CN111632199B - 一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 - Google Patents

一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料与再生医学领域，具体涉及一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法。该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞，丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5～1:1。本发明通过引入含有亲水链段且不含任何酯键、在降解过程中无酸性降解产物生成、且性能可控调节的功能化聚三亚甲基碳酸酯来提高水凝胶的生物相容性，并通过功能化聚三亚甲基碳酸酯的结构与组成、含量等因素来调控丝素蛋白水凝胶的成胶时间与成胶方式，并同时负载细胞/干细胞，对负载的细胞没有副作用，且对植入部位没有刺激性，进而达到修复子宫内膜的目的。

Description

一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水 凝胶及制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料与再生医学领域，具体涉及一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法。
背景技术
不孕不育已成为继癌症、心血管疾病之后的第三大严重疾病，对人类的繁衍生息构成重大威胁，是世界各国面临的重要社会问题之一。目前，子宫内膜损伤已成为女性继发不孕的主要病因之一，如何提高综合治疗的效果，提高患者的妊娠率，已成为子宫内膜修复的重点。21世纪以来，组织工程学和再生医学已成为改善机体健康的重要治疗手段。干细胞在组织工程学和再生医学领域受到广泛重视，为修复子宫内膜损伤开启了新篇章。目前应用干细胞修复子宫内膜的移植方式多为子宫局部原位注射或者静脉注射，易出现在内膜损伤部位存活数量少(宫内原位注射)或募集效率较低(静脉注射)的现象，进而导致干细胞存活率较低，使得治疗后成功受孕率不理想。因此，如何使其有效聚集在组织损伤处而发挥效果是应用干细胞修复子宫内膜损伤尚需解决的问题。
生物材料在组织损伤修复中发挥重要作用，可以促进干细胞有效聚集在组织损伤处从而改善干细胞治疗的效果。高分子水凝胶是一种能在水中溶胀并保持大量水分而不溶解的聚合物。由于水凝胶聚合物网络中充斥有大量的水分，使得整个材料具备了流体的性质，这与充盈有大量水溶液的机体组织及其相似，柔软、润湿的表面大大减少了材料对周围组织的刺激，使得水凝胶具有良好的生物相容性，在组织工程与再生医学方向拥有极大开发潜力。丝素蛋白是一种纯天然蛋白质，具有良好的相容性和生物降解性能，降解最终产物为氨基酸，非常适合用作生物材料。丝素蛋白水溶液自然放置会形成水凝胶，但其凝胶时间较长，限制了它的广泛应用。
为了能加速丝素蛋白凝胶的形成，国内专利公开号CN102174203A，采用与PLA-PEG-PLA共混制备丝素蛋白水凝胶，使得丝素蛋白水凝胶的制备时间可控。但是由于PLA-PEG-PLA共聚物结构中PLA成分在降解过程中易产生酸性降解产物，导致应用部位的pH下降，进而导致水凝胶负载的药物或细胞的活性降低。该方法尽管加快了丝素蛋白水凝胶的凝胶化，但是存在降低丝素蛋白水凝胶生物相容性的可能性，需要进一步改善以获得能够快速凝胶化且具有良好生物相容性的丝素蛋白水凝胶。
发明内容
本发明的目的是提供一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶及制备方法，解决丝素蛋白水凝胶凝胶化时间过长的不足，并显著改善聚酯类共混物的缺陷，确保水凝胶在降解过程中不产酸酸性降解产物，始终保持丝素蛋白良好的生物相容性，不降低负载细胞的活性，在子宫内膜修复等生物医药领域具有广阔应用前景。
为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：
一种修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞，丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5～1∶1，活细胞为水凝胶质量的0.01～10％。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白或桑蚕丝素蛋白或二者混合物。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，功能化聚三亚甲基碳酸酯的通式如下：
Figure BDA0002514721400000021
R1＝-H，-CH3，-OH，-CH2OH，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-(CH2)3CH3，-CH2OCH3，-OCH3，-OCH2CH2＝CH2，-CH2CH2＝CH2，-CH2Cl，-CH2Br，-CH2N3中的任意一种；
R2＝-H，-CG3，-OH，-CH2OH，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-(CH2)3CH3，-CH2OCH3，-OCH3，-OCH2CH2＝CH2，-CH2CH2＝CH2，-CH2Cl，-CH2Br，-CH2N3中的任意一种；
其中：n＝10～400，m＝1～50，y1＝1～1000，y2＝1～1000，x1∶y1＝10～1∶1，x2∶y2＝10～1∶1。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，优选的，n＝20～50或80～150，m＝1～20；当n＝20～50时，y1或y2＝10～100；当n＝80～150时，y1或y2＝1～50。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上；或者，活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。
所述的修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷，在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚1～3L和浓硫酸0.2～0.8mL，搅拌下升温至100～150℃，滴加氧杂环丁烷80～120g的聚乙二醇醚300～500mL溶液，滴毕保温反应5～7h；冷却至室温，减压回收过量聚乙二醇醚，减压蒸馏得无色液体；
(2)在反应瓶中依次加入步骤(1)制备的无色液体100～150g、吡啶10～30mL和无水四氢呋喃1～2L，搅拌使其溶解；升温至50～70℃，滴加三光气40～60g的无水四氢呋喃500～600mL溶液，滴毕反应10～15h；过滤除去盐酸盐，滤液回收无水四氢呋喃，残余物用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压蒸馏，得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC；
(3)将聚乙二醇PEG和步骤(2)制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC按1∶40～60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.2～0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与反应物PEG+EOTMC的摩尔比为1∶10～10000，室温下抽真空、通氮气，反复置换4～6次，封闭密封式玻璃聚合管，置于100～150℃油浴中搅拌反应20～30h；反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用石油醚沉淀纯化2～4次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存；
(4)将步骤(3)制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯按1∶40～60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.2～0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与的反应物PEOTMC-PEG-PEOTMC+三亚甲基碳酸酯的摩尔比为1∶100～10000，室温下抽真空、通氮气，反复置换4～6次，封闭密封式玻璃聚合管，置于100～150℃油浴中搅拌反应20～30h；反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用甲醇沉淀纯化2～4次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存；
(5)在圆底烧瓶中将步骤(4)合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液，PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为5～15wt％，将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃，然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物2～4倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯；反应混合物在0℃时搅拌3～5h，然后在室温下静置1～3h，过滤，除去三乙胺盐酸盐，滤液用过量石油醚沉淀，得到功能化聚三亚甲基碳酸酯，最后在35～40℃真空条件下干燥至恒重；
(6)将浓度为5～10wt％的丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比2～4∶1混合形成溶液，加入所述溶液0.5～2wt％的光引发剂后，倒入培养皿中，并将活细胞以0.5～2×106cells/ml的密度加入其中，放置在强度为6～12mW/cm2，波长为365nm的紫外灯下光照4～6min形成水凝胶。
本发明的设计思想是：通过引入含有亲水链段且不含任何酯键、在降解过程中无酸性降解产物生成、且性能可控调节的功能化聚三亚甲基碳酸酯来提高水凝胶的生物相容性，并通过功能化聚三亚甲基碳酸酯的结构与组成、含量等因素来调控丝素蛋白水凝胶的成胶时间与成胶方式，并同时负载细胞/干细胞，对负载的细胞没有副作用，且对植入部位没有刺激性，进而达到修复子宫内膜的目的。
另外，本发明选择特定的功能化聚三亚甲基碳酸酯，其作用和效果是：通过自身结构组成与性能的可控调节来调控丝素蛋白水凝胶的凝胶化方式与时间，同时利用自身无酯键结构以及酸性降解产物生成的优势提高丝素蛋白水凝胶的生物相容性，避免PLA、PLGA或其他聚酯链段因酸性降解产物所产生的副作用。活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上；或者，活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胚胎干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。上述选择的作用和效果是：募集或诱导产生子宫内膜样细胞，同时利用旁分泌作用促进子宫内膜修复。
由于采用上述技术方案，本发明与现有发明相比具有以下有益效果：
1、本发明方法简单易行，原材料资源丰富，有利于实现工业化生产。
2、本发明制备过程中的所涉及功能化聚三亚甲基碳酸酯链段中不含酯键具有良好生物相容性，降解过程中无酸性物质生成，不会对负载的细胞产生副作用，可显著提高丝素蛋白水凝胶的生物相容性。
3、本发明制备过程中的所涉及功能化聚三亚甲基碳酸酯链段性能能够可控调节，使得制备的丝素蛋白水凝胶的性能可控。
4、本发明制备的丝素蛋白水凝胶的凝胶形成方法具有可选择性，即可以依靠温度形成凝胶，还可以通过紫外光形成凝胶。
5、本发明制备的丝素蛋白水凝胶能够快速形成凝胶，且凝胶化时间可控，在25～39℃或紫外条件下可在1分钟～60分钟形成凝胶。
附图说明
图1是实施例1中含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体的核磁谱图。
图2是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的图片。
图3是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的扫描电镜图。
图4是实施例1中丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶妊娠实验结果。
具体实施方式
下面，结合具体的实施例对发明作进一步说明：
实施例1：
本实施例中，修复子宫内膜的丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法如下：
(1)以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷；在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚(m＝3)1.8L和浓硫酸几滴(0.5mL)，搅拌下升温至135℃，缓慢滴加氧杂环丁烷102g的聚乙二醇醚(m＝3)400mL溶液。滴毕，保温反应6h。冷却至室温，减压回收过量聚乙二醇醚(m＝3)，减压蒸馏得无色液体168.5g。
(2)在反应瓶中依次加入步骤(1)制备的无色液体133g、吡啶20mL和无水四氢呋喃(THF)1.5L，搅拌使其溶解；升温至60℃，缓慢滴加三氯甲基碳酸酯(三光气)50.4g的无水四氢呋喃(THF)560mL溶液。滴毕，反应12h。过滤除去盐酸盐，滤液回收THF，残余物用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压蒸馏，得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体(EOTMC)123.6g。
(3)将聚乙二醇PEG(n＝43)和步骤(2)制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体(EOTMC)按1∶50的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.25mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与反应物(PEG+EOTMC)的摩尔比为1∶5000，室温下抽真空、通氮气，反复置换5次，封闭密封式玻璃聚合管，避免外界空气、水分及其他成分进入反应体系，置于120℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用石油醚沉淀纯化3次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存。
(4)将步骤(3)制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯(R1＝R2＝H)按1∶50的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.25mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与的反应物(PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯)的摩尔比为1∶5000，室温下抽真空、通氮气，反复置换5次，封闭密封式玻璃聚合管，避免外界空气、水分及其他成分进入反应体系，置于120℃油浴中搅拌反应24h。反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用甲醇沉淀纯化3次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存。
(5)在圆底烧瓶中将步骤(4)合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液，PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为10wt％，将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃，然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物3倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯。反应混合物在0℃时搅拌4h，然后在室温下静置2h，过滤，除去三乙胺盐酸盐，滤液用过量石油醚沉淀，得到功能化聚三亚甲基碳酸酯，最后在37℃真空条件下干燥至恒重。
(6)将浓度为8％(质量分数)的桑蚕丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比3∶1混合形成溶液，加入所述溶液1wt％的光引发剂(Irgacure 2959)后，倒入培养皿中，并将经血源间充质干细胞以1×106cells/ml的密度加入其中，放置在强度为9mW/cm2，波长为365nm的紫外灯下光照5min形成水凝胶。
(7)选取动情期雌性SD大鼠(n＝3)，按3ml/kg加入质量浓度10％水合氯醛麻醉，仰卧置于37℃恒温热台维持体温。中下腹壁剃毛，75wt％酒精喷涂消毒术区。无菌操作条件下逐层切开腹壁，充分暴露双侧子宫角，于子宫近输卵管处剪开一小口，探入16G注射器针头环绕搔刮子宫壁数次(深度约子宫壁2/3)至有血液流出，无菌生理盐水盥洗宫腔后缝合子宫壁切口。无菌生理盐水冲洗术区，逐层关腹。加热灯照术后大鼠，麻醉苏醒后送回鼠舍，标记分笼后单独饲养。
(8)将步骤(6)制备的水凝胶植入步骤(7)建立的子宫内膜损伤模型的大鼠宫腔内。3周后，按2∶1的数量比例与公鼠合笼，次日早晨阴道图片检查交配情况。精子(+)计为E0.5(妊娠0.5天)，妊娠13.5天时麻醉开腹计数孕囊数及活胎数。
如图1所示，由含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体的核磁谱图可以看出，含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体结构式中各基团的化学位移峰在核磁谱图的正确位置出现，表明所制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体结构正确。
如图2所示，由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的图片可以看出，水凝胶具有一定的强度和弹性，能够为负载细胞提供良好的三维空间。
如图3所示，由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的扫描电镜图可以看出，冻干的水凝胶样品均呈现出多孔结构，相互连通的多孔结构有利于营养物质和氧气的运输，以及代谢物的排除，孔洞大小与分布总体呈现均匀趋势，有利于细胞的生存、增殖和扩散。
如图4所示，由丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶妊娠实验结果可以看出，经丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶负载经血源间充质干细胞移植的子宫内膜损伤动物模型的妊娠胚胎数与正常大鼠的妊娠胚胎数无显著差异，表明丝素蛋白/功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶负载经血源间充质干细胞可以促进损伤子宫内膜功能的恢复，从而支持受精卵的植入和胚胎的发育，并改变模型大鼠的妊娠结局。
实施例2
与实施例1不同之处在于：步骤(1)所使用的聚乙二醇醚(m＝4)，其它条件与实施例1同。
实施例3
与实施例2不同之处在于：步骤(3)所使用的PEG(n＝113)，且PEG与EOTMC的摩尔比为1∶20，其它条件与实施例2同。
实施例4
与实施例3不同之处在于：步骤(4)中与PEOTMC-PEG-PEOTMC共聚的单体为2,2-二甲基三亚甲基碳酸酯(R1＝R2＝-CH3)，其它条件与实施例3同。
实施例5
与实施例4不同之处在于：步骤(6)中所加入的细胞为经血源间充质干细胞与子宫内膜上皮细胞，其它条件与实施例4同。
实施例6
与实施例5不同之处在于：步骤(6)中凝胶形成条件为置于37℃静置20min后形成凝胶，其它条件与实施例5同。
实施例7
与实施例7不同之处在于：步骤(6)中所加入的细胞为骨髓间充质干细胞、子宫内膜间质细胞与子宫内膜上皮细胞，其它条件与实施例5同。
实施例8
与实施例1不同之处在于：步骤(6)中所使用的丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白，其它条件与实施例1同。
实施例9
与实施例1不同之处在于：步骤(6)中所使用的丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白与桑蚕丝素蛋白任意混合物，其它条件与实施例1同。
实施例10
与实施例1不同之处在于：步骤(6)中所使用的丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比5∶1混合，其它条件与实施例1同。
表1各实施例的妊娠活胎数
Figure BDA0002514721400000081
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (5)

1.一种修复子宫内膜的丝素蛋白／功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，其特征在于，该水凝胶包含丝素蛋白、功能化聚三亚甲基碳酸酯以及活细胞，丝素蛋白与功能化聚三亚甲基碳酸酯的质量比为5~1: 1，活细胞为水凝胶质量的0.01~10%；
功能化聚三亚甲基碳酸酯的通式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：n=10~400，m=1~50，y1=1~1000，y2=1~1000，x1: y1=10~1: 1，x2: y2=10~1: 1。
2.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白／功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，其特征在于，丝素蛋白为柞蚕丝素蛋白或桑蚕丝素蛋白或二者混合物。
3.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白／功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，其特征在于，n=20~50或80~150，m=1~20；当n=20~50时，y1或y2=10~100；当n=80~150时，y1或y2=1~50。
4.按照权利要求1所述的修复子宫内膜的丝素蛋白／功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶，其特征在于，活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上；或者，活细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、经血源间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、人早孕蜕膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、子宫内膜干细胞、诱导多能干细胞中的一种或一种以上与子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞中的一种或两种的混合细胞。
5.一种权利要求1至4之一所述的修复子宫内膜的丝素蛋白／功能化聚三亚甲基碳酸酯水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以三羟甲基乙烷为原料经酯交换和热解脱羧制得氧杂环丁烷，在反应瓶中依次加入聚乙二醇醚1~3L和浓硫酸0.2~0.8mL，搅拌下升温至100~150℃，滴加氧杂环丁烷80~120g的聚乙二醇醚300~500mL溶液，滴毕保温反应5~7h；冷却至室温，减压回收过量聚乙二醇醚，减压蒸馏得无色液体；
（2）在反应瓶中依次加入步骤（1）制备的无色液体100~150g、吡啶10~30mL和无水四氢呋喃1~2L，搅拌使其溶解；升温至50~70℃，滴加三光气40~60g的无水四氢呋喃500~600mL溶液，滴毕反应10~15h；过滤除去盐酸盐，滤液回收无水四氢呋喃，残余物用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压蒸馏，得含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC；
（3）将聚乙二醇PEG和步骤（2）制备的含聚乙二醇侧链的碳酸酯单体EOTMC按1:40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与反应物PEG+EOTMC的摩尔比为1:10~10000，室温下抽真空、通氮气，反复置换4~6次，封闭密封式玻璃聚合管，置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h；反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用石油醚沉淀纯化2~4次得到含聚乙二醇侧链的碳酸酯与聚乙二醇的嵌段共聚物PEOTMC-PEG-PEOTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存；
（4）将步骤（3）制备的PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯按1:40~60的摩尔比例加到密封式玻璃聚合管中混合均匀，用注射器加入浓度为0.2~0.3mol/L的辛酸亚锡的无水甲苯溶液，辛酸亚锡与反应物PEOTMC-PEG-PEOTMC+三亚甲基碳酸酯的摩尔比为1:100~10000，室温下抽真空、通氮气，反复置换4~6次，封闭密封式玻璃聚合管，置于100~150℃油浴中搅拌反应20~30h；反应结束后，将产物溶于二氯甲烷中，用甲醇沉淀纯化2~4次得到PEOTMC-PEG-PEOTMC与三亚甲基碳酸酯的嵌段共聚物PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC，真空干燥至衡重，密封后冷藏保存；
（5）在圆底烧瓶中将步骤（4）合成的PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物溶于二氯甲烷形成溶液，PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物的浓度为5~15wt%，将所述溶液置于冰浴中冷却到0℃，然后依次逐滴滴加分别为PTMC-PEOTMC-PEG-PEOTMC-PTMC嵌段共聚物2~4倍摩尔当量的三乙胺和甲基丙烯酰氯；反应混合物在0℃时搅拌3~5h，然后在室温下静置1~3h，过滤，除去三乙胺盐酸盐，滤液用过量石油醚沉淀，得到功能化聚三亚甲基碳酸酯，最后在35~40℃真空条件下干燥至恒重；
（6）将浓度为5~10wt%的丝素蛋白水溶液与功能化聚三亚甲基碳酸酯按质量比2~4:1混合形成溶液，加入所述溶液0.5~2wt%的光引发剂后，倒入培养皿中，并将活细胞以0.5~2×106 cells/ml 的密度加入其中，放置在强度为6~12 mW/cm2，波长为365 nm的紫外灯下光照4~6 min形成水凝胶。
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