CN115414319A - 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 - Google Patents
携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115414319A CN115414319A CN202210849965.2A CN202210849965A CN115414319A CN 115414319 A CN115414319 A CN 115414319A CN 202210849965 A CN202210849965 A CN 202210849965A CN 115414319 A CN115414319 A CN 115414319A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gel
- msc
- spheres
- gelma
- gel system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 84
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 32
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 32
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims abstract description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 7
- PDNOURKEZJZJNZ-UHFFFAOYSA-N [4-(bromomethyl)phenyl]boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(CBr)C=C1 PDNOURKEZJZJNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- DMQSHEKGGUOYJS-UHFFFAOYSA-N n,n,n',n'-tetramethylpropane-1,3-diamine Chemical compound CN(C)CCCN(C)C DMQSHEKGGUOYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N Terephthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 6
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- -1 TPA compound Chemical class 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009193 crawling Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009689 neuronal regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法：将4‑(溴甲基)苯硼酸和N,N,N',N'‑四甲基‑1,3‑丙二胺在二甲基甲酰胺中油浴搅拌反应；将反应物倒入四氢呋喃中，得到白色沉淀，为具有活性氧响应性的交联剂TPA；取聚乙烯醇滴加成长条状，并逐滴加入TPA，得到外层的活性氧清除凝胶；将甲基丙烯酰化明胶GelMA加入到水中得到GelMA溶液，再加入到MSC球中混合，紫外交联得到携载MSC球的内层GelMA凝胶；将外层的活性氧清除凝胶以包裹的方式包绕在携载MSC球的内层GelMA凝胶，得到双层凝胶体系。本发明还公开了上述方法得到的双层凝胶体系及在制备治疗脊髓损伤的产品中的应用。该双层凝胶体系生物相容性好、力学性质佳、重复性好，具有较好的协同治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于制剂材料制备和再生医学领域，特别涉及携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用。
背景技术
中枢神经系统(CNS)损伤疾病如创伤性脑损伤和脊髓损伤等，会导致损伤局部大量神经细胞、小胶细胞和星形胶质细胞等死亡，进而造成患者神经功能暂时或永久性地失常，引起器官功能障碍、瘫痪甚至死亡。在脊髓损伤发生的急性期，CNS局部缺血、大量细胞死亡、炎症细胞浸润，并在这些过程中产生大量活性氧。这些活性氧会广泛地与蛋白、脂质等发生过氧化反应，最终导致细胞凋亡，进一步加剧损伤。同时，CNS有限的再生能力使脊髓损伤慢性期期难以产生有效的神经元再生、轴突延伸以及功能的恢复。因此，一种在急性期抑制活性氧、促进慢性期的神经再生的疗法对脊髓损伤的治疗具有重要意义。
在化学领域，一些基团如酮缩硫醇、苯硼酸等具有较强的还原性，因而有中和活性氧的功能。同时，通过化学合成的手段可将这些基团修饰成为凝胶的交联剂。基于此制备的凝胶不仅具有三维结构，还具有活性氧清除功能，可应用于再生医学以及活性氧相关的疾病治疗中。
而在再生医学领域，大量研究表明间充质干细胞(MSC)因其来源广泛、低免疫原性、多分化能力、以及较低的伦理争议，在神经再生领域具有很高的治疗潜力。MSC具有强大的旁分泌能力，可分泌多种因子来调节免疫炎症微环境、促进血管新生和神经再生，是其促进再生的主要机制之一。而将MSC通过三维培养的方式制备成MSC三维球可以增加细胞间的通讯，进一步促进MSC的分泌功能，有望进一步提高其疗效。
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)是一种具有良好的生物相容性，快速光敏成胶的凝胶材料，已被广泛应用于再生医学领域。GelMA凝胶多孔隙、良好的力学性质非常适合脊髓损伤的治疗。其植入后不仅可以对局部病灶、坏死区域起到良好的支撑，还可作为一种局部的细胞储库和类细胞外基质用于携载MSC，避免其在植入后流失和死亡，从而保留MSC的治疗活性。如公开号为CN113940949A的中国专利公开了一种负载外泌体的GelMA水凝胶微针及其制备方法和应用。
综上所述，构建一种可同时清除活性氧并携载MSC球的双层凝胶体系对脊髓损伤的具有较好的应用前景和研究意义。目前还未有活性氧清除凝胶、GelMA凝胶以及三维MSC球联合构建移植系统，用于脊髓损伤修复的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法和应用，该双层凝胶体系生物相容性好、力学性质佳、重复性好，对脊髓损伤具有较好的协同治疗效果。
本发明采用如下技术方案：
携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，所述制备方法包括：
(1)将4-(溴甲基)苯硼酸和N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺在二甲基甲酰胺中油浴搅拌反应；
(2)将步骤(1)得到的反应物倒入四氢呋喃中，得到白色沉淀，为具有活性氧响应性的交联剂TPA；
(3)取聚乙烯醇滴加成长条状，并逐滴加入交联剂TPA，得到外层的活性氧清除凝胶；
(4)将GelMA加入到水中得到GelMA溶液，紫外交联得到内层GelMA凝胶，再加入到间充质干细胞MSC球中混合，紫外交联得到携载MSC球的内层GelMA凝胶；
(5)将步骤(3)得到的外层的活性氧清除凝胶以包裹的方式包绕在携载MSC球的内层GelMA凝胶，得到双层凝胶体系。
在步骤(1)中，所述4-(溴甲基)苯硼酸和N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺的投料比为0.5g：0.1g～1g：0.1g，在40～80℃反应16～24h。
在步骤(2)中，采用离心的方式(1000～3000rpm，1～5min)收集沉淀。将产物用10～20mL四氢呋喃清洗3～5次，放入真空干燥箱干燥24～48h即可得到具有活性氧响应性的交联剂TPA。反应过程如下：
称取3～5mg TPA化合物溶于0.3～0.5mL氘代水中，送至核磁共振仪中做氢谱检测。
在步骤(3)中，取30～50μL浓度为50～200mg/mL的聚乙烯醇，加入等体积浓度为50～200mg/mL的交联剂TPA。通过调节交联剂的浓度可以得到不同活性氧清除能力和降解特征的外层的活性氧清除凝胶。交联反应过程如下：
在步骤(4)中，在20～50℃条件下搅拌溶解得到5～10％质量浓度的GelMA溶液。
在步骤(4)中，所述MSC球的制备方法为：
(1)圆底的96孔板中加入50～70μL 1～3％质量浓度的无菌低熔点琼脂糖溶液，冷却凝固备用；
(2)将含15000～60000个细胞数量的MSC悬液按每孔150～200μL加入到预先铺好琼脂糖的96孔板中；将96孔板放入离心机中800～1000rpm离心8～10min使MSC团聚；
(3)将MSC放入细胞孵箱中培养24～48h即可得到MSC球。
在步骤(4)中，收集3～12个MSC球后，加入20～30μL的5～10％质量浓度的GelMA溶液。调节MSC细胞数量可以得到不同大小的MSC球，其旁分泌功能也会有一定的不同。
所述外层的活性氧清除凝胶的厚度小于内层GelMA凝胶的厚度。外层的活性氧清除凝胶不能过厚，避免其占据了内层的体积，使得MSC球没有生存的空间。
本发明还提供了根据上述制备方法制备得到的携载MSC球的双层凝胶体系。
本发明还提供了上述携载MSC球的双层凝胶体系在制备治疗脊髓损伤的产品中的应用。
针对脊髓损伤复杂的病理进程需要多维的调控这一问题，本发明提供了一种同时具有活性氧清除和携载MSC球功能的双层凝胶体系，该凝胶体系生物相容性好、力学性质佳、重复性好，具有较好的协同治疗效果。
与现有技术相比：本发明通过三维培养的方式得到具有三维结构的MSC球，可以有效地促进MSC的旁分泌功能，增强疗效；本发明通过化学合成和交联的方法得到了一种本身具有活性氧清除和携载MSC功能的双层凝胶体系；本发明提供的双层凝胶体系可在脊髓损伤中提供双重的损伤调节，发挥良好的协同治疗作用。
附图说明
图1是实施例1中制备的MSC球扫描电镜图；
图2是实施例1中MSC球相比MSC分泌胶质细胞源性神经营养因子情况；
图3是实施例2中交联剂TPA结构式及其核磁氢谱图；
图4是实施例2中TPA和聚乙烯醇混合前后形态图；
图5是实施例2中双层凝胶体系形态图；
图6是实施例2中外层的活性氧清除凝胶清除过氧化氢能力考察情况；
图7是实施例2中内层GelMA凝胶扫描电镜图；
图8是实施例3中双层凝胶携载MSC球的扫描电镜图；
图9是实施例4中双层凝胶体系在大鼠脊髓损伤模型中疗效结果。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1MSC球的制备
将低熔点琼脂糖溶于PBS中得到2％质量浓度的琼脂糖溶液，并放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌。趁热将琼脂糖溶液滴加到圆底的96孔板中，每孔50μL，等待冷却凝固，4℃保存备用。
将MSC经消化计数后，按15000个/孔的密度种于预先铺好琼脂糖的96孔板中，每孔150μL。将96孔板放入离心机中以1000rpm的转速离心8min使MSC团聚。
将MSC放入细胞孵箱中培养24h即可得到MSC球。
如图1所示，所制备的MSC球呈现良好的球体形态，表面可见MSC间的致密连接。
如图2所示，制备的MSC球相比同等数量的MSC，具有更好的旁分泌功能，可分泌更多的胶质细胞源性神经营养因子。
实施例2双层凝胶体系的构建
将0.5g 4-(溴甲基)苯硼酸和0.1g N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺溶于10mL二甲基甲酰胺中，油浴条件下恒温(60℃)搅拌反应24h。反应结束后，将反应物倒入1000mL预冷的四氢呋喃中，得到白色絮状沉淀产物，采用离心的方式(2000rpm，3min)收集沉淀。产物用20mL四氢呋喃清洗3次，放入真空干燥箱干燥48h即可得到具有活性氧响应性的交联剂TPA。图3为TPA的化学结构及其TPA核磁氢谱图。氢谱图中的特征峰符合TPA结构，表明TPA的成功合成。图4表明将等体积TPA和聚乙烯醇混合后即可快速形成固体凝胶。根据制备的需求，可将40μL聚乙烯醇(50mg/mL)滴加成长条状，并逐滴加入等体积TPA(100mg/mL)交联即可得到外层的活性氧清除凝胶。其中，TPA和聚乙烯醇均溶于PBS中。
将GelMA加入超纯水中，37℃条件下搅拌溶解得到8％的GelMA溶液。取20μL放入模具中，紫外交联15s即可得到内层GelMA凝胶。将外层活性氧清除凝胶凝胶以包裹的方式包绕在内层凝胶上，即可得到双层凝胶。
如图5所示，制备的凝胶呈现明显的双层结构，且外层活性氧清除凝胶以较薄的形式包覆在内层GelMA凝胶上。这样外层薄，内层厚的结构设计既可实现活性氧清除，也不会占据内层MSC球的生存空间。
如图6所示，外层的活性氧清除凝胶具有快速清除过氧化氢的能力，可在8h内清除约80％的过氧化氢。
如图7所示，内层GelMA凝胶呈现凝胶网络结构，且孔隙较大，有利于细胞的携载以及细胞在凝胶中与外界的物质交换。
实施例3双层凝胶体系携载MSC球
收集12个MSC球(含15000个细胞)于EP管中，去除上清液，加入20～30μL GelMA溶液，混合均匀后，紫外交联10～15s，再将外层活性氧清除凝胶以包裹的方式包绕在内层凝胶上即可得到携载MSC球的双层凝胶体系。
如图8所示，双层凝胶体系可以有效地携载MSC球。
实施例4双层凝胶体系携载MSC球的体内疗效考察
在体重约为250g的雌性SD大鼠上构建脊髓损伤模型。将大鼠麻醉后，剔除背部毛发，碘伏消毒后，用手术刀在脊椎T9～T10段处切开皮肤，分离椎旁肌肉，行锥板切除术，暴露脊髓。用精细剪将脊髓完全剪断，并用明胶海绵充分止血。
模型对照组剪断脊髓后不做任何处理；GelMA凝胶-MSC球组在剪断脊髓后将携载MSC球的GelMA凝胶植入到损伤处；双层凝胶-MSC球组在剪断脊髓后将携载MSC球的双层凝胶植入到损伤处；正常组不做任何手术处理。处理完成后，将大鼠肌肉皮肤依次缝合，碘伏涂抹防止伤口感染。
造模及凝胶植入后，每周观察大鼠的后肢运动情况，并进行Basso BeattieBresnahan(BBB)行为学评分。
如图9所示，经过5周的治疗，模型对照组的运动功能恢复较差，无明显的关节运动。两组MSC球组大鼠均可见显著BBB评分的提高，说明MSC球可以有效促进神经再生和运动功能恢复。而相比GelMA凝胶MSC球组，双层凝胶-MSC球组则提升最为显著，部分大鼠可见负重爬行，说明该体系具有更好的损伤调控能力和促功能恢复效果。
上述的对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将4-(溴甲基)苯硼酸和N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺在二甲基甲酰胺中油浴搅拌反应；
(2)将步骤(1)得到的反应物倒入四氢呋喃中，得到白色沉淀，为具有活性氧响应性的交联剂TPA；
(3)取聚乙烯醇滴加成长条状，并逐滴加入TPA，得到外层的活性氧清除凝胶；
(4)将甲基丙烯酰化明胶GelMA加入到水中得到GelMA溶液，再加入到间充质干细胞MSC球中混合，紫外交联得到携载MSC球的内层GelMA凝胶；
(5)将步骤(3)得到的外层的活性氧清除凝胶以包裹的方式包绕在携载MSC球的内层GelMA凝胶，得到双层凝胶体系。
2.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述4-(溴甲基)苯硼酸和N,N,N',N'-四甲基-1,3-丙二胺的投料比为0.5g：0.1g～1g：0.1g，在40～80℃反应16～24h。
3.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，取30～50μL浓度为50～200mg/mL的聚乙烯醇，加入等体积浓度为50～200mg/mL的TPA。
4.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，在20～50℃条件下搅拌溶解得到5～10％质量浓度的GelMA溶液。
5.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述MSC球的制备方法包括：
(1)在圆底的96孔板中加入50～70μL 1～3％质量浓度的无菌低熔点琼脂糖溶液，冷却凝固备用；
(2)将含15000～60000个细胞数量的MSC悬液按每孔150～200μL加入到预先铺好琼脂糖的96孔板中；将96孔板放入离心机中800～1000rpm离心8～10min使MSC团聚；
(3)将MSC放入细胞孵箱中培养24～48h即可得到MSC球。
6.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，收集3～12个MSC球后，加入20～30μL的5～10％质量浓度的GelMA溶液。
7.根据权利要求1所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系的制备方法，其特征在于，所述外层的活性氧清除凝胶的厚度小于内层GelMA水凝胶的厚度。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系。
9.一种权利要求8所述的携载间充质干细胞球的双层凝胶体系在制备治疗脊髓损伤的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210849965.2A CN115414319B (zh) | 2022-07-19 | 2022-07-19 | 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210849965.2A CN115414319B (zh) | 2022-07-19 | 2022-07-19 | 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115414319A true CN115414319A (zh) | 2022-12-02 |
| CN115414319B CN115414319B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=84195556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210849965.2A Active CN115414319B (zh) | 2022-07-19 | 2022-07-19 | 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115414319B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109568671A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-05 | 四川大学华西医院 | 一种水凝胶负载细胞的3d骨修复支架及其制备方法 |
| CN110885455A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-17 | 浙江大学 | 一种活性氧响应水凝胶的制备及应用 |
| CN113181428A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-30 | 右江民族医学院附属医院 | 脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法 |
| CN113499477A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-10-15 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法 |
| CN114146226A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-08 | 浙江大学 | 一种骨髓间充质干细胞/可降解水凝胶复合材料及其制备方法和用途 |
| CN114366383A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-04-19 | 冯世庆 | 促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架 |
| CN114606189A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-06-10 | 南通大学 | 一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓- GelMA水凝胶复合材料支架 |
| CN114642765A (zh) * | 2021-03-15 | 2022-06-21 | 浙江大学 | 一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-07-19 CN CN202210849965.2A patent/CN115414319B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109568671A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-05 | 四川大学华西医院 | 一种水凝胶负载细胞的3d骨修复支架及其制备方法 |
| CN110885455A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-17 | 浙江大学 | 一种活性氧响应水凝胶的制备及应用 |
| CN114642765A (zh) * | 2021-03-15 | 2022-06-21 | 浙江大学 | 一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用 |
| CN113181428A (zh) * | 2021-04-26 | 2021-07-30 | 右江民族医学院附属医院 | 脊髓损伤修复材料及组织工程支架的制备方法 |
| CN113499477A (zh) * | 2021-05-12 | 2021-10-15 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 搭载间充质干细胞外泌体的细胞外基质凝胶及其制备方法 |
| CN114366383A (zh) * | 2021-06-11 | 2022-04-19 | 冯世庆 | 促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架 |
| CN114146226A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-08 | 浙江大学 | 一种骨髓间充质干细胞/可降解水凝胶复合材料及其制备方法和用途 |
| CN114606189A (zh) * | 2022-03-18 | 2022-06-10 | 南通大学 | 一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓- GelMA水凝胶复合材料支架 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HE ZHAO等: "ROS-scavenging hydrogel to promote healing of bacteria infected diabetic wounds", BIOMATERIALS, vol. 258, pages 1 - 10 * |
| LEI FAN等: "Directing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neural Stem Cell Fate with a Three-Dimensional Biomimetic Hydrogel for Spinal Cord Injury Repair", ACS APPL. MATER. INTERFACES, vol. 10, pages 17742 - 17755 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115414319B (zh) | 2024-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106215232B (zh) | 一种伤口抑菌促愈合敷料及其制备方法 | |
| EP3988136A1 (en) | Degradable regenerative medical material for promoting tissue in-situ regeneration and preparation method therefor | |
| CN108452375B (zh) | 一种3d打印的氧化石墨烯导电水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN111000868A (zh) | 低氧处理的干细胞外泌体在制备用于治疗脊髓损伤的药物或支架材料中的应用 | |
| CN111773243A (zh) | 炎症性肠病的药物及其制备方法和用途 | |
| CN112089886A (zh) | 一种水凝胶及其制备方法 | |
| CN115414319A (zh) | 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用 | |
| CN111632199B (zh) | 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 | |
| CN114469992B (zh) | 钼基多金属氧酸盐簇在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 | |
| CN111214710B (zh) | 一种促进皮肤再生的复合支架及其制备方法 | |
| CN109010914B (zh) | 一种应用于铁超载区域的干细胞支架及其制备方法 | |
| CN114533763A (zh) | 一种新型体外培育牛黄电结石方法 | |
| CN112618480A (zh) | 一种新型眼部药物递送体系的制备方法 | |
| CN206285290U (zh) | 海藻酸钠水凝胶支架构建的组织工程皮肤 | |
| CN116942892B (zh) | 一种用于糖尿病创面治疗水凝胶敷料及其制备方法 | |
| CN115120772B (zh) | 维持干细胞干性的多功能dna水凝胶整合敷料及其制备方法 | |
| CN115105645B (zh) | 一种复合微球、伤口修复敷料的制备方法 | |
| CN116763977A (zh) | 掺杂含铷介孔生物活性玻璃负载aie的敷料及其制备方法 | |
| CN108245706B (zh) | 一种具3d微图案结构的仿生皮肤敷料及其制备方法 | |
| Fang et al. | Porous microneedle patch with sustained exosomes delivery repairs severe spinal cord injury | |
| CN117547642A (zh) | 一种改性生物玻璃材料、制备方法及应用 | |
| CN110898000B (zh) | 一种阿霉素负载甲基纤维素/丝素蛋白复合水凝胶的制备方法 | |
| US20020113224A1 (en) | Crosslinking ionotropic gels | |
| CN117398524A (zh) | 用于sci神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法 | |
| CN116459357A (zh) | 一种电驱动释药的富勒醇-低共熔溶剂-琼脂糖复合凝胶 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |