CN110305338B - 用于肿瘤微球入侵检测的双网络水凝胶的制备与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有生物活性的特异性双网络水凝胶用于3D肿瘤入侵检测的制备与应用方法；通过自主制备甲基丙烯改性明胶，与天然大分子、合成大分子复合得到双网络水凝胶，通过对两种材料比例的调节，以及甲基丙烯酸改性明胶取代度与浓度的调整，获得多种力学性能，可以针对性的符合多种真实的人体组织环境。并用于肿瘤微球入侵检测。本发明通过两个应用实例对两种不同的双网络水凝胶力学性能、生物相容性以及肿瘤微球入侵检测进行测试表征举例，证明检测结果有效。

Description

用于肿瘤微球入侵检测的双网络水凝胶的制备与应用方法
技术领域
本发明涉及一种特异性双网络水凝胶制备方法，用于对肿瘤的3D入侵能力的检测，属于细胞生物学和生物医用材料制备技术领域，尤其涉及生物材料复合制备领域。
背景技术
肿瘤是目前威胁人类健康的最主要因素，临床肿瘤病人的90％死亡率是由肿瘤入侵其他器官组织导致的，肿瘤入侵的过程是复杂而难以控制的。某种程度上说，防止肿瘤入侵即能控制肿瘤所致的死亡。因此肿瘤的入侵检测就变得尤其重要。体外三维培养特别适合于模拟肿瘤微环境，并能更好的模拟肿瘤的生物学特性。为肿瘤细胞微球构建合适的体外环境就显得非常必要。
水凝胶材料因其独特的多孔结构，三维网状结构，在水中能吸收大量水分子溶胀而不被溶解。水凝胶比其他任何合成生物材料都接近活体组织，它在性质上类似于细胞外基质部分，吸水溶胀以后可减少对周围组织的摩擦和机械作用，有效改善材料的生物学性能。水凝胶材料在组织工程和再生医学领域有着极大的应用前景。目前单一的水凝胶在力学性能以及生物相容性上面不能很好地满足细胞的生长与迁移。需要引入另一种物质有针对性的调节力学性能等参数，制备出具有特异性功能的双网络水凝胶，更真实的模拟人体组织环境情况。
将肿瘤微球与特异性双网络水凝胶有机的结合起来可以很真实的模拟肿瘤在人体内的实际生长迁移状态。最大程度上减少基础实验与临床实践的差异，为3D肿瘤细胞微球提供更真实的生长环境，更有效的检测肿瘤细胞的入侵情况。现有技术中有多种双网络水凝胶应用案例，例如明胶与透明质酸双网络水凝胶，用于骨髓间充质干细胞成骨分化研究；但其双网络水凝胶是与细胞混养来观察细胞个体的一个分化现象，其应用局限于人体的正常细胞。尚未有针对肿瘤微球入侵检测的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有生物活性的特异性双网络水凝胶用于3D肿瘤入侵检测的制备与应用方法；涉及生物材料复合制备领域。通过本发明提供的技术方案，制备的特异性双网络水凝胶具有适合的多孔结构、良好的力学性能和生物活性，并且可以通过调节两种水凝胶的配比等参数调节力学性能，进而有针对性的模拟人体的组织器官，为3D肿瘤细胞微球提供更真实的生长环境，更有效的检测肿瘤细胞的入侵情况；并且工艺简单、成本低、无污染。
本发明提供的一种具有生物活性的特异性双网络水凝胶用于3D肿瘤入侵检测的制备方法，包括如下步骤：1)明胶的改性处理；2)3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备；3)特异性双网络水凝胶在3D肿瘤微球入侵检测中的原位交联。
依照本发明的一个方面，所述明胶的改性处理包括：将明胶在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改性明胶；所述碱性环境包括以碱性缓冲液来提供，所述碱性缓冲液包括浓度为0.1～0.25mol，PH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液等，所述改性剂包括(甲基)丙烯酸或(甲基)丙烯酸酐等，所述纯化包括使用透析、冻干等方法。
作为一种选择，所述明胶在所述碱性缓冲液中的浓度为10～20(w/v)％；所述改性剂与明胶的配比(W/V)为10g/0.3mL～10g/1mL；所述改性明胶包括摩尔取代度为0.3～0.9的甲基丙烯酸改性明胶。
作为另一种选择，将所述明胶溶解于所述碱性缓冲液中，PH＝9.5，50～60℃搅拌均匀；所述明胶在所述碱性缓冲液中的浓度为10～20(w/v)％；将甲基丙烯酸酐以0.5mL/min速度通入溶解的明胶中，并不断搅拌。所述甲基丙烯酸酐与所述明胶的配比(W/V)为10g/0.3mL～10g/1mL。40～50℃条件下反应，搅拌反应时间为1.5～3小时；反应结束后，35～55℃下进行透析4～7天，将透析液以-20～-80℃冻干得到摩尔取代度0.3～0.9的甲基丙烯酸改性明胶。
依照本发明的另一个方面，所述3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备包括：将改性明胶与天然大分子和/或有机合成大分子按比例混合于缓冲液中，形成所述双网络前体溶液。根据改性明胶的取代度、改性明胶的浓度、天然大分子和/或有机合成大分子的浓度作为调节获取不同性能水凝胶的因素。
作为一种选择，所述天然大分子包括海藻酸盐、胶原、透明质酸或硫酸软骨素等；所述有机合成大分子包括Mw分子量为600-1000000的聚乙二醇二丙烯酸酯、Mw分子量为1000-1000000的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或聚乙二醇。
作为一种选择，所述缓冲液包括浓度为0.1～0.25mol，PH9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
作为另一种选择，将纯化的改性明胶、所述天然大分子和/或有机合成大分子分别溶于缓冲液中，制得一定浓度的溶液；然后将上述两种溶液按比例混合得到所述双网络前体溶液。
作为一种选择，所述3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备还包括：在所述双网络前体溶液中引入引发剂，并避光和保存；所述引发剂包括光引发剂，优选2-羟基-2-甲基苯丙酮或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐等。
作为另一种选择，所述引发剂先与改性明胶混合，在缓冲液中形成光引发剂浓度为0.0023～0.017mol/L的溶液。
作为另一种选择，先将所述引发剂溶于超纯水中，配置成一定浓度的溶液来使用。
依照本发明的另一个方面，所述特异性双网络水凝胶在3D肿瘤微球入侵检测中的原位交联通过包括如下的步骤来实现：在培养并载有肿瘤细胞微球的培养器皿中加入所述双网络前体溶液，先通过光致交联反应形成第一重网络，然后通过改变操作进行第二重网络的交联，最终形成具有生物活性的特异性双网络水凝胶。
作为一种选择，所述光致交联反应包括使用波长为320～480nm(该波段包含紫外光与蓝光)、光强为5～100mw/cm2的紫外光以及蓝光波段，照射30s～300s。
作为一种选择，所述改变操作包括温度致交联、调节PH致交联；引入交联剂。
进一步地，所述交联剂包括二价离子盐溶液。
本发明同时提供一种具有生物活性的特异性双网络水凝胶用于3D肿瘤入侵检测的应用方法，包括：选择所要检测的肿瘤细胞，接种到培养器皿中培养成肿瘤细胞微球，通过如权利要求1～15任意一项所述的制备方法制得所述具有生物活性的特异性双网络水凝胶，并连续进行细胞培养5～14天，观察肿瘤细胞微球的迁移情况，以及做出检测。
依照本发明的一个方面，所述肿瘤细胞包括人体乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人体肺癌细胞(NCI-H23)。
依照本发明的另一个方面，所述肿瘤细胞按一定的量接种到特定的培养器皿中，培养成肿瘤细胞微球。
依照本发明的另一个方面，所述培养器皿包括细胞培养板，所述细胞培养板优选U型底抗细胞粘附96孔板。
依照本发明的另一个方而，在载有肿瘤细胞微球的培养器皿中加入50～200微升的双网络前体溶液。
作为一种选择，选取所要检测的肿瘤细胞，按量接种到特定的细胞培养板中，培养成肿瘤细胞微球，将所述双网络前体溶液加入载有肿瘤细胞微球的细胞培养板(96孔板)中，以一定波长和光强的紫外光或蓝光照射一定时间，形成第一重网络；然后改变操作，进行第二重网络的交联；最终形成具有生物活性的特异性双网络水凝胶。按照细胞培养正常方式培养5～14天，观察肿瘤细胞微球的迁移情况，并做相应检测。
进一步地，所述双网络前体溶液加入量为50～200微升。
更进一步地，所述光的波长为320～480nm，光强为5～100mw/cm2，照射时间为30s～300s。
更进一步地，所述改变操作包括变化温度、引入相应的交联剂、调节PH等。
由此描述了本发明，但显然本发明可在许多方面变化，这些变化不应看做背离了本法的精神和范围，且所有这样的修饰对于本领域技术人员而言都是显而易见的，并意欲包括在本专利权利要求的范围内。
与现有技术相比，本发明具有有益的技术效果包括：
1、本发明提供了用于3D肿瘤微球入侵检测的优选的改性明胶原料及其制备方法，通过大量试验确定了合适的改性剂以及改性条件，并确定了为获得该改性明胶原料多种取代度的最优制备方法。作为最优的实施例，摩尔取代度0.3～0.9的甲基丙烯酸改性明胶对于制备具有适用于3D肿瘤微球入侵检测的特异性双网络水凝胶的性能，起到了重要的作用，并决定了该双网络水凝胶的生物活性。
2、本发明提供的技术方案通过对水凝胶不同种类、比例以及成胶方式的调整，可得到多种类型的水凝胶，从而在力学性能、生物活性上更真实的模拟多种人体组织，最大程度上减少基础实验与临床实践的差异，为3D肿瘤入侵体外检测提供了更广泛的选择。
3、本发明优选了改性明胶与部分类型大分子复合形成具有生物活性的特异性双网络水凝胶的方法及条件，通过仅先制备双网络水凝胶前体溶液的方式，可实现后续在肿瘤微球中形成人体组织的模拟材料。
4、另外，本发明研究发现通过特异性双网络水凝胶复合的方法，以不同种类的复合水凝胶还可满足特异性双网络水凝胶针对不同类型肿瘤入侵检测的应用。
5、本发明提供的技术方案，包括以条件改变的方式实现双重网络结构的水凝胶成型方法，通过创造性的实验发现该方法可以实现制备可模拟不同的人体组织，从而满足多种3D肿瘤入侵的体外检测环境。研究发现，交联条件对双网络水凝胶力学性能以及孔径大小具有较大影响。
6、由于细胞微球相比于单个细胞更接近于人体的真实情况，本发明采用对所要检测的肿瘤细胞进行培养，形成肿瘤细胞微球，进而形成肿瘤团块三维结构，通过肿瘤细胞间相互作用，微球内形成具有侵袭转移能力的肿瘤类组织体，更能模拟肿瘤入侵其他正常组织的真实状态。
7、本发明创造性地采用了在肿瘤微球培养环境中原位交联形成具有生物活性的特异性双网络水凝胶，进而用于3D肿瘤入侵的观察和检测。由于涉及细胞生长的环境的复杂性，对水凝胶的网络结构形成条件要求也便较为苛刻，本发明通过大量的试验发现了特异性双网络水凝胶原位形成的可能性并确定了合适的条件。
8、本发明还同时提供了特异性双网络水凝胶在3D肿瘤微球入侵检测上的一种应用方法，实验结果证实其具有操作简单、结果真实有效等优点。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1：双网络水凝胶SEM扫描图
图2：脱细胞乳腺肿瘤组织SEM扫描图
图3：MDA-MB-231肿瘤微球在上述双网络水凝胶中第5天入侵情况
图4：MDA-MB-231肿瘤微球在上述双网络水凝胶中第5天入侵情况
图5：NCI-H23肿瘤微球在上述双网络水凝胶中第5天入侵情况
图6：NCI-H23肿瘤微球在上述双网络水凝胶中第5天入侵情况
图7：实例中两种双网络水凝胶弹性模量G’
图8：实例中两种双网络水凝胶生物相容性(细胞活性)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述反应物如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1：
海藻酸盐/甲基丙烯酸改性明胶(Alginate/Gel-MA)双网络水凝胶制备与应用
将明胶溶解于PH＝9.5浓度为0.25mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，60℃下搅拌均匀。明胶浓度10％(W/V)，将甲基丙烯酸酐通入溶解的明胶中，甲基丙烯酸酐与明胶配比为0.58mL/10g，50℃条件下反应，反应时间为2小时。反应结束后，40℃进行透析7天，将透析液-80℃冻干得到摩尔取代度0.6的甲基丙烯酸改性明胶。
取上述甲基丙烯酸改性明胶1g溶于0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，使得甲基丙烯酸改性明胶百分浓度为20％(W/V)。将苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶于超纯水中，配置浓度为0.0068mol/L的溶液。将上述两种溶液按比例混合得到最终双网络水凝胶前溶液，其中，甲基丙烯酸改性明胶浓度为5％(W/V)，苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐光引发剂浓度为0.5％的缓和溶液，避光保存。
将海藻酸盐溶于0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，百分浓度2％(W/V)，磁力搅拌2h至完仝溶解。
将上述海藻酸盐溶液按比例加入到甲基丙烯酸改性明胶与光引混合液中，使得甲基丙烯酸改性明胶最终浓度为10％，海藻酸盐最终浓度为1％，避光保存。
成胶方法：
取上述甲基丙烯酸改性明胶与海藻酸盐混合液1毫升加入模具中，405纳米波长，35mw/cm2光照30秒，光致交联形成第一重网络。打升模具，将上述水凝胶浸入0.1mol/L的氯化钙溶液中，保持5分钟后拿出水凝胶，海藻酸盐第二重网络交联完成，PBS浸泡清洗三次，最终得到厚度为1mm特异性双网络水凝胶薄片。将上述双网络水凝胶取出，防于盛有0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠的无菌培养皿中，37摄氏度溶胀48小时后，用直径20mm打孔器打孔得到直径20mm，厚度1mm的水凝胶薄片，用TA流变仪测试水凝胶内部弹性模量G’为32.44±5.81KPa(如图7)。已知肺部组织硬度(以性模量表征)22-560KPa，此方法制备的双网络水凝胶与肺基质硬度相似。将上述特异性双网络水凝胶前体溶液50微升加入到含有50微升细胞培养基盛有人体乳腺癌细胞MDA-MB-2313D肿瘤微球的96孔板中，405纳米波长，35mw/cm2光照1分钟，光致交联成第一重网络。取100微升0.1mol/L的氯化钙溶液加入上述微孔中，保持5分钟后将液体吸出，海藻酸盐第二重网络的交联完成，最终得到特异性双网络水凝胶，按照细胞培养正常方式培养5～14天。并进行拍照观察MDA-MB-231肿瘤细胞微球入侵情况，图3和图4为培养第5天肿瘤细胞微球的入侵情况，可见明显迁移入侵。通过检测细胞活性状态确认双网络水凝胶的生物相容性，图8中海藻酸盐/甲基丙烯酸改性明胶(Alginate/Gel-MA)细胞活性高于60％。
实例2：
I型胶原/甲基丙烯酸改性明胶(Collagen/Gel-MA)双网络水凝胶制备与应用
将明胶溶解于PH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，60℃搅拌均匀。明胶浓度10％(W/V)，将甲基丙烯酸酐通入溶解的明胶中，甲基丙烯酸酐与明胶配比为0.4mL/10g，50℃条件下反应，反应时间为2小时。反应结束后，40℃进行透析7天，将透析液-80℃冻干得到摩尔取代度0.35的甲基丙烯酸改性明胶。
取上述甲基丙烯酸改性明胶1g溶于0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中，使得甲基丙烯酸改性明胶浓度为20％(W/V)。
将苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶于超纯水中，配置浓度为0.0068mol/L的溶液。
配置I型胶原溶液，将0.6mL6M的乙酸，0.7mLI型胶原，0.2mL培养基，混合均匀，并保存于4℃冰箱。
将前述甲基丙烯酸改性明胶、胶原溶液，及苯基(2，4，6三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐溶液按体积比1∶1∶0.4混合，之后在上述混合液中加入1M氢氧化钠溶液调节PH为8.5，上述操作在冰盒上进行，并且操作迅速。
成胶方法：
取上述双网络水凝胶前体混合液1毫升加入模具中，405纳米波长，35mw/cm2光照30秒，光致交联形成第一重网络；之后放入37摄氏度培养箱30分钟，交联形成第二重网络。打开模具，PBS浸泡清洗三次，最终得到厚度为1mm特异性双网络水凝胶薄片。将上述双网络水凝胶取出，于盛有0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠的无菌培养皿中，37摄氏度溶胀48小时后，用直径20mm打孔器打孔得到直径20mm，厚度1mm的水凝胶薄片，用TA流变仪测试水凝胶内部弹性模量G’为233.85±16.01Pa(如图7)。已知肺部组织硬度(以性模量表征)200-400Pa，此方法制备的双网络水凝胶与肺基质硬度相似。
将上述特异性双网络水凝胶前体溶液50微升加入到含有50微升细胞培养基且盛有人肺癌细胞NCI-H233D肿瘤微球的96孔板中，以波长405nm，光强35mw/cm2的紫外光照30秒，形成甲基丙烯酸改性明胶第一重网络，之后将上述96孔板放入36℃培养箱中培养30分钟，得到胶原第二重网络，进而形成特异性双网络水凝胶。按照细胞培养正常方式培养5～14天。并进行拍照观察NCI-H23肿瘤细胞微球入侵情况(图5-6)。图5和图6为培养第5天肿瘤细胞微球的入侵情况，可见明显迁移入侵。通过检测细胞活性状态确认双网络水凝胶的生物相容性，图8中I型胶原/甲基丙烯酸改性明胶(Collagen/Gel-MA)细胞活性高于70％。
通过扫描电子显微镜观察对比，如图1和图2所示，其中一种双网络水凝胶结构扫描电镜图与脱细胞乳腺肿瘤组织结构相似，均具有多孔结构，肿瘤细胞可进行迁移生长。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以权利要求为准。

Claims (7)

1.一种用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)明胶的改性处理，所述明胶的改性处理包括：将明胶在碱性环境下与改性剂反应并纯化以获得改性明胶；所述碱性环境包括以碱性缓冲液来提供，所述碱性缓冲液包括浓度为0.1～0.25mol，pH值9～11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，所述改性剂包括(甲基)丙烯酸或(甲基)丙烯酸酐，所述纯化包括使用透析、冻干的方法；2)3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备，所述3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备包括：将改性明胶与天然大分子和/或有机合成大分子混合于缓冲液中，形成所述水凝胶双网络前体溶液；3)特异性双网络水凝胶在3D肿瘤微球入侵检测中的原位交联，所述特异性双网络水凝胶在3D肿瘤微球入侵检测中的原位交联通过包括如下的步骤来实现：在培养并载有肿瘤细胞微球的培养器皿中加入所述水凝胶双网络前体溶液，先通过光致交联反应形成第一重网络，然后通过改变操作进行第二重网络的交联，最终形成具有生物活性的特异性双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶在所述碱性缓冲液中的浓度为10～20w/v％；所述改性剂与明胶的W/V配比为10g/0.3mL～10g/1mL；和/或：
所述改性明胶包括摩尔取代度为0.3～0.9的甲基丙烯酸改性明胶。
3.根据权利要求1所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述天然大分子包括海藻酸盐、胶原、透明质酸或硫酸软骨素；所述有机合成大分子包括Mw分子量为600～1000000的聚乙二醇二丙烯酸酯、Mw分子量为1000～1000000的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或聚乙二醇；和/或：
所述缓冲液包括0.01M磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液；和/或：
所述3D肿瘤入侵检测用水凝胶双网络前体溶液的制备还包括：在所述水凝胶双网络前体溶液中引入引发剂，并避光保存；所述引发剂包括光引发剂。
4.根据权利要求3所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光引发剂包括2-羟基-2-甲基苯丙酮或苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
5.根据权利要求3所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述引发剂先与改性明胶混合，在缓冲液中形成光引发剂浓度为0.0023～0.017mol/L的溶液。
6.根据权利要求1所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光致交联反应包括使用波长为320～480nm、光强为5～100mw/cm2的紫外光以及蓝光波段，照射30s～300s；和/或：
所述改变操作包括温度致交联、引入交联剂、调节PH致交联。
7.根据权利要求6所述的用于3D肿瘤入侵检测的具有生物活性的特异性双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括二价离子盐溶液。
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