CN101869724B - 可控释中药的骨修复支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有中药控释功能的骨修复支架材料及其制备方法。本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料，包括负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体、聚合物、胶原以及辅料，以共混或共聚的方式组成骨修复支架材料；所述的特定功能中药是具有改善局部血液循环、促进骨折愈合或治疗骨科疾病的单味中药或无禁忌配伍的复方中药。本发明所述的骨修复支架材料可维持植入局部较长时间内有效的药物浓度，同时为细胞的长入和新骨的形成提供适宜的三维空间和稳定力学支撑，从而更好的适应和满足临床要求。

Description

可控释中药的骨修复支架材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种具有中药控释功能的骨修复支架材料及其制备方法。

背景技术

生物可降解支架材料复合药物或细胞生长因子应用于骨缺损修复，为骨修复重建提供了合乎生物学原则的思路，被认为是理想的骨修复方法。其中，利用载体支架的可降解特性使药物在体内缓慢释放，达到局部较高浓度，以促进成骨细胞增殖、分化及功能表达，或促进细胞的有丝分裂并诱导成骨，从而加速骨缺损愈合，提高植入成功率。而支架材料作为药物的缓释载体在植入初期可以为细胞附着生长提供力学支撑，之后再缓慢降解，待缺损愈合后，支架也降解完全，从而避免二次手术取出为患者带来的痛苦。

胶原材料是常用的骨修复材料。胶原是骨的主要有机成分，I型胶原及其交联纤维结构是骨细胞外基质中最丰富的蛋白。胶原结构对矿物沉积具有诱导作用，其表面含有矿物沉积的位点，可有效引发和控制矿化过程，促进新生骨组织形成。

骨形态发生蛋白(BMP)是Urist首次从脱钙骨基质中提取出的具有诱骨活性的非特异性物质，是目前公认的高效骨诱导因子，它具有诱导成骨细胞分化和诱导体外成骨能力，而且发现它还可以活化或诱导血管周围的间充质细胞不可逆地分化为软骨和成骨细胞。因此，BMP已成为当前“载体+生长因子”模式生物材料中最为常用的活性因子，并在动物实验和临床试验中均取得显著效果。但其中仍有许多问题影响了BMP在临床上的广泛应用。例如，其临床应用效果不如动物实验；BMP在诱导成骨的同时也刺激破骨细胞的增生，而且破骨细胞的增生早于成骨细胞；不同来源的BMP活性不一等。此外，目前生物材料作为BMP载体，BMP的用量很大，往往达到毫克级，由于目前市场上BMP很昂贵，仅Sigma公司用于实验研究的BMP，每10μg售价达到500美元，昂贵的费用也是制约其广泛应用的因素之一。寻找具有与细胞生长因子作用类似且价格低廉的药物则是解决该问题的关键。传统中药的某些有效成分具有与细胞因子类似的生理活性和广泛的药理作用，且价格低廉，理化性质相对稳定，有作为细胞因子和抗生素替代物应用于骨缺损修复的良好前景。

诸多研究表明，中药具有良好的促进骨折愈合修复和治疗骨科疾病的作用，主要表现在早期中药促进局部血肿吸收和机化，改善与恢复骨折部位的血液供应；促进骨折部位骨基质钙盐沉积，提高骨痂质量及生物力学性能；促进成骨细胞增殖，提高细胞活性等。近年来，应用细胞生物学及分子生物学手段研究表明，中药不仅能够促进骨髓间充质干细胞/成骨细胞的增殖、分化及细胞表型，而且能刺激细胞分泌内源性生长因子，对骨形成因子具有调控作用。例如，淫羊藿能使骨组织中BMP的mRNA表达显著升高，从而促进成骨细胞增殖和分化。而且淫羊藿、骨碎补、巴戟天等中药还含有较丰富的铜、锰、锌等微量元素，现代研究发现，微量元素对成骨细胞及骨胶原的形成具有特殊作用，如铜可促进胶原的交联反应，对骨形成、维持有重要意义；锰可促进粘多糖合成及骨形成；而锌能调解细胞增殖、分化及各种功能表达。黄芪多糖是黄芪的主要活性成分，实验表明其能够促进成骨细胞增殖，提高碱性磷酸酶活性，对自然衰老成骨细胞的增殖能力也有一定的恢复作用。此外，研究表明，上述天然或植物提取物类中药物在促进成骨细胞增殖分化的同时，还可抑止破骨细胞的活性，可加速新生骨组织的形成，同时有不致对人体产生其他不良影响。

目前，国内已有研究人员尝试将中药复合于骨水泥中，制备含中药的磷酸钙骨水泥粉末作为骨修复材料，并开展了相关临床应用研究。然而，骨水泥无法预先成型，对细胞的长入和新骨的形成、生长不能提供适当的生理空间及提供相对稳定的力学支撑，仅可用以体积较小、血液循环较少的部位骨缺损的填充，但难以修复大面积的，尤其是承力部位的骨缺损。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够控制释放中药的骨修复支架材料，可维持植入局部较长时间内有效的药物浓度，同时为细胞的长入和新骨的形成提供适宜的三维空间和稳定力学支撑，从而更好的适应和满足临床要求。

本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料，包括负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊、胶原以及辅料，以共混或共聚的方式组成骨修复支架材料；所述的特定功能中药是具有改善局部血液循环、促进骨折愈合或治疗骨科疾病功能的单味中药或无禁忌配伍的复方中药；所述的生物活性无机纳米粉体与特定功能中药的重量比为99∶1～50∶50；所述的复合微囊中，聚合物与生物活性无机粉体的混合比例为重量比1∶99～50∶50；所述的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊与胶原的重量比为97∶3～60∶40；所述的辅料与胶原重量比为1∶99～10∶90。

所述的特定功能中药选自：天然中药成分或天然成分提取物形式的淫羊藿提取物、骨碎补提取物、续断提取物、川芎提取物、巴戟天提取物、土鳖虫提取物、丹参提取物、黄芪多糖、鹿茸多肽中的一种或一种以上的组合。

上述天然中药成分或天然成分提取物都是已经商品化的产品，例如，淫羊藿提取物可购自陕西禾博天然产物有限公司，骨碎补提取物可购自泽朗医药科技开发有限公司，续断提取物可购自陕西华天生物工程有限公司，川芎提取物可购自咸阳航空一六八生物工程有限公司，巴戟天提取物可购自陕西森弗生物技术有限公司，土鳖虫提取物可购自陕西森弗生物技术有限公司，丹参提取物可购自西安鸿生生物技术有限公司，黄芪多糖可购自西安绿达生物化工有限公司，鹿茸多肽的提取方法可参见已有文献(王丰，梅子青，周秋丽，王本祥.鹿茸多肽的分离纯化及药理活性.吉林大学学报(理学版)，2003，41：111-114.)的方法获得。

所述的生物活性无机纳米粉体包括纳米磷酸三钙、纳米羟基磷灰石、纳米碳酸羟基磷灰石、纳米含氟磷灰石、生物活性玻璃及它们之间的复合粉体中的至少一种，粉体粒径范围为50～400nm。

所述的作为负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体或聚合物的复合微囊的壁材选自以下聚合物：聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚羟基丁酸酯、聚丙基纤维素、乙基纤维素、明胶或壳聚糖系列中一种。

所述的胶原是从牛跟腱上提取的I型胶原或从牛皮上提取的I型胶原，如广州创尔生物技术有限公司生产的I型牛筋腱胶原蛋白、上海其胜生物制剂有限公司生产的I型胶原蛋白等。

所述的辅料选自透明质酸、磷酸丝氨酸等。

本发明还提供了一种可控释中药的骨修复支架材料的制备方法。

本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料的制备方法，包括以下步骤：

A.将生物活性无机纳米粉体与特定功能中药按重量比99∶1～50∶50充分混匀，然后将上述混合物加入至聚合物溶液中，聚合物和生物活性无机粉体的混合比例为重量比1∶99～50∶50，采用溶剂蒸发法制备成粒径为100～400μm的载药复合微囊，即得负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊；

B.将上述载药复合微囊加入到酸溶的胶原溶液中，同时加入辅料，经过交联、冷冻干燥即得可控释中药的骨修复支架材料；其中，所述的生物活性无机纳米粉体或聚合物的复合微囊与胶原的重量比为97∶3～60∶40；所述的辅料与胶原重量比为1∶99～10∶90。

所述的辅料选自透明质酸、磷酸丝氨酸等。

所述的步骤B中，包括以下步骤：

a.混合：将载药复合微囊按照重量比97∶3～60∶40的比例加入到乙酸溶解的胶原溶液中，同时加入辅助材料，辅助材料与胶原的重量比为1∶99～10∶90，均匀搅拌；

b.交联：以乙撑磺酸(MES)为缓冲剂，调pH值为5.5；在混合溶液中加入交联剂对溶液进行交联处理，所使用交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入量为1～5mg/ml；将混合物在4 ℃放置24小时进行交联反应；

c.冷冻干燥：交联反应后，置入-80℃冰箱冷冻24小时，进行冷冻干燥处理直至完全去除溶剂，蒸馏水冲洗数次，再次冷冻干燥即可获得可控释中药的骨修复支架材料。

本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料，与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明以特定的传统中医药代替昂贵的骨形态发生蛋白(BMP-2)等生长因子，具有来源广泛，理化性能稳定，易存储等优点，并大大降低医疗成本；

(2)本发明从材料组成和结构上进行仿生设计，具有更优良的生物活性和生物相容性。

采用本发明的制备方法，可以制备孔径尺寸在10～200μm、且孔内部相互贯通的骨修复支架材料，生物活性无机纳米粉体既是药物载体，又可提高支架材料的生物力学性能；该骨修复支架材料的内部复合有特定功效中药，且药物分布均匀，随着材料的降解药物可以逐步释放出来。该材料具有适宜的强度和优良的生物相容性，具有广阔的骨修复临床应用前景。

具体实施方式

实施例一：

以无水乙醇为介质，将纳米羟基磷灰石粉体和淫羊藿提取物(购自陕西禾博天然产物有限公司，主要成分是淫羊藿苷)按重量比94/6充分混匀，冷冻干燥后，备用。将5g上述粉体加入到已溶解有5g聚乳酸的二氯甲烷溶液中，超声波充分分散混悬液，而后将混悬液加入到100ml 1％明胶溶液中，35℃水浴强力搅拌(1500r/min)5h，微孔过滤三次，蒸馏水洗涤5次，冷冻干燥，获得粒径100～400μm的载药复合微囊；取上述载药复合微囊5g加入到100ml含0.5～2wt％胶原蛋白的乙酸溶液中，并加入辅助材料如透明质酸0.5～1g，均匀搅拌后以乙撑磺酸(MES)为缓冲剂，调pH值为5.5；在混合溶液中加入交联剂对溶液进行交联处理，所使用交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入量为1～5mg/ml。将混合物在4℃放置24小时进行交联反应。交联反应后，置入-80℃冰箱冷冻24小时，进行冷冻干燥处理直至完全去除溶剂，蒸馏水冲洗数次，再次冷冻干燥即可获得本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料。

实施例二：

以无水乙醇为介质，将纳米羟基磷灰石粉体和骨碎补提取物(购自泽朗医药科技开发有限公司)按重量比95/5充分混匀，冷冻干燥后，备用。将5g上述粉体加入到已溶解有5g聚乳酸的二氯甲烷溶液中，超声波充分分散混悬液，而后将混悬液加入到100ml 1％明胶溶液中，35℃水浴强力搅拌(1500r/min)5h，微孔过滤三次，蒸馏水洗涤5次，冷冻干燥，获得粒径100～400μm的载药复合微囊；取上述载药复合微囊5g加入到100ml含0.5～2wt％胶原蛋白的乙酸溶液中，并加入辅助材料如透明质酸0.5～1g，均匀搅拌后以乙撑磺酸(MES)为缓冲剂，调pH值为5.5；在混合溶液中加入交联剂对溶液进行交联处理，所使用交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入量为1～5mg/ml。将混合物在4℃放置24小时进行交联反应。交联反应后，置入-80℃冰箱冷冻24小时，进行冷冻干燥处理直至完全去除溶剂，蒸馏水冲洗数次，再次冷冻干燥即可获得本发明所述的可控释中药的骨修复支架材料。

实施例三：淫羊藿苷-壳聚糖/羟基磷灰石(CS/HA)复合材料的性能研究

(一)淫羊藿苷-CS/HA复合材料的细胞相容性

采用材料浸提液法和直接接触法对淫羊藿苷-CS/HA支架的生物相容性进行评价。采用不同组别的材料浸提液和普通DMEM培养低密度接种的hBMSCs 48h，与对照组比较，CS/HA组并未降低hBMSCs的增殖活性，说明CS/HA复合材料本身无细胞毒性；3个剂量的淫羊藿苷-CS/HA组不同程度地降低了hBMSCs的增殖活性，且与载药剂量相关。高密度接种细胞后，其增殖活性受到抑制，采用3种淫羊藿苷材料浸提液培养hBMSCs 10d，细胞内ALP含量显著增加了7～9倍，说明细胞正向成骨细胞分化。与此同时，扫描电镜观察亦发现：接种于CS/HA复合材料上的细胞呈三角形、细长梭形等形态，细胞呈散在性生长，其表面光滑，细胞外基质分泌不明显；而接种于3种剂量的淫羊藿苷-CS/HA复合材料上的细胞呈现出多种不规则形态，聚集生长，细胞表面可见大量细小颗粒分泌，聚集生长的细胞周围可见钙化结节样结构形成。

(二)淫羊藿苷-CS/HA复合材料的体外释药行为

对药物进行良好的缓/控释是载药支架材料研究的重要方面，无论是采取物理吸附、包裹，还是表面改性，均是为了在局部维持有效药物浓度，从而更好地诱导组织再生。通过标准曲线换算出每次释药量，并将结果按释药百分率累积得到：释药初期(0～3天)，药物从支架材料中爆发性地释放出来，约达载药量的25％；而后释药速度迅速下降，至第20天约有40％-60％左右的药物释出，之后以低速持续释放，90天后仍有部分药物存留于支架材料中，这说明淫羊藿苷-CS/HA复合材料具有良好的控释效果。

(三)淫羊藿苷-CS/HA复合材料的骨修复性能研究

取60只雄性新西兰大白兔(购于南方医院实验动物中心)，清洁级，平均体重2.0kg，肌注速眠新麻醉后，于右侧桡骨中段截骨，制作长度为1.5cm的骨缺损模型，将CS/HA和载10-7、10-6、10-5mol淫羊藿苷-CS/HA复合材料随机植入骨缺损处(12样本/组)，骨缺损模型组不植入材料。

放射性核素骨扫描(ECT)检查：术后4周各组随机选取4只动物于耳缘静脉注射99mTc-MDP，5MBq/kg体重，3小时后置单光子核素扫描仪(Millennium VG-8型，美国GE公司)上检测骨缺损部位99mTc-MDP浓聚情况。采集条件：平面静态，矩阵256×256，放大倍数2，计数500K。采集结束后在图像上选取相同面积的感兴趣区域(ROI)进行定量计数，ROI均值＝计数/面积。

X线检查：各时间点处死动物后收集右前臂尺桡骨进行拍片(Polydoros 100 X光机，德国Siemens公司)，摄片条件：电压40kV，电流50mA，曝光时间0.2秒。

骨密度(BMD)检查：取各组术后12周标本行骨密度检查(XR-46双能骨密度仪，美国NORLAND公司)，于电脑上选取桡骨缺损区域并计算该区域的骨矿含量(BMC)，BMD(g/cm2)＝BMC/选取面积。

组织学观察：术后4、8、12周随机选取4只动物处死，组织样本经固定、脱钙、切片后行HE染色观察。

兔桡骨骨缺损模型是公认的骨缺损模型之一。从本研究的模型组来看，骨缺损部位自身修复能力低下，4～8周两断端骨髓腔逐渐出现闭合，12周时髓腔已完全封闭形成骨缺损。ECT是检测早期骨形成的敏感指标，通过扫描99mTc-MDP在局部的浓聚密度可直接反映局部的成骨情况。选择在第4周进行ECT检测，结果表明：4个材料植入组的ECT值均显著高于骨缺损模型组(P＜0.001)，载药量为10-6mol和10-5mol的淫羊藿苷-CS/HA组显著高于单纯CS/HA植入组(P＜0.001)。在第4周的X线检查亦表明，植入淫羊藿苷-CS/HA材料可观察到明显的骨痂桥接断端，这充分说明淫羊藿苷-CS/HA复合材料具有早期诱导成骨性能。后续的X线检查进一步表明：植入8周后，骨痂大量生长，骨缺损基本愈合；12周后髓腔再通，骨愈合进入塑形期。用BMD对骨修复12周的情况进行了检测，4个材料植入组的BMD值均显著高于骨缺损模型组(P＜0.001)，载药量为10-6mol和10-5mol的淫羊藿苷-CS/HA组显著高于单纯CS/HA植入组(P＜0.001)。综合各期影像学检测结果发现：载淫羊藿苷-CS/HA复合材料的骨修复速度优于单纯CS/HA复合材料。

从组织学切片的结果来看，CS/HA植入4周，支架材料部分降解，内部孔隙结构消失，材料中央有炎性细胞浸润，周围可见纤维组织形成；8周后，材料大部降解，纤维和部分类软骨组织沿材料爬行桥接；到12周时，材料基本由软骨组织取代，残留的材料被分割包裹，骨缺损处主要由新生的软骨和骨组织填充。淫羊藿苷-CS/HA植入骨缺损后，材料的降解速度随载药剂量的增加而明显加快，4周时材料即发生明显的崩解、碎裂，在其周围可见有大量新生软骨形成，并逐渐向材料的中央长入；8周时材料进一步降解，被分割的材料间隙有大量软骨组织形成，部分发生骨化；至12周，材料完全降解，软骨被骨组织替代，新生的骨组织排列紊乱，其中央可见细小的骨髓腔结构。

Claims (1)

1.可控释中药的骨修复支架材料，其特征在于：包括负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊、胶原以及辅料，以共混或共聚的方式组成骨修复支架材料；

所述的特定功能中药是具有改善局部血液循环、促进骨折愈合或治疗骨科疾病功能的单味中药或无禁忌配伍的复方中药；所述的特定功能中药选自：天然中药成分或天然成分提取物形式的淫羊藿提取物、骨碎补提取物、续断提取物、川芎提取物、巴戟天提取物、土鳖虫提取物、丹参提取物、黄芪多糖、鹿茸多肽中的一种或一种以上的组合；

所述的生物活性无机纳米粉体包括纳米磷酸三钙、纳米羟基磷灰石、纳米碳酸羟基磷灰石、纳米含氟磷灰石、生物活性玻璃及它们之间的复合粉体中的至少一种，粉体粒径范围为50～400nm；

所述的作为负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体或聚合物的复合微囊的壁材选自以下聚合物：聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚羟基丁酸酯、聚丙基纤维素、乙基纤维素、明胶或壳聚糖系列中一种；

所述的生物活性无机纳米粉体与特定功能中药的重量比为99：1～50：50；

所述的复合微囊中，聚合物与生物活性无机粉体的混合比例为重量比1：99～50：50；

所述的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊与胶原的重量比为97：3～60：40；

所述的辅料与胶原重量比为1：99～10：90。

2．根据权利要求1所述的可控释中药的骨修复支架材料，其特征在于：所述的胶原是从牛跟腱上提取的Ⅰ型胶原或从牛皮上提取的Ⅰ型胶原。

3．根据权利要求1所述的可控释中药的骨修复支架材料，其特征在于：所述的辅料选自透明质酸、磷酸丝氨酸。

4．如权利要求1所述的可控释中药的骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A．将生物活性无机纳米粉体与特定功能中药按重量比99：1～50：50充分混匀，然后将上述混合物加入至聚合物溶液中，聚合物和生物活性无机粉体的混合比例为重量比1：99～50：50，采用溶剂蒸发法制备成粒径为100～400μm的载药复合微囊，即得负载特定功能中药的生物活性无机纳米粉体/聚合物复合微囊；

B．将上述载药复合微囊加入到酸溶的胶原溶液中，同时加入辅料，经过交联、冷冻干燥即得可控释中药的骨修复支架材料；其中，所述的生物活性无机纳米粉体或聚合物的复合微囊与胶原的重量比为97：3～60：40；所述的辅料与胶原重量比为1：99～10：90。

5．根据权利要求4所述的可控释中药的骨修复支架材料的制备方法，其特征在于：所述的辅料选自透明质酸、磷酸丝氨酸。

6．根据权利要求4所述的可控释中药的骨修复支架材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，包括以下步骤：

a. 混合：将载药复合微囊按照重量比97：3～60：40的比例加入到乙酸溶解的胶原溶液中，同时加入辅助材料，辅助材料与胶原的重量比为1：99～10：90，均匀搅拌；

b. 交联：以乙撑磺酸（MES）为缓冲剂，调pH值为5.5；在混合溶液中加入交联剂对溶液进行交联处理，所使用交联剂为1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），加入量为1～5mg/ml；将混合物在4℃放置24小时进行交联反应；

c. 冷冻干燥：交联反应后，置入-80℃冰箱冷冻24小时，进行冷冻干燥处理直至完全去除溶剂，蒸馏水冲洗数次，再次冷冻干燥即可获得中药控释功能骨修复支架材料。