CN110302427A - 一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种凝胶材料，特别涉及一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料及其制备方法，属于组织工程技术领域。本发明中海藻酸盐凝胶的制备是以HAP/GDL复合物作为内源交联剂，其中HAP与GDL的摩尔比为1:10，同时确定HAP中Ca元素与海藻酸钠(SA)中–COOH的摩尔比为0.18~0.36；随后通过静电作用将带正电的壳聚糖(CS)与带负电的B型明胶(GT)(胶原蛋白或丝胶蛋白)交替地覆积在海藻酸盐凝胶表面；最后采用EDC/NHS混合物对最外层的GT(胶原蛋白或丝胶蛋白)进行共价交联，从而制得均相交联的海藻酸盐复合凝胶支架。

Description

一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝 胶支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种凝胶材料，特别涉及一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料及其制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术
组织工程支架旨在模拟天然细胞外基质(ECM)的功能，通过刺激和引导细胞在其材料上的粘附、增殖和分化中产生三维(3D)组织，从而实现受损组织的修复和再生。为了发挥这一功能，它必须具有一定的表面活性以促进细胞的粘附、增殖和分化，足够的机械强度以承受体内应力和生理负荷，可控的降解速率以匹配组织的重生。海藻酸盐作为一种理想的生物材料，由于其缺乏细胞特异性结合位点，机械性能差，凝胶结构在生理环境下容易遭受破坏，而限制了其在骨组织工程支架材料中的应用。而且使用海藻酸盐这类天然高分子材料制造出质地均匀且结构规整的组织工程支架仍然是当前构建支架材料的一个难点。
通常海藻酸盐这些缺陷可以通过一些途径或方法加以更正或解决。据报道海藻酸盐通过内源交联制备的均匀凝胶可以有效提高支架材料的机械强度和机械完整性。海藻酸盐的内源交联是指预先将钙的难溶盐与海藻酸盐溶液混合均匀，再通过葡萄糖酸内酯(GDL)降低溶液pH，使Ca2+缓慢释放出来从而引发的均匀交联。所使用钙的难溶盐一般为CaCO3、CaSO4和Ca3(PO4)2等。在交联过程中，这些无机盐在GDL的酸解作用下释放Ca2+的速率过于缓慢，容易造成该无机盐的重力沉降，致使交联不均匀。而且CaCO3在交联过程中释放的CO2会造成材料孔隙过大，破坏其机械强度。因此，选择一种合适的钙盐引发海藻酸盐的均相交联是提高其支架材料结构、形态和机械性能的有效途径。
据报道在海藻酸盐的基体中通过物理共混ECM蛋白如层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白等，或化学偶联RGD多肽序列可提高海藻酸盐的细胞粘附性。但是蛋白质的物理混合一般较难控制，常常会导致非特异性相互作用，引发免疫反应和蛋白质的水解。化学偶联RGD多肽序列是基于碳化二亚胺化学方法，该过程势必会引入有机溶剂，降低材料的生物相容性。因此，选择合理的方法提高海藻酸盐凝胶的表面活性，对于支架材料的成功设计和医疗应用显得十分重要。
值得注意的是，羟基磷灰石(HAP)作为骨组织的主要无机成分，它自身也是一种难溶性的钙盐，可以被看作是Ca3(PO4)2和Ca(OH)2组成的碱式复合盐。它遇酸能够快速地释放少量钙离子，形成微凝胶，防止其自身的重力沉降。由于它具有良好的生物相容性和骨引导性，在本发明中创新性地作为交联剂应用于海藻酸盐均相凝胶的制备中。就目前而言，鲜有报道HAP/GDL作为内源交联剂。
另外，海藻酸盐是一种聚阴离子电解质，可以与聚阳离子电解质如壳聚糖、明胶、聚(L-赖氨酸)和聚(L-鸟氨酸)等通过静电相互作用形成聚电解质复合凝胶。而且在自然界中，生物世界是通过生物大分子的静电组装而建立的，它为组织工程支架材料的构建提供了研究思路。
发明内容
本发明利用天然可再生的、储量大、与人类骨组织结构和性能接近的天然生物大分子,研制出质地均匀且结构规整、具有降解性能可控、机械强度合适,并且表面具有粘附、识别和诱导等特性的基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料，通过解决单一海藻酸盐凝胶在生物应用中依然存在的缺乏细胞特异性结合位点，机械性能差，凝胶稳定性低等缺陷问题，提高其临床应用性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)海藻酸钠(SA)溶于水制得SA溶液，向SA溶液中加入羟基磷灰石(HAP)粉末和生物活性纳米粒，在超声辅助作用下搅拌充分，得到混合液A；
(2)在上述混合液A中加入GDL引发离子交联，得到混合液B，搅拌1～3min之后迅速转入多孔组织培养板中，密封后交联反应，得到海藻酸盐水凝胶，然后将此凝胶浸泡冲洗以除去未参与反应的化合物和杂质，最后冷冻干燥得到海藻酸盐凝胶支架材料(Alg Gel)；所述的交联反应一般是于4℃下交联反应24小时以上，交联时为防止液体挥发，采用保鲜膜封住培养板，
(3)将干燥的Alg Gel浸入壳聚糖(CS)溶液中，孵化30～60min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止，清洗后的凝胶经冷冻干燥后得到表面覆积CS的复合凝胶支架(Alg-CS)；
(4)再将干燥的Alg-CS浸入含RGD多肽序列且带负电的聚合物溶液中，孵化30～60min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗，最后将清洗干净的复合凝胶投入EDC和NHS混合交联剂中，孵育过夜，取出后用超纯水反复清洗，得到的产物经冷冻干燥即得均相交联的海藻酸盐复合凝胶(Alg-CS-GT)支架材料。上述方法制备的海藻酸盐复合凝胶支架材料具有良好的3D形态和均匀的孔隙结构，适宜的机械性能，良好的生物降解性能，以及优异的细胞相容性，可作为理想的支架材料应用于组织修复中。
本发明所述的海藻酸盐复合凝胶支架材料的制备方法，工艺流程图见图1，本发明中海藻酸盐凝胶的制备是以HAP/GDL复合物作为内源交联剂，其中HAP与GDL的摩尔比为1:10，同时确定HAP中Ca元素与海藻酸钠(SA)中–COOH的摩尔比为0.18～0.36；随后通过静电作用将带正电的壳聚糖(CS)与带负电的B型明胶(GT)(胶原蛋白或丝胶蛋白)交替地覆积在海藻酸盐凝胶表面；最后采用EDC/NHS混合物对最外层的GT(胶原蛋白或丝胶蛋白)进行共价交联，从而制得均相交联的海藻酸盐复合凝胶支架。以羟基磷灰石/葡萄糖酸内酯(HAP/GDL)复合物作为内源交联剂，实现海藻酸盐的均相交联；利用生物大分子的层层静电组装，实现支架材料表面的活化；通过物理共混方式添加生物活性纳米粒补强剂提高海藻酸盐凝胶支架材料的机械强度。
所述HAP作为一种难溶性的钙盐，可以被看作是Ca3(PO4)2和Ca(OH)2组成的碱式复合盐。它与酸的反应可以包含以下两个过程：
第一步：Ca10(PO4)6(OH)2+2H+→3Ca3(PO4)2+2H2O+Ca2+ 快速
第二步：Ca3(PO4)2+6H+→2H3PO4+3Ca2+ 慢速
其中，第一步反应较为迅速，在低酸浓度下主要生成难溶性的Ca3(PO4)2和少量Ca2 +。第二步反应需要较高的酸浓度，所以在弱酸中反应过程较为缓慢。常用的酸酯如GDL在水溶液中可缓慢水解形成葡萄糖酸及其δ内酯和у内酯。生成的葡萄糖酸是一种有机弱酸，能够与HAP快速发生第一步反应。海藻酸盐可与HAP在第一步弱酸降解释放的少量Ca2+形成微凝胶。该微凝胶的形成增加了溶液的粘度，可有效阻止HAP的重力沉降，从而制备出均匀的凝胶。
采用生物大分子间的层层静电组装，以一种可控的方式修饰材料表面是本发明构建复合支架材料的关键技术。由于海藻酸盐与壳聚糖，壳聚糖与B型明胶之间带有相反电荷，它们能够形成聚电解质复合物。由于B型明胶在水中具有较高的溶胀性，通常需要对其进行交联。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)被认为是一类温和的交联剂，它不会破坏胶原类分子的生物活性。采用EDC/NHS作为交联剂不仅可以提高材料的机械强度，而且也可以改善其生物活性。本发明将HAP/GDL引发的离子交联、聚电解质间层层组装和EDC/NHS的共价交联有机地组合起来，旨在为细胞活动创造一个充分模拟细胞外基质的环境。这种将海藻酸盐的均相交联和生物大分子间层层自组装相结合的方法，不仅消除了单种海藻酸盐材料的缺陷，而且赋予了其许多独特而优异的理化性能和生物活性，使其能够满足作为理想组织工程支架材料的应用要求。
本发明的创新点体现在以下三方面：
(1)提出了通过HAP/GDL体系的内源交联实现支架材料的凝胶均一性和机械完整性；
以羟基磷灰石(HAP)作为内源交联的钙源，在葡萄糖酸内酯(GDL)的水解作用下实现海藻酸盐的均相交联。羟基磷灰石(HAP)作为骨组织的主要无机成分，它既是一种难溶性的钙盐又是磷酸钙和氢氧化钙组成的碱式复合盐。在交联反应初期，它与GDL水解释放的有机弱酸葡萄糖酸迅速反应生成磷酸钙和少量钙离子。快速释放的钙离子与海藻酸盐形成的微凝胶可有效阻止交联过程中出现磷酸钙及其它材料的重力沉降，有效地促进了凝胶的均一性；
(2)提出了通过生物大分子的层层静电自组装提高海藻酸盐凝胶支架材料表面的活性，以促进细胞的粘附、增殖和分化。
利用生物大分子间所带异种电荷的静电作用力，实现材料表面的层层组装。通过带负电的海藻酸盐与带正电的壳聚糖之间形成的聚电解质复合物提高复合凝胶在生理盐水中的稳定性。进而，通过静电作用力将含有的RGD多肽序列且带负电的B型明胶(胶原蛋白或丝胶蛋白)包覆在材料的外表面，从而提高材料的机械强度和细胞粘附性；
(3)提出了通过物理共混方式添加生物活性纳米粒提高海藻酸盐凝胶支架材料的机械强度，以承受生理负荷。
为了消除单一的海藻酸盐水凝胶在生物应用中的缺陷，使各种材料之间互相取长补短，采用物理共混方法将一些具有生物活性的纳米材料如二氧化硅和二氧化钛纳米粒等掺入海藻酸盐凝胶基体中，通过组分优化构建出理想的复合支架材料。
作为优选，所述SA、CS和含RGD多肽序列且带负电的聚合物溶液的质量浓度分别为1.0％～2.0％、0.5％～1.0％和0.8％～1.5％。
作为优选，所述含RGD多肽序列且带负电的聚合物选自B型明胶(GT)、胶原蛋白(Col)或丝胶蛋白(SP)。其包覆在海藻酸盐复合凝胶支架材料最外层。
作为优选，步骤(1)中所述生物活性纳米粒选自SiO2、TiO2、Fe3O4和ZnO纳米粒中的一种或几种，添加生物活性纳米粒的质量分数为0.5％～2.5％。
作为优选，所述SA的质均分子量Mw≥100000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5。
作为优选，步骤(2)中，将海藻酸盐水凝胶放置于浸泡冲洗液中浸泡冲洗，所述浸泡冲洗液是0.005～0.05mol/L的氯化钙水溶液或含有0.5～1％壳聚糖(CS)和1.0～1.5％B型明胶(GT)、胶原蛋白或丝胶蛋白的0.005～0.05mol/L的氯化钙水溶液；在氯化钙水溶液中加入CS，B型明胶(GT)、胶原蛋白或丝胶蛋白，是为了防止Alg Gel在层层组装过程中过度溶胀而影响凝胶3D结构。
作为优选，步骤(2)中，混合液B中的HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与海藻酸钠(SA)中–COOH的摩尔比为0.18～0.36。
作为优选，所述冷冻干燥的条件是：先在冰箱中于-18℃下预冻30min，后转入冷阱中于-50～60℃下冷冻5～6小时。
作为优选，步骤(4)EDC和NHS混合交联剂中EDC和NHS的浓度分别为10～20mmol/L和5～15mmol/L。
一种所述的制备方法制得的海藻酸盐复合凝胶支架材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过HAP/GDL体系的内源交联和层层组装技术制备的海藻酸盐凝胶支架均呈现良好的3D形貌和均匀的孔隙结构，能够为细胞的三维增殖提供生长空间。改变交联剂的添加量，通过控制交联密度可以实现对海藻酸盐均相复合凝胶支架材料孔隙结构和形态的控制，使其利于细胞在支架孔隙内的增殖和渗透生长；
(2)层层组装过程中聚电解质复合物的形成及EDC/NHS对GT的共价交联改善了离子交联的脆弱性，提高了海藻酸盐均相复合凝胶支架材料的机械性能和溶胀稳定性，使其具有可控的降解速率。而且通过层层组装技术将GT包覆于材料最外层，其含有的RGD多肽可以有效地提高支架材料的细胞粘附性，从而改善支架材料的表面活性。而且通过改变沉积条件，就可以实现对覆积层薄膜理化性能的调控；
(3)利用材料分子间的相互作用，如静电吸引作用、范德华分子作用和氢键作用，实现材料间的优势互补，对改善单一海藻酸盐材料的机械性能具有显著的作用。它是目前开发优质复合材料最简便而重要的方法之一，具有操作简单、污染小、易实现等特点，可以广泛地推广应用。
附图说明
图1为基于均相交联和层层静电组装技术制备海藻酸盐复合凝胶支架材料的流程示意图；
图2为采用均相交联和层层静电组装技术制备海藻酸盐复合凝胶支架材料的实物图和剖切面扫描电镜图；
图3为MC3T3-E1细胞在组织培养板上的光学显微镜图；
图4为MC3T3-E1细胞在海藻酸盐复合凝胶支架材料上培养2天后的扫描电镜图，其中(a)Alg Gel、(b)Alg-GT、(c)Alg-CS-GT和(d)Alg/GT-CS；
图5为MC3T3-E1细胞在海藻酸盐凝胶支架上分别培养2天和5天后的细胞增殖比较图，*代表P<0.05，表示有显著性差异；
图6为MC3T3-E1细胞在海藻酸盐凝胶支架上培养7天后的细胞分化比较图，*代表P<0.05，表示有显著性差异。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
下述实施例中，
1、采用液体置换的方法对所述的海藻酸盐复合凝胶支架材料的孔隙率进行测试。
2、以磷酸缓冲液(PBS)包含10000U/mL的溶菌酶来模拟生理环境，在2周的时间内考查所述的海藻酸盐复合凝胶支架材料在模拟生理环境下的生物降解率。
3、采用小鼠MC3T3-E1细胞来评价海藻酸盐复合凝胶支架材料的生物相容性。其细胞培养液为90％MEM-α，另外各自补加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。应用于细胞培养的海藻酸盐复合凝胶支架材料，使用钴60射线灭菌，照射强度为8kGy。海藻酸盐复合凝胶支架材料在接种细胞前先在细胞培养基中浸泡12小时以上。将复苏的细胞在聚苯乙烯细胞培养皿中传2代后采用胰蛋白酶消化并收集。细胞经计数后以每孔5×104的密度接种到24孔组织培养板的支架材料上，同时将同样的细胞接种到无支架材料的组织培养板上作为空白对照。补充细胞培养液，使每孔的培养基总量达到500μL。随后将组织培养板放入含5％CO2的培养箱内，于37℃条件下培养，培养液每2天更换一次。分别通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)和碱性磷酸酶试剂盒(ALP Assay Kit，ALP)考察细胞在该支架材料上的粘附、增殖和分化情况。
实施例1
一种Alg/SiO2-CS-GT支架材料的制备方法具体步骤是：
配置浸泡冲洗液：在0.005mol/L的氯化钙溶液中分别配制质量分数为1％的壳聚糖(CS)溶液和质量分数为1.5％的明胶(GT)溶液备用。
准确称取2.0g SA溶于100mL去离子水中，于电力搅拌作用下制得质量分数为2％的SA透明溶液。再向该溶液中加入2.0g SiO2纳米粒和365.2mg HAP粉末，在超声辅助作用下高速搅拌(8000～12000转/分钟，下同)2小时，得到均匀的混合液。用30mL皮下注射器移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌作用下，加入194.4mg GDL引发离子交联，高速搅拌2min之后迅速转入12孔组织培养板中(转入3孔)。为防止液体挥发，采用保鲜膜封住培养板，于4℃下交联反应24小时，得到海藻酸盐水凝胶。然后将此凝胶放置于0.005mol/L的氯化钙溶液中浸泡冲洗3次，以除去未参与反应的化合物和杂质，最后冷冻干燥(先在冰箱中于-18℃下预冻30min，后转入冷阱中于-50～60℃下冷冻5～6小时)得到海藻酸盐凝胶支架材料。
随后将所得干燥的海藻酸盐凝胶支架材料浸入质量分数为1％的CS溶液中，30min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止。清洗后的凝胶经冷冻干燥后浸入质量分数为2％的GT溶液中，同样30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入分别含有10mmol/L的EDC和10mmol/L的NHS混合交联剂中，孵育过夜。然后取出，用超纯水反复清洗，之后产物经冷冻干燥即得到了均相交联的Alg/SiO2-CS-GT支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现良好的3D形貌和均匀的孔隙结构，其孔隙率为78％，孔径大小在160～300μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为13.6％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.29，展现出良好的分化效果。
实施例2
一种Alg/SiO2-CS-SP支架材料的制备方法具体步骤是：
以HAP/GDL复合物为交联剂，SiO2纳米粒为补强剂，通过生物大分子间的层层组装制备海藻酸盐复合凝胶支架材料。在材料的制备中，分别固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与SA中–COOH的摩尔比为0.18。
配置浸泡冲洗液：在0.01mol/L的氯化钙溶液中分别配制质量分数为0.6％的CS溶液和质量分数为1.0％的丝胶蛋白(SP)溶液备用。
在机械搅拌和超声作用下，分别将1.0g SiO2纳米粒和182.6mg的HAP粉末依次加入100mL质量分数为1.5％的SA溶液中。待其混合均匀后，用30mL皮下注射器移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌作用下，加入97.2mg GDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中。经保鲜膜包封后，放置于冰箱中，在4℃下交联反应24小时。然后将形成的凝胶在0.01mol/L的氯化钙溶液中浸泡冲洗3次，以除去未参与反应的化合物和杂质。清洗干净的水凝胶经过第1次冷冻干燥后，浸入质量分数为0.6％的CS溶液中。孵育30min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止。然后该凝胶材料经过第2次冷冻干燥后，浸入质量分数为1.0％的SP溶液中。同样孵育30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入分别含有20mmol/L的EDC和10mmol/L的NHS混合交联剂中，孵育过夜。之后取出，用超纯水反复清洗，最后的凝胶经第3次冷冻干燥后即得到干燥的Alg/SiO2-CS-SP支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现规整的3D形貌和发达的孔隙结构，其孔隙率为83％，孔径大小在180～330μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为16.1％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.18，展现出较好的分化效果。
实施例3
一种Alg/TiO2-CS-Col支架材料的制备方法具体步骤是：
以TiO2纳米粒为补强剂，HAP/GDL复合物为SA的内源交联剂，EDC/NHS混合物为GT的共价交联剂。并且HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与SA中–COOH的摩尔比为0.36。
配置浸泡冲洗液：在0.005mol/L的氯化钙溶液中分别配制质量分数为0.8％的CS溶液和质量分数为1.5％的胶原蛋白(Col)溶液备用。
依次将0.5g TiO2纳米粒和365.2mg的HAP粉末加入100mL质量分数为2％的SA溶液中，在超声搅拌的作用下使其混合均匀。然后移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入194.4mg GDL。高速搅拌2min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中，于4℃下交联反应24小时。然后将形成的凝胶在0.005mol/L的氯化钙溶液中浸泡冲洗3次，以除去未参与反应的化合物和杂质。清洗干净的水凝胶经冷冻干燥后，浸入质量分数为0.8％的CS溶液中，孵育30min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止。进而，该凝胶材料再次经过冷冻干燥后，浸入质量分数为1.5％的Col溶液中，同样孵育30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入含有15mmol/L的EDC和10mmol/L的NHS混合交联剂中孵育过夜。待其交联完成后，凝胶经超纯水反复清洗和冷冻干燥后得到了干燥的Alg/TiO2-CS-Col支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现内部展现蜂窝状的多孔结构，其孔隙率为81％，孔径大小在150～260μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为11.2％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.13，展现出较好的分化效果。
实施例4
一种Alg/TiO2-CS-GT支架材料的制备方法具体步骤是：
以HAP/GDL复合物为交联剂，固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与SA中–COOH的摩尔比为0.18。通过掺入TiO2纳米粒到SA基体中，结合带正电的CS和带负电的GT在海藻酸盐凝胶表面层层静电组装，从而制得Alg/TiO2-CS-GT支架。
分别将2.0g TiO2纳米粒和182.6mg的HAP粉末加入100mL质量分数为15％的SA溶液中，在超声搅拌的作用下使其混合均匀。然后移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入97.2mg的GDL。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中，于4℃下交联反应24小时。形成的凝胶经0.01mol/L的氯化钙溶液反复清洗和冷冻干燥后浸入质量分数为1％的CS溶液中。30min后取出，再次经去离子水反复清洗和冷冻干燥后浸入质量分数为1.5％的GT溶液中。30min后取出，用超纯水反复清洗，然后置入10mmol/L的EDC和5mmol/L的NHS混合交联剂中浸泡过夜。最后经超纯水反复清洗和冷冻干燥后得到了Alg/TiO2-CS-GT支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现良好的3D形态和多孔结构，其孔隙率为75.6％，孔径大小在140～280μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为14.4％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.34，展现出良好的分化效果。
实施例5
一种Alg/Fe3O4-CS-SP支架材料的制备方法具体步骤是：
以Fe3O4纳米粒为补强剂，HAP/GDL复合物为交联剂，固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与SA中–COOH的摩尔比为0.27。
配置浸泡冲洗液：在0.05mol/L的氯化钙溶液中分别配制质量分数为0.5％的CS溶液和质量分数为1.0％的丝胶蛋白(SP)溶液备用。
在机械搅拌和超声作用下，分别将1.0g Fe3O4纳米粒和273.9mg的HAP粉末依次加入100mL质量分数为1.5％的SA溶液中。待其混合均匀后，用30mL皮下注射器移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌作用下，加入145.8mg GDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中。经保鲜膜包封后，放置于冰箱中，在4℃下交联反应24小时。然后将形成的凝胶在0.05mol/L的氯化钙溶液中浸泡冲洗3次，以除去未参与反应的化合物和杂质。清洗干净的水凝胶经过第1次冷冻干燥后，浸入质量分数为0.5％的CS溶液中。孵育30min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止。然后该凝胶材料经过第2次冷冻干燥后，浸入质量分数为1.0％的SP溶液中。同样孵育30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入分别含有15mmol/L的EDC和15mmol/L的NHS混合交联剂中，孵育过夜。之后取出，用超纯水反复清洗，最后的凝胶经第3次冷冻干燥后即得到干燥的Alg/Fe3O4-CS-SP支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现规整的3D形貌和发达的孔隙结构，其孔隙率为79.3％，孔径大小在160～300μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为12.1％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.20，展现出较好的分化效果。
实施例6
一种Alg/ZnO-CS-Col支架材料的制备方法具体步骤是：
以ZnO纳米粒为补强剂，HAP/GDL复合物为交联剂，固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与SA中–COOH的摩尔比为0.36。
配置浸泡冲洗液：在0.005mol/L的氯化钙溶液中分别配制质量分数为1.0％的CS溶液和质量分数为1.0％的胶原蛋白(Col)溶液备用。
在机械搅拌和超声作用下，分别将0.5g ZnO纳米粒和365.2mg的HAP粉末依次加入100mL质量分数为1.5％的SA溶液中。待其混合均匀后，用30mL皮下注射器移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌作用下，加入194.4mg GDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中。经保鲜膜包封后，放置于冰箱中，在4℃下交联反应24小时。然后将形成的凝胶在0.005mol/L的氯化钙溶液中浸泡冲洗3次，以除去未参与反应的化合物和杂质。清洗干净的水凝胶经过第1次冷冻干燥后，浸入质量分数为1.0％的CS溶液中。孵育30min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止。然后该凝胶材料经过第2次冷冻干燥后，浸入质量分数为1.0％的Col溶液中。同样孵育30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入分别含有10mmol/L的EDC和10mmol/L的NHS混合交联剂中，孵育过夜。之后取出，用超纯水反复清洗，最后的凝胶经第3次冷冻干燥后即得到干燥的Alg/ZnO-CS-Col支架材料。
所得海藻酸盐复合凝胶支架材料呈现规整的3D形貌和均匀的孔隙结构，其孔隙率为77.4％，孔径大小在180～320μm之间。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为11.8％。MC3T3-E1细胞在该海藻酸盐复合凝胶支架材料上能够表现出良好的细胞粘附性和增殖活力，其相对碱性磷酸酶(ALP)约为1.16，展现出较好的分化效果。
效果验证试验1
所述的海藻酸盐复合凝胶支架材料经刀片切割和喷金处理后，即可在扫描电镜(SEM)下观察复合凝胶支架的孔隙结构形貌。实物图和剖切面扫描电镜图见图2，从图2中可以看出，海藻酸盐凝胶支架展现出良好的3D形貌，说明以HAP/GDL作为交联剂制备均匀海藻酸盐凝胶的方法是切实可行的，而且凝胶材料在层层组装过程中没有破坏其3D架构。以HAP/GDL作为交联剂制备的均匀水凝胶，经过冷冻处理后在其凝胶内均匀地形成冰晶，冰晶经负压升华后，在凝胶内留下开放的多孔结构。
效果验证试验2
图3为MC3T3-E1细胞在组织培养板上的光学显微镜图片。从图3中可以看出，MC3T3-E1细胞在组织培养板上表现出较高的生长活力，在2天的时间内增殖效果显著。
MC3T3-E1细胞在海藻酸盐复合凝胶支架材料上培养2天后的扫描电镜图如图4所示，图4中，由于海藻酸盐缺乏细胞特异性结合位点，Alg Gel上粘附的细胞较少，分散性较差，而且主要集中在孔隙附近。相比之下，Alg-GT和Alg-CS-GT表现出较好的细胞粘附性和分散性，细胞在材料的孔隙内和孔壁结构上均有分布。这主要是因为支架材料最外层的GT含有的RGD多肽可以有效地提高支架材料的细胞粘附性。
MC3T3-E1细胞在海藻酸盐凝胶支架上分别培养2天和5天后的细胞增殖结果见图5，从图5中可以看出，细胞在海藻酸盐凝胶支架上分别培养2天和5天后，因支架材料的不同而呈现不同的增殖差异。海藻酸盐凝胶支架由于具有良好的3D形貌和多孔结构，能够为细胞的三维增殖提供生长空间，因此其OD值高于对照组。尤其是GT通过层层组装覆积于Alg-CS-GT复合支架材料表面，使其展现出最好的细胞活力和增殖能力。
MC3T3-E1细胞在海藻酸盐凝胶支架上培养7天后的细胞分化结果见图6，从图6中可以看出，细胞经过7天的培养后，在海藻酸盐复合凝胶支架上的碱性磷酸酶(ALP)活性相对于对照组均有不同程度的提高，并且在Alg-CS-GT上的相对ALP活性，显著高于对照组和Alg Gel，说明Alg-CS-GT能够表现出较好的分化效果。
综上，本发明将离子交联、聚电解质复合和化学交联有机地结合起来，既提高了支架材料的力学性能和形态稳定性，又提高了其生物活性和在生理盐水中的稳定性。所制备的海藻酸盐复合凝胶支架材料具有良好的3D形态和均匀的孔隙结构，适宜的机械性能，良好的生物降解性能，以及优异的细胞相容性，可作为理想的支架材料应用于组织修复中。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种基于均相交联和层层自组装技术构筑的海藻酸盐复合凝胶支架材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)海藻酸钠(SA)溶于水制得SA溶液，向SA溶液中加入羟基磷灰石（HAP）粉末和生物活性纳米粒，在超声辅助作用下搅拌充分，得到混合液A；
(2)在上述混合液A中加入GDL引发离子交联，得到混合液B，搅拌1~3 min之后转入多孔组织培养板中，密封后交联反应，得到海藻酸盐水凝胶，然后将此凝胶浸泡冲洗以除去未参与反应的化合物和杂质，最后冷冻干燥得到海藻酸盐凝胶支架材料（Alg Gel）；
(3)将干燥的Alg Gel浸入壳聚糖(CS)溶液中，孵化30~60 min后取出，在去离子水中浸泡冲洗多次以除去未覆积的CS，直至洗液的pH值达到中性为止，清洗后的凝胶经冷冻干燥后得到表面覆积CS的复合凝胶支架(Alg-CS)；
(4)再将干燥的Alg-CS浸入含RGD多肽序列且带负电的聚合物溶液中，孵化30~60 min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗，最后将清洗干净的复合凝胶投入EDC和NHS混合交联剂中，孵育过夜，取出后用超纯水反复清洗，得到的产物经冷冻干燥即得均相交联的海藻酸盐复合凝胶(Alg-CS-GT)支架材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SA、CS和含RGD多肽序列且带负电的聚合物溶液的质量浓度分别为1.0%~2.0%、0.5%~1.0%和0.8%~1.5%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述含RGD多肽序列且带负电的聚合物选自B型明胶(GT)、胶原蛋白(Col)或丝胶蛋白(SP)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述生物活性纳米粒选自SiO2、TiO2、Fe3O4和ZnO纳米粒中的一种或几种，添加生物活性纳米粒的质量分数为0.5%~2.5%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SA的质均分子量Mw≥100000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，将海藻酸盐水凝胶放置于浸泡冲洗液中浸泡冲洗，所述浸泡冲洗液是0.005~0.05 mol/L的氯化钙水溶液或含有0.5~1%壳聚糖(CS)和1.0~1.5% B型明胶(GT)、胶原蛋白或丝胶蛋白的0.005~0.05 mol/L的氯化钙水溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，混合液B中的HAP与GDL的摩尔比为1:10， HAP中Ca元素与海藻酸钠(SA)中–COOH的摩尔比为0.18~0.36。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥的条件是：先在冰箱中于-18 ℃下预冻30 min，后转入冷阱中于-50~60 ℃下冷冻5~6小时。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）EDC和NHS混合交联剂中EDC和NHS的浓度分别为10~20 mmol/L和5~15 mmol/L。
10.一种权利要求1所述的制备方法制得的海藻酸盐复合凝胶支架材料。
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