CN109568671A - 一种水凝胶负载细胞的3d骨修复支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架，它是由含骨髓间充质干细胞的甲基丙烯酸酐化明胶溶液经交联制备而成。本发明制备的水凝胶负载细胞的3D骨修复支架具有良好的力学性能和生物相容性；植入骨缺损部位后可有效促进骨质和血管的再生，同时可以提高骨缺损部位的力学强度，能有效促进骨缺损的修复，具有良好的促骨再生能力，具有巨大的应用潜力。

Description

一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架及其制备方法。

背景技术

人体骨组织不仅能够支撑人体结构，并保护人体器官，维持生命活动；同时能够牵引肌肉产生运动，完成生活中的各项活动。骨是人体重要的组成部分。但在生活中，人们常因为疾病或意外伤害造成骨缺损，给身体造成严重的伤害，也影响生活质量。

传统的金属、陶瓷等骨修复材料的力学性能与人体骨相差甚远，植入后容易造成应力屏蔽，导致周围骨组织松动。水凝胶因其可根据原料组分，改变其理化性能，得到性能较优异的骨修复材料，得到广泛研究。但其同时也面临一个问题，即缺乏一定的生物活性，对于骨缺损修复较慢。

因此，研究一种具有优良力学性能，生物相容性好，具有生物活性，对骨缺损修复快的水凝胶骨修复材料具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架及其制备方法。

本发明提供了一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架，它是由含骨髓间充质干细胞的甲基丙烯酸酐化明胶溶液经交联制备而成。

进一步地，所述甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，骨髓间充质干细胞的密度为2x10⁶个/mL，所述甲基丙烯酸酐化明胶溶液的浓度是5％(w/v)。

进一步地，所述交联为光交联。

进一步地，所述光交联使用的交联剂为Igucure500。

进一步地，所述交联剂的用量为甲基丙烯酸酐化明胶溶液的0.25％(w/v)。

进一步地，所述光交联为紫外光交联。

进一步地，所述甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法如下：

甲基丙烯酸酐与明胶经过反应、透析和冻干，即得；

其中，甲基丙烯酸酐与明胶的比为5:8(v/w)。

进一步地，所述甲基丙烯酸酐与明胶的反应为将明胶溶于浓度为10w/v％的CB缓冲液溶液中，40～60℃搅拌至形成均匀的明胶溶液，明胶溶液的浓度为8％(w/v)；并在此条件下将甲基丙烯酸酐逐滴添加到明胶溶液中，反应2～4小时，即得甲基丙烯酸酐化明胶溶液；

和/或，所述透析为将制备得到的甲基丙烯酸酐化明胶溶液置于透析袋中，透析8～12天，每天早晚各换一次水；其中，透析袋的截留分子量为12000～14000。

本发明还提供了一种制备前述的骨修复支架的方法，它包括如下步骤：

(1)使用去离子水将甲基丙烯酸酐化明胶配制成浓度为5％(w/v)的甲基丙烯酸酐化明胶溶液，并加入光交联剂，混匀混合，得混合溶液，将混合溶液经过0.22微米滤膜过滤，与骨髓间充质干细胞混匀制成细胞悬液；

(2)根据需要构建骨缺损模型，并根据骨缺损模型制备相应尺寸的PDMS模具；

(3)将细胞悬液加入PDMS模具中并给予紫外光照射，交联后，即得。

进一步地，步骤(1)中，交联剂的用量为甲基丙烯酸酐化明胶溶液的0.25％(w/v)；

和/或，步骤(1)中，细胞悬液中骨髓间充质干细胞的密度为2x10⁶个/mL。

本发明中“w/v”是指g/mL，“v/w”是指mL/g。

本发明制备的水凝胶负载细胞的3D骨修复支架(载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架)具有良好的力学性能和生物相容性；植入骨缺损部位后可有效促进骨质和血管的再生，同时可以提高骨缺损部位的力学强度，能有效促进骨缺损的修复，具有良好的促骨再生能力，具有巨大的应用潜力。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出更多其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为水凝胶负载细胞的3D骨修复支架制备及植入骨缺损节段示意图。

图2为水凝胶支架中BMSCs的活/死细胞荧光染色图。

图3为水凝胶支架中BMSCs的活细胞数量占总细胞数量的百分比。

图4为术后第4周和第8周各组修复骨缺损部位的组织学分析图片。

图5为术后第4周和第8周各组修复骨缺损部位新生骨区域占总缺损面积的百分比。

图6为术后第4周和第8周各组修复骨缺损部位新生血管的密度。

图7为术后第4周和第8周各组修复骨缺损部位的抗弯刚度。

图8为术后第4周和第8周各组修复骨缺损部位的极限荷载。

图9为术后第8周各组修复骨缺损部位micro-CT三维重建模型。

图10为术后第8周各组修复骨缺损部位的骨密度。

图11为术后第8周各组修复骨缺损部位的骨量。

具体实施方式

实验例1本发明骨修复支架的制备

本发明骨修复支架的制备如图1所示。

1、甲基丙烯酸酐化明胶的制备

取8g明胶(Gelatin)溶于100mL浓度为10w/v％的CB缓冲液中，置于加热盘并调整温度至50℃，以240rpm转速搅拌1小时直至形成均匀的明胶溶液；在50℃搅拌的条件下将5mL甲基丙烯酸酐逐滴添加到明胶溶液中(转速240rpm)，反应2小时，得到甲基丙烯酸酐化明胶溶液。将制备得到的甲基丙烯酸酐化明胶溶液置于透析袋中，透析袋的截留分子量为12000～14000，透析10天，每天早晚各换一次水。透析结束后，将溶液冻干，即得甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)。

2、本发明载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架的制备

使用去离子水将制备得到的GelMA配制成浓度为5％的GelMA溶液，并加入用量为GelMA溶液0.25％(w/v)的光交联剂(Igucure500)，将GelMA溶液与光交联剂混合均匀，得混合溶液。将混合溶液经过0.22微米滤膜过滤，与BMSCs混匀制成细胞悬液，悬液中细胞的密度为2x10⁶个/mL。根据需要构建骨缺损模型，并根据骨缺损模型制备相应尺寸的PDMS模具，将GelMA-BMSCs细胞悬液加入PDMS模具中并给予UV照射，交联后得到载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架。

以下用试验例的方式来证明本发明的有益效果：

试验例1载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架中BMSCs的活性检测

1、试验方法

将实施例1制备的载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架放入培养基中进行培养，在培养1、3、7和14天时对支架中的BMSCs进行活/死细胞染色，置于显微镜下观察。并分别对支架中活、死细胞进行数量统计，计算出活细胞占总细胞数量的百分比。

2、试验结果

载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架中BMSCs的活/死细胞染色结果如图2(活/死细胞荧光染色图)和图3(活细胞数量占总细胞数量的百分比)所示。活/死细胞染色结果显示载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架中BMSCs的存活率高。在培养1、3、7天时，支架中活细胞的数量逐渐增多，活细胞所占百分比超过90％。结果表明，该GelMA水凝胶支架具有良好的细胞相容性，BMSCs在支架中可以很好地增殖。

试验例2骨缺损模型的构建及生物支架植入

1、试验方法

将SD大鼠随机分为4组(每组16只)：A组为模型对照组；B组为GelMA水凝胶支架组(对照组)；C组为BMSCs组(对照组)；D组为载BMSCs的GelMA水凝胶支架组(实验组)。将大鼠经腹腔注射10％水合氯醛麻醉，清理左后肢毛发，酒精消毒，无菌敷料覆盖。从胫骨后中后方取纵行切口，切开皮下和肌层。用骨锯造出5毫米长的节段性骨缺损。A组直接采用髓内钉逆行固定；B组植入GelMA水凝胶支架，并用髓内钉固定；C组在骨缺损部位注入BMSCs细胞悬液；D组植入载BMSCs细胞的GelMA水凝胶支架，并用髓内钉固定。逐步缝合肌肉、皮下组织和皮肤，无菌操作，避免病原菌感染。术后第4周和第8周取骨缺损区域骨组织进行组织形态学测试、生物力学性能测试及micro-CT检测。

组织形态学测试：取术后第4周和第8周取骨缺损区域骨组织，进行苏木精-伊红染色(HE染色)，并对新生骨及新生血管进行量化分析。试验数据以平均值±SD表示。

生物力学性能测试：术后第4周和第8周，取大鼠的胫骨用于生物力学测试。除去残留的软组织，修整胫骨的末梢至适当的长度，使骨缺损处位于样本的中间，在生物力学测试仪上进行三点弯曲测试(Ruige technology，China)，测量弯曲刚度和极限载荷以评价生物力学性能。试验数据以平均值±SD表示。

micro-CT检测：取术后第8周取骨缺损区域骨组织，进行micro-CT检测，对骨缺损部位进行三维重建，并对骨量和骨密度进行定量分析。试验数据以平均值±SD表示。

2、试验结果

(1)骨缺损再生的组织形态学分析

为了研究载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架如何促进骨再生，分别在术后第4周和第8周进行组织学分析。图4为骨缺损区域骨组织的HE染色结果图，由图4可知，术后第4周和第8周，BMSCs组和载BMSCs的GelMA水凝胶支架组骨缺损区的骨生长旺盛，在再生骨区均观察到新生血管。同时，相比BMSCs组，载BMSCs的GelMA水凝胶支架组有更多的新生骨形成和更成熟的组织结构。相比之下，模型对照组和GelMA水凝胶支架组在骨缺损区仅出现出现少量新骨形成，伴有较多纤维结缔组织生成。

采用Image pro-plus 6.0软件对新生骨及新生血管进行量化分析，新生骨区域按新骨面积/总缺陷面积×100％计算百分比，新生血管密度按新生血管数量/骨缺损面积来测量。结果如图5和图6所示。图5和图6显示，各组新生骨数量和新生血管密度从第4周到第8周均不断增多。各时间点BMSCs组新生骨数量和新生血管密度均明显高于模型对照组和GelMA水凝胶支架组(P<0.01)；而载BMSCs的GelMA水凝胶支架组新生骨数量和新生血管密度均明显高于BMSCs组(P<0.05)。结果表明，本发明制备的骨修复支架具有促新生骨和新生血管生长的能力，即具有良好的促骨再生能力。

(2)生物力学性能测试

生物力学性能测试结果如图7和图8所示。由图7和图8可知，术后第4周时，载BMSCs的GelMA水凝胶支架组的弯曲刚度和极限荷载均显著高于BMSCs组(P<0.05)、模型对照组和GelMA水凝胶支架组(P<0.01)。模型对照组与GelMA水凝胶支架组相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第8周的生物力学性能表现与第4周相似，且载BMSCs的GelMA水凝胶支架组与BMSCs组在弯曲刚度和极限载荷方面的差异更为显著(P<0.01)。试验结果表明，本发明所制备的载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架可提高缺损胫骨的力学强度。

(3)micro-CT检测

在术后第8周对骨缺损区域进行micro-CT检测，并进行三维重建，结果如图9～11所示。图9(micro-CT三维重建模型)结果显示，用载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架进行骨修复的大鼠，骨桥和愈伤组织形成显著优于单独使用BMSCs组、GelMA水凝胶支架组和模型对照组。再生骨骨量(图10)和骨密度(图11)的定量结果与上述一致：载BMSCs的GelMA水凝胶支架组的骨量和骨密度均值都显著高于单独BMSCs组、GelMA水凝胶支架组和对照组(p<0.01)；GelMA水凝胶支架组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。试验结果表明，本发明制备的骨修复支架具有良好的促骨再生能力。

综上，本发明制备的载BMSCs的GelMA水凝胶骨修复支架具有良好的力学性能和生物相容性；植入骨缺损部位后可有效促进骨质和血管的再生，同时可以提高骨缺损部位的力学强度，能有效促进骨缺损的修复，具有良好的促骨再生能力，具有巨大的应用潜力。

Claims (10)

1.一种水凝胶负载细胞的3D骨修复支架，其特征在于：它是由含骨髓间充质干细胞的甲基丙烯酸酐化明胶溶液经交联制备而成。

2.根据权利要求1所述的骨修复支架，其特征在于：所述甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，骨髓间充质干细胞的密度为2x10⁶个/mL，所述甲基丙烯酸酐化明胶溶液的浓度是5％(w/v)。

3.根据权利要求1所述的骨修复支架，其特征在于：所述交联为光交联。

4.根据权利要求3所述的骨修复支架，其特征在于：所述光交联使用的交联剂为Igucure500。

5.根据权利要求4所述的骨修复支架，其特征在于：所述交联剂的用量为甲基丙烯酸酐化明胶溶液的0.25％(w/v)。

6.根据权利要求4所述的骨修复支架，其特征在于：所述光交联为紫外光交联。

7.根据权利要求1所述的骨修复支架，其特征在于：所述甲基丙烯酸酐化明胶的制备方法如下：

甲基丙烯酸酐与明胶经过反应、透析和冻干，即得；

其中，甲基丙烯酸酐与明胶的比为5:8(v/w)。

8.根据权利要求7所述的骨修复支架，其特征在于：

所述甲基丙烯酸酐与明胶的反应为将明胶溶于浓度为10w/v％的CB缓冲液溶液中，40～60℃搅拌至形成均匀的明胶溶液，明胶溶液的浓度为8％(w/v)；并在此条件下将甲基丙烯酸酐逐滴添加到明胶溶液中，反应2～4小时，即得甲基丙烯酸酐化明胶溶液；

和/或，所述透析为将制备得到的甲基丙烯酸酐化明胶溶液置于透析袋中，透析8～12天，每天早晚各换一次水；其中，透析袋的截留分子量为12000～14000。

9.一种制备权利要求1～8任意一项所述的骨修复支架的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)使用去离子水将甲基丙烯酸酐化明胶配制成浓度为5％(w/v)的甲基丙烯酸酐化明胶溶液，并加入光交联剂，混匀混合，得混合溶液，将混合溶液经过0.22微米滤膜过滤，与骨髓间充质干细胞混匀制成细胞悬液；

(2)根据需要构建骨缺损模型，并根据骨缺损模型制备相应尺寸的PDMS模具；

(3)将细胞悬液加入PDMS模具中并给予紫外光照射，交联后，即得。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中，交联剂的用量为甲基丙烯酸酐化明胶溶液的0.25％(w/v)；

和/或，步骤(1)中，细胞悬液中骨髓间充质干细胞的密度为2x10⁶个/mL。