，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，室温下干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-450微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率在90％以上。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例3
取0.1克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％的碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，此为A溶液；取0.07克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％的碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，加入0.03克nano-HA，超声均质化20分钟，得溶液B；取0.02克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％的碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，加入0.08克的nano-HA，超声均质化20分钟，得溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入培养皿中，预冻24小时，预冻成型后将A，B，C从模具中取出，按从上到下叠层，层与层之间涂上浓度为0.05％的碳二亚胺交联剂，并浸置于交联剂中，于常压加热到30±5℃，真空干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-350微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率在70％以上。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例4
取0.1克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，此为A溶液；取0.08克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％的碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，加入0.02克β-TCP，超声均质化20分钟，得溶液B；取0.05克II胶原，放入2毫升浓度为1％的醋酸水溶液中，常温搅拌2小时使完全溶解，滴加2毫升浓度1％透明质酸水溶液，快速搅拌1小时，加入浓度为1％的碳二亚胺交联剂，得到交联的II胶原-透明质酸水溶液，，加入0.05克β-TCP，超声均质化20分钟，得溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入培养皿中，预冻24小时，预冻成型后将A，B，C从模具中取出，按从上到下叠层，层与层之间涂上浓度为0.05％的碳二亚胺交联剂，于常压加热到35±5℃，真空干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-350微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率在80％以上。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例5
取0.2克PLGA(LA∶GA的摩尔比为75∶25，分子量18W)溶解在2毫升二氯甲烷中，加入2.4克NaCl颗粒(粒径150-200微米)制孔，搅拌均匀，此为溶液A；取0.16gPLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.04克β-TCP分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入2.4克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B；取0.12克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.08克β-TCP分散在2毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入NaCl颗粒作制孔剂，搅拌均匀，此为溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入模具中，待三种溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏状后，从模具中取出，再将A，B，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，室温下干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-350微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率为93％。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例6
取0.1克PLGA(LA∶GA的摩尔比为85∶15，分子量30W)溶解在2毫升二氯甲烷中，加入1.2克NaCl颗粒(粒径150-200微米)制孔，搅拌均匀，此为溶液A；取0.08克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.02克nano-HA分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入1.2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B1；取0.07克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.03克nano-HA分散在2毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入1.2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B2；取0.06克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.04克nano-HA分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入1.2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B3；取0.005克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.05克nano-HA分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入1.2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B4；取0.04克PLGA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.06克nano-HA分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLGA的二氯甲烷溶液中，加入1.2克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液C；将A，B1，B2，B3，B4，C溶液分别注入模具中，待溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏后，从模具中取出，再将A，B1，B2，B3，B4，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，室温下干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-350微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率为93％。材料各部分降解速率不同，由上至下速度逐渐减慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
实施例7
取0.2克PLA(分子量60W)溶解在2毫升二氯甲烷中，加入2.4克NaCl颗粒(粒径150-400微米)制孔，搅拌均匀，此为溶液A；取0.16gPLA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.04克β-TCP分散在1毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLA的二氯甲烷溶液中，加入2.4克NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液B；取0.12克PLA溶于2毫升二氯甲烷中，将0.08克β-TCP分散在2毫升二氯甲烷中制成悬液，超声均质化20分钟后加入到PLA的二氯甲烷溶液中，加入NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，此为溶液C；将A，B，C三种溶液分别注入模具中，待三种溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏后，从模具中取出，再将A，B，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，室温下干燥后得多孔叠层材料。
扫描电镜下观察孔连通情况良好，孔径范围在50-450微米，层间连接自然，纳米颗粒分布均匀。用比重法测得孔隙率为93％。材料各部分降解速率不同，其中上层降解最快，下层最慢，可以适应软骨及骨组织的不同再生速度。
Claims (8)
1、一种基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料，其特征在于：所述的叠层梯度复合支架材料为三层或多层多孔结构，由有机材料和无机材料制成，所述的有机材料包括透明质酸、聚乳酸，聚乳酸-羟基乙酸、II胶原，无机材料包括纳米羟基磷灰石、β-磷酸三钙，上层为仿软骨层，中间为仿软骨钙化层，底层为仿骨层，
上层由II胶原-透明质酸制成，中间层为一层或多层子层构成，由纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙与II胶原-透明质酸制成，底层由纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙与/II胶原制成；或者，
上层为聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸，中间层为一层或多层子层构成，由纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙与/聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸制成，底层由纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙与聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸制成；
在其叠层中，由上层至底层，无机材料成分从无到有，由少增多，形成梯度，无机材料成分占各层质量的百分比为0％～60％；
其中所述的聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50～85∶50～15；所述的聚乳酸的分子量100000-1000000。
2、如权利要求1所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料，其特征在于所述的梯度复合支架材料中孔的孔径为50～450微米，孔隙率为70％～93％。
3、如权利要求1所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料，其特征在于所述的叠层梯度复合支架材料的叠层中，由上层至底层，无机材料成分从无到有，由少增多，形成等差梯度，无机材料成分占各层质量的百分比为0％～60％。
4权利要求1所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法，其特征在于制备步骤为：
步骤1、以透明质酸、II胶原为原料，制备成醋酸水溶液，加入碳二亚胺交联剂，得溶液A；
步骤2、按步骤1另制备A溶液，按溶液中透明质酸和II胶原含量等差减少分成n份，在每份中加入纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙，其加入量按1～n份依次等差增多，超声均质化，得溶液B1、B2…Bn，每份溶液中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙加透明质酸-II胶原的总质量相等；
步骤3、按步骤1另制备A溶液，加入纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙，其加入量相对于溶液Bn中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的质量含量多一级差，超声均质化，得溶液C；
步骤4、将上述步骤1-3制备的A，B1、B2…Bn，C溶液分别注入模具中，预冻成型，然后将A，B1、B2…Bn，C从模具中取出，将A，B1、B2…Bn，C按顺序从上至下叠放，层与层之间涂上碳二亚胺交联剂或/和浸置于碳二亚胺交联剂中，于常压加热到25℃～40℃热烘1～3小时，进行真空干燥后得到叠层梯度复合多孔支架材料，孔径50～450μm，孔隙率为70％～85％；
在溶液B1、B2…Bn，溶液C中，纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙质量占纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙加透明质酸-II胶原总质量的0％＜～60％。
5、权利要求1所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法，其特征在于制备步骤为：
步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸溶在二氯甲烷中，加入NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，得溶液A；
步骤2、将纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙分散在二氯甲烷中制成悬液，超声均质化后，分成n份，其量按1～n份依次等差增多，然后分别加入到另配的n份聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸的二氯甲烷溶液中，其中聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸含量按1～n份依次等差减少，每份中加入NaCl颗粒制孔，搅拌均匀，得溶液B1、B2…Bn，每份溶液中聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸加纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的总质量相等；
步骤3、将纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙分散在二氯甲烷中制成悬液，超声均质化后加入到另配的聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸的二氯甲烷溶液中，其加入量相对于溶液Bn中纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙的质量含量多一级差，加入NaCl颗粒作制孔剂，搅拌均匀，得溶液C；
步骤4、将上述步骤1-3制备的A，B1、B2…Bn，C溶液分别注入模具中，待溶液中的溶剂自然挥发到溶液成型为胶膏后，从模具中取出，再将A，B1、B2…Bn，C胶膏按从上至下顺序叠放于模具中，待溶剂完全挥发后，用去离子水滤去NaCl直至恒重，即制得叠层梯度复合支架多孔材料，孔径50～450μm，孔隙率为80％～93％；
其中所述的聚乳酸-羟基乙酸中的乳酸与羟基乙酸的摩尔比50～85∶50～15；所述的聚乳酸的分子量100000-1000000；
在溶液B1、B2…Bn，溶液C中，纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙质量占纳米羟基磷灰石或/和β-磷酸三钙加聚乳酸-羟基乙酸或/和聚乳酸总质量的0％＜～60％。
6、如权利要求4所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法，其特征在于所述的聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50∶50。
7、如权利要求4所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法，其特征在于所述的聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为75∶25。
8、如权利要求4所述的基于仿生结构的叠层梯度复合支架材料的制备方法，其特征在于所述的聚乳酸-羟基乙酸中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为85∶15。
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