CN111632199B - 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 - Google Patents

一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111632199B
CN111632199B CN202010472371.5A CN202010472371A CN111632199B CN 111632199 B CN111632199 B CN 111632199B CN 202010472371 A CN202010472371 A CN 202010472371A CN 111632199 B CN111632199 B CN 111632199B
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
silk fibroin
peotmc
hydrogel
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010472371.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111632199A (zh
Inventor
杨立群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202010472371.5A priority Critical patent/CN111632199B/zh
Publication of CN111632199A publication Critical patent/CN111632199A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111632199B publication Critical patent/CN111632199B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52Hydrogels or hydrocolloids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14Macromolecular materials
    • A61L27/18Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14Macromolecular materials
    • A61L27/22Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58Materials at least partially resorbable by the body
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G64/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbonic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G64/18Block or graft polymers
    • C08G64/183Block or graft polymers containing polyether sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08GMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G64/00Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbonic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G64/20General preparatory processes
    • C08G64/30General preparatory processes using carbonates
    • C08G64/305General preparatory processes using carbonates and alcohols
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075Macromolecular gels
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2469/00Characterised by the use of polycarbonates; Derivatives of polycarbonates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明属于生物医用材料与再生医学领域,具体涉及一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法。该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞,丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5~1:1。本发明通过引入含有亲水链段且不含任何酯键、在降解过程中无酸性降解产物生成、且性能可控调节的功能化聚三亚甲基碳酸酯来提高水凝胶的生物相容性,并通过功能化聚三亚甲基碳酸酯的结构与组成、含量等因素来调控丝素蛋白水凝胶的成胶时间与成胶方式,并同时负载细胞/干细胞,对负载的细胞没有副作用,且对植入部位没有刺激性,进而达到修复子宫内膜的目的。

Description

一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水 凝胶及制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料与再生医学领域,具体涉及一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法。
背景技术
不孕不育已成为继癌症、心血管疾病之后的第三大严重疾病,对人类的繁衍生息构成重大威胁,是世界各国面临的重要社会问题之一。目前,子宫内膜损伤已成为女性继发不孕的主要病因之一,如何提高综合治疗的效果,提高患者的妊娠率,已成为子宫内膜修复的重点。21世纪以来,组织工程学和再生医学已成为改善机体健康的重要治疗手段。干细胞在组织工程学和再生医学领域受到广泛重视,为修复子宫内膜损伤开启了新篇章。目前应用干细胞修复子宫内膜的移植方式多为子宫局部原位注射或者静脉注射,易出现在内膜损伤部位存活数量少(宫内原位注射)或募集效率较低(静脉注射)的现象,进而导致干细胞存活率较低,使得治疗后成功受孕率不理想。因此,如何使其有效聚集在组织损伤处而发挥效果是应用干细胞修复子宫内膜损伤尚需解决的问题。
生物材料在组织损伤修复中发挥重要作用,可以促进干细胞有效聚集在组织损伤处从而改善干细胞治疗的效果。高分子水凝胶是一种能在水中溶胀并保持大量水分而不溶解的聚合物。由于水凝胶聚合物网络中充斥有大量的水分,使得整个材料具备了流体的性质,这与充盈有大量水溶液的机体组织及其相似,柔软、润湿的表面大大减少了材料对周围组织的刺激,使得水凝胶具有良好的生物相容性,在组织工程与再生医学方向拥有极大开发潜力。丝素蛋白是一种纯天然蛋白质,具有良好的相容性和生物降解性能,降解最终产物为氨基酸,非常适合用作生物材料。丝素蛋白水溶液自然放置会形成水凝胶,但其凝胶时间较长,限制了它的广泛应用。
为了能加速丝素蛋白凝胶的形成,国内专利公开号CN102174203A,采用与PLA-PEG-PLA共混制备丝素蛋白水凝胶,使得丝素蛋白水凝胶的制备时间可控。但是由于PLA-PEG-PLA共聚物结构中PLA成分在降解过程中易产生酸性降解产物,导致应用部位的pH下降,进而导致水凝胶负载的药物或细胞的活性降低。该方法尽管加快了丝素蛋白水凝胶的凝胶化,但是存在降低丝素蛋白水凝胶生物相容性的可能性,需要进一步改善以获得能够快速凝胶化且具有良好生物相容性的丝素蛋白水凝胶。
发明内容
本发明的目的是提供一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法,解决丝素蛋白水凝胶凝胶化时间过长的不足,并显著改善聚酯类共混物的缺陷,确保水凝胶在降解过程中不产酸酸性降解产物,始终保持丝素蛋白良好的生物相容性,不降低负载细胞的活性,在子宫内膜修复等生物医药领域具有广阔应用前景。
为了解决上述技术问题,采用如下技术方案:
一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞,丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5~1∶1,活细胞为水凝胶质量的0.01~10%。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白或桑蚕丝素蛋白或二者混合物。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,功能化聚三亚甲基碳酸酯的通式如下:
Figure BDA0002514721400000021
R1=-H,-CH3,-OH,-CH2OH,-CH2CH3,-CH2CH2CH3,-(CH2)3CH3,-CH2OCH3,-OCH3,-OCH2CH2=CH2,-CH2CH2=CH2,-CH2Cl,-CH2Br,-CH2N3中的任意一种;
R2=-H,-CG3,-OH,-CH2OH,-CH2CH3,-CH2CH2CH3,-(CH2)3CH3,-CH2OCH3,-OCH3,-OCH2CH2=CH2,-CH2CH2=CH2,-CH2Cl,-CH2Br,-CH2N3中的任意一种;
其中:n=10~400,m=1~50,y1=1~1000,y2=1~1000,x1∶y1=10~1∶1,x2∶y2=10~1∶1。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,优选的,n=20~50或80~150,m=1~20;当n=20~50时,y1或y2=10~100;当n=80~150时,y1或y2=1~50。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上;或者,活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
(1)以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷,在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚1~3L和浓硫酸0.2~0.8mL,搅拌下升温至100~150℃,滴加氧杂环丁烷80~120g的聚乙二醇醚300~500mL溶液,滴毕保温反应5~7h;冷却至室温,减压回收过量聚乙二醇醚,减压蒸馏得无色液体;
(2)在反应瓶中依次加入步骤(1)制备的无色液体100~150g、吡啶10~30mL和无水四氢呋喃1~2L,搅拌使其溶解;升温至50~70℃,滴加三光气40~60g的无水四氢呋喃500~600mL溶液,滴毕反应10~15h;过滤除去盐酸盐,滤液回收无水四氢呋喃,残余物用二氯甲烷萃取,合并萃取液,减压蒸馏,得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC;
(3)将聚乙二醇PEG和步骤(2)制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC按1∶40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与反应物PEG+EOTMC的摩尔比为1∶10~10000,室温下抽真空、通氮气,反复置换4~6次,封闭密封式玻璃聚合管,置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h;反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用石油醚沉淀纯化2~4次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存;
(4)将步骤(3)制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯按1∶40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与的反应物PEOTMC-PEG-PEOTMC+三亚甲基碳酸酯的摩尔比为1∶100~10000,室温下抽真空、通氮气,反复置换4~6次,封闭密封式玻璃聚合管,置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h;反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用甲醇沉淀纯化2~4次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存;
(5)在圆底烧瓶中将步骤(4)合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液,PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为5~15wt%,将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃,然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物2~4倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯;反应混合物在0℃时搅拌3~5h,然后在室温下静置1~3h,过滤,除去三乙胺盐酸盐,滤液用过量石油醚沉淀,得到功能化聚三亚甲基碳酸酯,最后在35~40℃真空条件下干燥至恒重;
(6)将浓度为5~10wt%的丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比2~4∶1混合形成溶液,加入所述溶液0.5~2wt%的光引发剂后,倒入培养皿中,并将活细胞以0.5~2×106cells/ml的密度加入其中,放置在强度为6~12mW/cm2,波长为365nm的紫外灯下光照4~6min形成水凝胶。
本发明的设计思想是:通过引入含有亲水链段且不含任何酯键、在降解过程中无酸性降解产物生成、且性能可控调节的功能化聚三亚甲基碳酸酯来提高水凝胶的生物相容性,并通过功能化聚三亚甲基碳酸酯的结构与组成、含量等因素来调控丝素蛋白水凝胶的成胶时间与成胶方式,并同时负载细胞/干细胞,对负载的细胞没有副作用,且对植入部位没有刺激性,进而达到修复子宫内膜的目的。
另外,本发明选择特定的功能化聚三亚甲基碳酸酯,其作用和效果是:通过自身结构组成与性能的可控调节来调控丝素蛋白水凝胶的凝胶化方式与时间,同时利用自身无酯键结构以及酸性降解产物生成的优势提高丝素蛋白水凝胶的生物相容性,避免PLA、PLGA或其他聚酯链段因酸性降解产物所产生的副作用。活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上;或者,活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。上述选择的作用和效果是:募集或诱导产生子宫内膜样细胞,同时利用旁分泌作用促进子宫内膜修复。
由于采用上述技术方案,本发明与现有发明相比具有以下有益效果:
1、本发明方法简单易行,原材料资源丰富,有利于实现工业化生产。
2、本发明制备过程中的所涉及功能化聚三亚甲基碳酸酯链段中不含酯键具有良好生物相容性,降解过程中无酸性物质生成,不会对负载的细胞产生副作用,可显著提高丝素蛋白水凝胶的生物相容性。
3、本发明制备过程中的所涉及功能化聚三亚甲基碳酸酯链段性能能够可控调节,使得制备的丝素蛋白水凝胶的性能可控。
4、本发明制备的丝素蛋白水凝胶的凝胶形成方法具有可选择性,即可以依靠温度形成凝胶,还可以通过紫外光形成凝胶。
5、本发明制备的丝素蛋白水凝胶能够快速形成凝胶,且凝胶化时间可控,在25~39℃或紫外条件下可在1分钟~60分钟形成凝胶。
附图说明
图1是实施例1中含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体的核磁谱图。
图2是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的图片。
图3是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的扫描电镜图。
图4是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶妊娠实验结果。
具体实施方式
下面,结合具体的实施例对发明作进一步说明:
实施例1:
本实施例中,修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法如下:
(1)以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷;在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚(m=3)1.8L和浓硫酸几滴(0.5mL),搅拌下升温至135℃,缓慢滴加氧杂环丁烷102g的聚乙二醇醚(m=3)400mL溶液。滴毕,保温反应6h。冷却至室温,减压回收过量聚乙二醇醚(m=3),减压蒸馏得无色液体168.5g。
(2)在反应瓶中依次加入步骤(1)制备的无色液体133g、吡啶20mL和无水四氢呋喃(THF)1.5L,搅拌使其溶解;升温至60℃,缓慢滴加三氯甲基碳酸酯(三光气)50.4g的无水四氢呋喃(THF)560mL溶液。滴毕,反应12h。过滤除去盐酸盐,滤液回收THF,残余物用二氯甲烷萃取,合并萃取液,减压蒸馏,得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体(EOTMC)123.6g。
(3)将聚乙二醇PEG(n=43)和步骤(2)制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体(EOTMC)按1∶50的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.25mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与反应物(PEG+EOTMC)的摩尔比为1∶5000,室温下抽真空、通氮气,反复置换5次,封闭密封式玻璃聚合管,避免外界空气、水分及其他成分进入反应体系,置于120℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用石油醚沉淀纯化3次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存。
(4)将步骤(3)制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯(R1=R2=H)按1∶50的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.25mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与的反应物(PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯)的摩尔比为1∶5000,室温下抽真空、通氮气,反复置换5次,封闭密封式玻璃聚合管,避免外界空气、水分及其他成分进入反应体系,置于120℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用甲醇沉淀纯化3次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存。
(5)在圆底烧瓶中将步骤(4)合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液,PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为10wt%,将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃,然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物3倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯。反应混合物在0℃时搅拌4h,然后在室温下静置2h,过滤,除去三乙胺盐酸盐,滤液用过量石油醚沉淀,得到功能化聚三亚甲基碳酸酯,最后在37℃真空条件下干燥至恒重。
(6)将浓度为8%(质量分数)的桑蚕丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比3∶1混合形成溶液,加入所述溶液1wt%的光引发剂(Irgacure 2959)后,倒入培养皿中,并将经血源间充质干细胞以1×106cells/ml的密度加入其中,放置在强度为9mW/cm2,波长为365nm的紫外灯下光照5min形成水凝胶。
(7)选取动情期雌性SD大鼠(n=3),按3ml/kg加入质量浓度10%水合氯醛麻醉,仰卧置于37℃恒温热台维持体温。中下腹壁剃毛,75wt%酒精喷涂消毒术区。无菌操作条件下逐层切开腹壁,充分暴露双侧子宫角,于子宫近输卵管处剪开一小口,探入16G注射器针头环绕搔刮子宫壁数次(深度约子宫壁2/3)至有血液流出,无菌生理盐水盥洗宫腔后缝合子宫壁切口。无菌生理盐水冲洗术区,逐层关腹。加热灯照术后大鼠,麻醉苏醒后送回鼠舍,标记分笼后单独饲养。
(8)将步骤(6)制备的水凝胶植入步骤(7)建立的子宫内膜损伤模型的大鼠宫腔内。3周后,按2∶1的数量比例与公鼠合笼,次日早晨阴道图片检查交配情况。精子(+)计为E0.5(妊娠0.5天),妊娠13.5天时麻醉开腹计数孕囊数及活胎数。
如图1所示,由含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体的核磁谱图可以看出,含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体结构式中各基团的化学位移峰在核磁谱图的正确位置出现,表明所制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体结构正确。
如图2所示,由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的图片可以看出,水凝胶具有一定的强度和弹性,能够为负载细胞提供良好的三维空间。
如图3所示,由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的扫描电镜图可以看出,冻干的水凝胶样品均呈现出多孔结构,相互连通的多孔结构有利于营养物质和氧气的运输,以及代谢物的排除,孔洞大小与分布总体呈现均匀趋势,有利于细胞的生存、增殖和扩散。
如图4所示,由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶妊娠实验结果可以看出,经丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶负载经血源间充质干细胞移植的子宫内膜损伤动物模型的妊娠胚胎数与正常大鼠的妊娠胚胎数无显著差异,表明丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶负载经血源间充质干细胞可以促进损伤子宫内膜功能的恢复,从而支持受精卵的植入和胚胎的发育,并改变模型大鼠的妊娠结局。
实施例2
与实施例1不同之处在于:步骤(1)所使用的聚乙二醇醚(m=4),其它条件与实施例1同。
实施例3
与实施例2不同之处在于:步骤(3)所使用的PEG(n=113),且PEG与EOTMC的摩尔比为1∶20,其它条件与实施例2同。
实施例4
与实施例3不同之处在于:步骤(4)中与PEOTMC-PEG-PEOTMC共聚的单体为2,2-二甲基三亚甲基碳酸酯(R1=R2=-CH3),其它条件与实施例3同。
实施例5
与实施例4不同之处在于:步骤(6)中所加入的细胞为经血源间充质干细胞与子宫内膜上皮细胞,其它条件与实施例4同。
实施例6
与实施例5不同之处在于:步骤(6)中凝胶形成条件为置于37℃静置20min后形成凝胶,其它条件与实施例5同。
实施例7
与实施例7不同之处在于:步骤(6)中所加入的细胞为骨髓间充质干细胞、子宫内膜间质细胞与子宫内膜上皮细胞,其它条件与实施例5同。
实施例8
与实施例1不同之处在于:步骤(6)中所使用的丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白,其它条件与实施例1同。
实施例9
与实施例1不同之处在于:步骤(6)中所使用的丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白与桑蚕丝素蛋白任意混合物,其它条件与实施例1同。
实施例10
与实施例1不同之处在于:步骤(6)中所使用的丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比5∶1混合,其它条件与实施例1同。
表1各实施例的妊娠活胎数
Figure BDA0002514721400000081
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明,该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明的等效实施或变更,均应当包含于本发明的专利范围内。
另外,本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然,这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化,都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,其特征在于,该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞,丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5~1: 1,活细胞为水凝胶质量的0.01~10%;
功能化聚三亚甲基碳酸酯的通式如下:
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中:n=10~400,m=1~50,y1=1~1000,y2=1~1000,x1: y1=10~1: 1,x2: y2=10~1: 1。
2.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,其特征在于,丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白或桑蚕丝素蛋白或二者混合物。
3.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,其特征在于,n=20~50或80~150,m=1~20;当n=20~50时,y1或y2=10~100;当n=80~150时,y1或y2=1~50。
4.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶,其特征在于,活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上;或者,活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。
5.一种权利要求1至4之一所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷,在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚1~3L和浓硫酸0.2~0.8mL,搅拌下升温至100~150℃,滴加氧杂环丁烷80~120g的聚乙二醇醚300~500mL溶液,滴毕保温反应5~7h;冷却至室温,减压回收过量聚乙二醇醚,减压蒸馏得无色液体;
(2)在反应瓶中依次加入步骤(1)制备的无色液体100~150g、吡啶10~30mL和无水四氢呋喃1~2L,搅拌使其溶解;升温至50~70℃,滴加三光气40~60g的无水四氢呋喃500~600mL溶液,滴毕反应10~15h;过滤除去盐酸盐,滤液回收无水四氢呋喃,残余物用二氯甲烷萃取,合并萃取液,减压蒸馏,得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC;
(3)将聚乙二醇PEG和步骤(2)制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC按1:40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与反应物PEG+EOTMC的摩尔比为1:10~10000,室温下抽真空、通氮气,反复置换4~6次,封闭密封式玻璃聚合管,置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h;反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用石油醚沉淀纯化2~4次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存;
(4)将步骤(3)制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯按1:40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀,用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液,辛酸亚锡与反应物PEOTMC-PEG-PEOTMC+三亚甲基碳酸酯的摩尔比为1:100~10000,室温下抽真空、通氮气,反复置换4~6次,封闭密封式玻璃聚合管,置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h;反应结束后,将产物溶于二氯甲烷中,用甲醇沉淀纯化2~4次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC,真空干燥至衡重,密封后冷藏保存;
(5)在圆底烧瓶中将步骤(4)合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液,PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为5~15wt%,将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃,然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物2~4倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯;反应混合物在0℃时搅拌3~5h,然后在室温下静置1~3h,过滤,除去三乙胺盐酸盐,滤液用过量石油醚沉淀,得到功能化聚三亚甲基碳酸酯,最后在35~40℃真空条件下干燥至恒重;
(6)将浓度为5~10wt%的丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比2~4:1混合形成溶液,加入所述溶液0.5~2wt%的光引发剂后,倒入培养皿中,并将活细胞以0.5~2×106 cells/ml 的密度加入其中,放置在强度为6~12 mW/cm2,波长为365 nm的紫外灯下光照4~6 min形成水凝胶。
CN202010472371.5A 2020-05-29 2020-05-29 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 Active CN111632199B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010472371.5A CN111632199B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010472371.5A CN111632199B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111632199A CN111632199A (zh) 2020-09-08
CN111632199B true CN111632199B (zh) 2021-11-12

Family

ID=72324255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010472371.5A Active CN111632199B (zh) 2020-05-29 2020-05-29 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111632199B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114949361A (zh) * 2021-12-31 2022-08-30 浙江金时代生物技术有限公司 一种用于子宫内膜修复的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架与人脐带间充质干细胞复合物的制备方法
CN114452442A (zh) * 2022-01-30 2022-05-10 上海松力生物技术有限公司 一种原位诱导子宫壁组织再生的植入物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6413539B1 (en) * 1996-10-31 2002-07-02 Poly-Med, Inc. Hydrogel-forming, self-solvating absorbable polyester copolymers, and methods for use thereof
CN101531756B (zh) * 2009-04-16 2011-06-15 山东大学 一种水溶性聚乙二醇/聚乳酸多嵌段聚碳酸酯的制备方法
CN101864069B (zh) * 2010-06-10 2012-02-22 武汉大学 一种生物降解性水凝胶及其合成方法
CN102174203B (zh) * 2011-03-29 2012-12-26 苏州大学 一种丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法
CN103772347B (zh) * 2014-01-15 2016-02-17 常州南京大学高新技术研究院 一种制备含乙二醇醚侧基的碳酸酯单体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111632199A (zh) 2020-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Patel et al. Poly (ethylene glycol) hydrogel system supports preadipocyte viability, adhesion, and proliferation
CN111892719B (zh) 一种用于软骨细胞三维培养的透明质酸超分子水凝胶及其制备与应用
CN111632199B (zh) 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法
US6129761A (en) Injectable hydrogel compositions
WO2016023140A1 (zh) 一种用于细胞三维培养的基质支架及其构建方法和应用
WO2007064152A1 (en) Injectable thermosensitive pluronic hydrogels coupled with bioactive materials for tissue regeneration and preparation mehtod thereof
US20040013652A1 (en) Treatments with autologous fibroblast
CN110305338B (zh) 用于肿瘤微球入侵检测的双网络水凝胶的制备与应用方法
CN102174203A (zh) 一种丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法
JP2008043782A (ja) 注入可能な多糖類−細胞組成物
US10279079B2 (en) Compositions and methods for spinal disc repair and other surgical and non-surgical indications
CN110038163A (zh) 一种用于修复腹壁缺损的水凝胶复合生物补片制备方法
CN110947031B (zh) 一种具有高生物活性的骨组织工程支架材料及其制备方法和应用
CN112063224A (zh) 一种生物油墨及其制备方法
Wang et al. Elastic fiber-Reinforced silk fibroin scaffold with a Double-Crosslinking network for human ear-shaped cartilage regeneration
WO1998025653A2 (en) Improved hydrogel for tissue engineering
CN112138216B (zh) 一种高度仿生骨基质的杂化交联颅骨修复多孔膜及其制备方法
WO2019029084A1 (zh) 3d打印人造子宫内膜及其制备方法和应用
CN113604421B (zh) 基于3d打印的血管化双层工程皮肤及其制备方法
CN1626251A (zh) 组织工程化软骨细胞移植及其制备方法
CN109985276A (zh) 一种纳米二氧化硅/高分子材料引导骨再生复合多孔膜及其制备方法
CN114099782A (zh) 一种可重构的子宫衍生材料的制备方法与应用
CN113995557B (zh) 一种个性化3d打印半月板再生支架及其制备方法
CN108653821A (zh) 一种柠檬酸-生物活性玻璃有机无机杂化材料及其制备方法和应用
CN102071168A (zh) 人乳腺癌高转移细胞亚系及其建立方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant