CN107789668A - 具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料及其制备方法，所述骨修复材料由上至下依次由骨密质层、中间层和骨松质层三层结构组成，所述骨密质层是采用含有2～3wt％的I型胶原蛋白、2～3wt％氧化石墨烯以及0.2～0.3wt％纳米羟基磷灰石的乙酸溶液浇筑到模具后冻干形成；所述中间层是采用含有1～2wt％I型胶原蛋白、1～2wt％氧化石墨烯以及0.1～0.2wt％纳米羟基磷灰石的乙酸溶液浇筑到模具后冻干形成；骨松质层是由含有0.5～1wt％I型胶原蛋白、0.5～1wt％纳米羟基磷的乙酸溶液浇筑到模具后冻干形成。本发明具有多层结构，可应用于不同深度的骨缺损上，可以使骨修复过程加快，并可依据临床上骨缺损的深度和范围个性化定制。

Description

具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及人工骨修复材料领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石-氧化石墨烯-胶原蛋白复合形成的具有多层结构的仿生胶蛋白骨修复材料及其制备方法。
背景技术
迄今为止，创伤、感染和肿瘤切除造成的大块骨缺损的修复是国内外临床医学长期以来的一个难题。自体骨来源有限，且患者可能需要承受额外的痛苦。其他骨修复材料，如同种异体骨或异种骨则容易导致潜在感染及免疫排斥等问题。人工骨由于和天然骨结构差异较大，仍存在许多不足。因此，人工骨修复材料从成分和结构方面仿生，能大大提高其应用价值。
胶原蛋白(Collagen)是动物细胞合成并分泌的一种蛋白质，广泛存在动物骨，软骨，皮肤及其他结缔组织中。I型胶原蛋白是人体所含各种胶原蛋白最丰富的一种。胶原蛋白具有良好的生物学性质，如低免疫原性，良好的生物相容性、可降解性，并可调节细胞的增殖，粘附和分化等等，已经广泛应用于生物医学材料领域。无论在软/硬组织损伤的修复，胶原蛋白具有显著的促进组织再生作用。但单纯的胶原蛋白无论从强度还是降解速度都难以满足人工骨材料的要求，因此，将胶原和其他生物材料复合，是改善其性能的途径之一。
羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是动物骨骼和牙齿的主要无机成分，约占总质量的60％以上，人工HA与天然HA相似，植入体内后，钙和磷会游离出材料表面被身体组织吸收，并生长出新的组织。因此，羟基磷灰石陶瓷是目前公认的具有良好的生物相容性和骨诱导性的材料。通过纳米技术合成的纳米羟基磷灰石(nHA)是体积更小，表面积更大的具有可控形态的羟基磷灰石，有研究证明羟磷灰石的晶粒越细，生物活性越高。但纳米羟基磷灰石通常以粉末状存在，不易塑性，缺乏黏连性，其应用受到一定限制。
氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)是石墨烯经过高度氧化的产物，是一种2维单层纳米材料，本质上是碳原子以sp2杂化的形式组成的蜂窝状单层碳原子晶体，其表面和边缘都连接着很多含氧官能团。氧化石墨烯由于有良好的机械性能，常用于与高分子材料复合，以增强支架材料的机械性能。另外，氧化石墨烯拥有良好的生物相容性，已有文献报道GO具有促进细胞粘附和促进细胞因子聚集的作用，并能介导干细胞增殖和分化，因此其在组织工程和再生医学领域都有着广泛的应用前景。
骨质的结构包括骨密质和骨松质，前者质地坚硬，耐压性大，位于骨的外层，后者呈海绵状，硬度和抗压能力较弱。因此，单一结构的骨修复材料难以做到骨的仿生。纳米羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料是目前常见的骨修复材料，但大多材料结构单一，无法做到对骨结构的仿生。此外，由于羟基磷灰石不易分散，难以与胶原蛋白形成有效连接。再者，传统羟基磷灰石-胶原蛋白材料的机械强度仍然较低，不足以满足骨修复材料的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有多层结构的仿生胶蛋白骨修复材料及其制备方法，该仿生胶蛋白骨修复材料是由I型胶原蛋白、纳米羟基磷灰石和氧化石墨烯为原料，经过不同的配比，逐步构建出骨密质层，中间层，骨松质三层结构的仿生骨修复支架，该支架具有3维多孔结构，在体内可完全降解。
本发明提供的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料，其特征在于：所述骨修复材料由上至下依次由骨密质层、中间层和骨松质层三层结构组成，其中，所述骨密质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白20～30份，纳米羟基磷灰石20～30份和氧化石墨烯2～3份；
中间层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白10～20份，纳米羟基磷灰石10～20份和氧化石墨烯1～2份；
骨松质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白5～10份和纳米羟基磷灰石5～10份。
本发明较优的技术方案：所述骨修复材料三层结构的总厚度为3～9mm,每层厚度分别为1～3mm。
本发明提供的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取一定质量的I型胶原蛋白、氧化石墨烯以及纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L的乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为2～3wt％，纳米羟基磷灰石的含量为2～3wt％，氧化石墨烯的含量为0.2～0.3wt％的均质A溶液；
(2)取一定质量的I型胶原蛋白、氧化石墨烯以及纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为1～2wt％，纳米羟基磷灰石含量为1～2wt％，氧化石墨烯的含量为0.1～0.2wt％的均质B溶液；
(3)取一定质量的I型胶原蛋白和纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为0.5～1wt％，纳米羟基磷灰石的含量为0.5～1wt％的均质C溶液；
(4)将步骤(1)中配制的A液缓慢浇至骨修复材料模具中，至仿生胶原蛋白骨修复材料中骨密质层要求高度，并将其连通模具一起放入4～6℃的条件下冷藏1～2h后，之后取出，继续浇入步骤(2)中配制的B液，B液的浇入高度为仿生胶原蛋白骨修复材料的中间层要求高度，浇入完成后在同样条件下冷藏后取出，继续浇入步骤(3)中配制的C液，C液的浇入高度为仿生胶原蛋白骨修复材料的骨松质层要求高度，C液浇入完成后，再次置于4～6℃的条件冷藏1～2h；
(5)将步骤(4)中浇筑好三种溶液的模具置入-20～-40℃条件下冷冻24～48h后，再置于-45～-50℃条件下继续冷冻24～48h形成的多孔支架，然后将形成的多孔支架从模具中取出，并用浓度为95％乙醇漂洗2～3次；
(6)现场配制交联液，将一定质量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别添加到浓度为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀配制成EDC质量浓度为0.5～1％、NHS的质量浓度为0.2～0.4％的交联液；
(7)将步骤(5)中冻干的多孔支架在常温条件下浸泡于步骤(6)中配制的交联液中，浸泡至少24h后，将去取出冲洗干净后再次冷冻后进行消毒即得到所述仿生胶原蛋白骨修复材料。
本发明较优的技术方案：所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的超声搅拌的超声条件为：功率为180w,搅拌强度20～50％。
本发明较优的技术方案：所述步骤(4)中A、B、C液的浇入高度分别为1～3mm，其总高度为3～9mm。
本发明较优的技术方案：所述步骤(7)中在交联液中浸泡后的多孔支架采用纯水冲洗2～3次后先置入-20℃的条件下冷冻24～48h后，再置入-45～-50℃继续冷冻24～48h，取出用环氧乙烷进行消毒。
本发明较优的技术方案：所述步骤(4)中的骨修复材料模具是采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)材质制成，其形状为中空圆柱腔体。
本发明中的原料纳米羟基磷灰石和氧化石墨烯均为可以直接购买的产品，其它化学药品也均为可以直接购买的产品。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用的I型胶原蛋白，纳米羟基磷灰石，氧化石墨烯为原料，经过不同的配比，逐步构建出骨密质层，中间层，骨松质三层结构的仿生骨修复支架，不同层具有不同的孔径、孔隙率及机械强度，其中骨密质层孔隙率约为60％，弹性模量约为20MPa,，中间层孔隙率约为70％，弹性模量约为10MPa，骨松质孔隙率约为80％，弹性模量约为5MPa，可以应用于不同深度的骨修复，并可在体内可完全降解；
(2)本发明中制备的骨修复材料由于氧化石墨烯的加入使得机械强度进一步增加，并增加材料的生物相容性及骨诱导性；
(3)本材料具有多层结构，是骨结构的仿生材料，应用于不同深度的骨缺损上，可以使骨修复过程加快，并可依据临床上骨缺损的深度和范围个性化定制。
附图说明
图1是本发明中修复材料的结构示意图；
图2是本发明中修复材料的电镜扫描图；
图3是本发明中修复材料的弹性模量检测结果显示图；
图4是本发明中修复材料接种细胞进行培养染色后在共聚焦显微镜下观察活细胞的分布图。
图中：1—骨密质层，2—中间层，3—骨松质层。
具体实施方式
为了使本发明所述内容更加容易理解，现结合具体实施方案对本发明所述技术方案做进一步说明，但不仅限于此。
如图1所示的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料，其特征在于：所述骨修复材料由上至下依次由骨密质层、中间层和骨松质层三层结构组成，其中，所述骨密质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白20～30份，纳米羟基磷灰石20～30份和氧化石墨烯2～3份；
中间层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白10～20份，纳米羟基磷灰石10～20份和氧化石墨烯1～2份；
骨松质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白5～10份和纳米羟基磷灰石5～10份。
所述骨修复材料三层结构的总厚度为3～9mm,每层厚度分别为1～3mm。
实施例一，一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于：
(1)取一定质量的猪皮来源I型胶原蛋白、单层氧化石墨烯固体以及纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L的乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度20～50％，得到I型胶原蛋白的含量为3wt％，纳米羟基磷灰石的含量为3wt％，氧化石墨烯的含量为0.2wt％的均质A溶液；
(2)取一定质量的I型胶原蛋白、单层氧化石墨烯固体以及纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度30％，得到I型胶原蛋白的含量为2wt％，纳米羟基磷灰石含量为2wt％，氧化石墨烯的含量为0.1wt％的均质B溶液
(3)取一定质量的I型胶原蛋白和纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度30％，得到I型胶原蛋白的含量为1wt％，纳米羟基磷灰石的含量为1wt％的均质C溶液
(4)将步骤(1)中配制的A液缓慢浇至骨修复材料模具中，至骨修复材料模具的1/3高度，然后将其连通模具一起放入4～6℃的条件下冷藏2h后，将其取出继续浇入步骤(2)中配制的B液，B液的浇入高度为骨修复材料模具的2/3，浇入完成后在同样条件下冷藏后取出，继续浇入步骤(3)中配制的C液至骨修复材料模具顶部，浇筑完后再在同样的条件下冷藏；
(5)将步骤(4)中浇筑好三种溶液的模具置入-20℃条件下冷冻24h后，再置于-50℃条件下继续冷冻24h形成的多孔支架，然后将形成的多孔支架从模具中取出，并用浓度为95％乙醇漂洗2～3次；
(6)现场配制交联液，将一定质量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别添加到浓度为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀配制成EDC质量浓度为1％、NHS的质量浓度为0.4％的交联液；
(7)将步骤(5)中冻干的多孔支架在常温条件下浸泡于步骤(6)中配制的交联液中，浸泡至少24h后，将去取出冲洗干净后再次冷冻后进行消毒即得到所述仿生胶原蛋白骨修复材料。
实施例二，一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于：
(1)取一定质量的来源I型胶原蛋白、单层氧化石墨烯固体以及纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L的乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度50％，得到I型胶原蛋白的含量为2wt％，纳米羟基磷灰石的含量为2wt％，氧化石墨烯的含量为0.2wt％的均质A溶液；
(2)取一定质量的I型胶原蛋白、单层氧化石墨烯固体以及纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度50％，得到I型胶原蛋白的含量为1.5wt％，纳米羟基磷灰石含量为1.5wt％，氧化石墨烯的含量为0.1wt％的均质B溶液
(3)取一定质量的I型胶原蛋白和纳米羟基磷灰石固体溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌30min，其超声搅拌的条件为：功率为180w,搅拌强度50％，得到I型胶原蛋白的含量为1wt％，纳米羟基磷灰石的含量为1wt％的均质C溶液
(4)将步骤(1)中配制的A液缓慢浇至骨修复材料模具中，至骨修复材料模具的1/3高度，然后将其连通模具一起放入4℃的条件下冷藏1～2h后，将其取出继续浇入步骤(2)中配制的B液，B液的浇入高度为骨修复材料模具的2/3，浇入完成后在同样条件下冷藏后取出，继续浇入步骤(3)中配制的C液至骨修复材料模具顶部，浇筑完后再在同样的条件下冷藏；
(5)将步骤(4)中浇筑好三种溶液的模具置入-20℃条件下冷冻24h后，再置于-50℃条件下继续冷冻24h形成的多孔支架，然后将形成的多孔支架从模具中取出，并用浓度为95％乙醇漂洗2～3次；
(6)现场配制交联液，将一定质量的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)分别添加到浓度为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀配制成EDC质量浓度为1％、NHS的质量浓度为0.4％的交联液；
(7)将步骤(5)中冻干的多孔支架在常温条件下浸泡于步骤(6)中配制的交联液中，浸泡至少24h后，将去取出冲洗干净后再次冷冻后进行消毒即得到所述仿生胶原蛋白骨修复材料。
实验1：本申请发明人将实施例1和实施例2中制备的材料及通过电镜扫描，其观察的表面微观结构如图2所示，可见明显的三层结构(白色虚线分隔)，电镜扫描图可视多层结构拥有不同的微观结构和孔隙率；发明人并对3层结构中的每层分别进行弹性模量检测，发现骨密质层的弹性模量达到20MPa左右，中间层达到10MPa,骨松质层达到5MPa左右，拥有仿生的骨组织的力学强度梯度，具体如图3所示。
实验2：本申请发明人将实施例1中制备的多层支架材料消毒后裁剪成大小合适的片状，放入12孔板中，每个材料接种大约1*106个的第四代大鼠ADSC细胞，在37度，5％CO2的条件下孵育2h后将材料移至含有新鲜全培养基中，然后每1d换液，于第7天行FDA/PI染色。并在染色后通过共聚焦显微镜观察材料上活细胞的数量和分布。其观察结果如图4所示，发现绿色荧光所示的活细胞在多层复合骨修复材料上生长良好，其数量较多。

Claims (7)

1.一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料，其特征在于：所述骨修复材料由上至下依次由骨密质层、中间层和骨松质层三层结构组成，
其中，所述骨密质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白20～30份，纳米羟基磷灰石20～30份和氧化石墨烯2～3份；
中间层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白10～20份，纳米羟基磷灰石10～20份和氧化石墨烯1～2份；
骨松质层的组成成分按重量份数计包括：I型胶原蛋白5～10份和纳米羟基磷灰石5～10份。
2.根据权利要求1所述的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料，其特征在于：所述骨修复材料三层结构的总厚度为3～9mm,每层厚度分别为1～3mm。
3.一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)取一定质量的I型胶原蛋白、氧化石墨烯以及纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L的乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为2～3wt％，纳米羟基磷灰石的含量为2～3wt％，氧化石墨烯的含量为0.2～0.3wt％的均质A溶液；
(2)取一定质量的I型胶原蛋白、氧化石墨烯以及纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为1～2wt％，纳米羟基磷灰石含量为1～2wt％，氧化石墨烯的含量为0.1～0.2wt％的均质B溶液；
(3)取一定质量的I型胶原蛋白和纳米羟基磷灰石溶于0.1mol/L乙酸溶液中，并在冰浴下利用超声探头辅助搅拌10～30min，得到I型胶原蛋白的含量为0.5～1wt％，纳米羟基磷灰石的含量为0.5～1wt％的均质C溶液；
(4)将步骤(1)中配制的A液缓慢浇至骨修复材料模具中，至仿生胶原蛋白骨修复材料中骨密质层要求高度，并将其连通模具一起放入4～6℃的条件下冷藏1～2h后，取出模具继续浇入步骤(2)中配制的B液，B液的浇入高度为仿生胶原蛋白骨修复材料的中间层要求高度，浇入完成后在同样条件下冷藏，然后取出，继续浇入步骤(3)中配制的C液，C液的浇入高度为仿生胶原蛋白骨修复材料的骨松质层要求高度，C液浇入完成后，再次置于4～6℃的条件冷藏1～2h；
(5)将步骤(4)中浇筑好三种溶液的模具置入-20～-40℃条件下冷冻24～48h后，再置于-45～-50℃条件下继续冷冻24～48h形成的多孔支架，然后将形成的多孔支架从模具中取出，并用浓度为95％乙醇漂洗2～3次；
(6)现场配制交联液，将一定质量的EDC和NHS分别添加到浓度为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀配制成EDC质量浓度为0.5～1％、NHS的质量浓度为0.2～0.4％的交联液；
(7)将步骤(5)中冻干的多孔支架在常温条件下浸泡于步骤(6)中配制的交联液中，浸泡至少24h后，将去取出冲洗干净后再次冷冻后进行消毒即得到所述仿生胶原蛋白骨修复材料。
4.根据权利要求3所述的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的超声搅拌的超声条件为：功率为180w,搅拌强度20～50％。
5.根据权利要求3所述的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中A、B、C液的浇入高度分别为1～3mm，其总高度为3～9mm。
6.根据权利要求3所述的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中在交联液中浸泡后的多孔支架采用纯水冲洗2～3次后先置入-20℃的条件下冷冻24～48h后，再置入-45～-50℃继续冷冻24～48h，取出用环氧乙烷进行消毒。
7.根据权利要求3所述的一种具有多层结构的仿生胶原蛋白骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的骨修复材料模具是采用PDMS材质制成，其形状为中空圆柱腔体。
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