CN115212353B - 一种生物支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种生物支架及其制备方法与应用，所述生物支架由上到下包括：透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层；所述生物支架通过将透明软骨层的制备原料、钙化软骨层的制备原料和软骨下骨层的制备原料进行生物3D打印得到；所述透明软骨层的制备原料包括组分A和组分B；所述钙化软骨层的制备原料包括组分A’、组分B’和组分C’；所述软骨下骨层的制备原料包括组分A”、组分B”和组分C”。所述生物支架充分利了用动态交联作用从而实现层级界面的有效融合，具有良好的骨软骨损伤修复支架应用前景。

Description

一种生物支架及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及一种生物支架及其制备方法与应用，属于高分子复合材料领域。
背景技术
在日常关节活动中，关节软骨发挥着至关重要的作用，但由于创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及一些先天疾病等原因，导致骨软骨损伤患者急剧增加，尤其是人口老龄化引起的退行性软骨损伤和年轻人不恰当运动进而引发关节损伤，使得关节软骨损伤的发病率日益升高，为患者带来巨大经济压力与心理负担。目前，患病人群已从老年人逐渐过渡到年轻人，形势十分严峻。
关节软骨代谢活动依赖神经、血管及淋巴组织等，其一旦受损难以自身恢复和再生。其结构由表及里分为：透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层，钙化程度依次提高。各层级纤维走向、含水量、胶原、糖胺多糖以及细胞密度与分布等生物学特征和梯度力学行为方面均有一定差异。相应地，关节软骨损伤由轻到重分为：部分软骨损伤、全层软骨损伤、骨软骨损伤。
种子细胞、生长因子、生物支架作为组织工程三因素，在骨软骨缺损修复再生过程中必然为重中之重。生物支架为骨软骨损伤部位的修复与再生提供合适的生物学环境，在生长因子促进作用下，种子细胞和周围正常组织渗透归巢的细胞在支架的空隙位点进行生长、增殖与分化。由于骨与软骨生理及功能方面差异明显，梯度层级结构对生理和疾病如骨性关节炎的发生发展等有重要影响，骨软骨一体化梯度支架的构建日益引起人们重视，其为骨软骨损伤后的修复再生治疗提供一种新的技术与方法。
实现软骨及骨组织原位内源性层级多向修复，是骨软骨损伤修复支架实现的最终目标。比如，李建树等（CN107469148A）通过定向冷冻技术构建具有类骨-软骨异质结构的一体化多层修复支架材料：利用各层之间物理作用，即相同高分子溶液互溶的特性进行有机连接，从而连接各层级支架。其制备的支架具有抑菌性、生物相容性和原位诱导骨、软骨双向再生的作用，但利用冻融技术来黏结支架，由于层间相态差异，会导致较弱的界面结合力。同时，各层只能在特殊冷冻条件下才可实现层层连接与制备。然而，其支架最终是以冻干状态存在，并不能完全仿生体内细胞外基质含水微环境。一体化梯度支架最重要的是解决界面融合与仿生梯度问题，进而从材料来源和制备方法上选择与优化，对于骨软骨受损部位本身进行原位修复。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种生物支架，所述生物支架充分利用动态交联作用实现层级界面的有效融合。
一种生物支架，所述生物支架由上到下包括：透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层；
所述生物支架通过将透明软骨层的制备原料、钙化软骨层的制备原料和软骨下骨层的制备原料进行生物3D打印得到；
所述透明软骨层的制备原料包括组分A和组分B；
所述钙化软骨层的制备原料包括组分A’、组分B’和组分C’；
所述软骨下骨层的制备原料包括组分A”、组分B”和组分C”；
所述组分A、所述组分A’、所述组分A”独立地包括多糖I中的至少一种；
所述多糖I经过对多糖-1进行氧化改性得到；
所述组分B、所述组分B’、所述组分B”独立地包括多糖II中的至少一种；
所述多糖II含有氨基；
所述多糖II经过对多糖-2进行甲基丙烯酰化改性得到；
所述组分C’、所述组分C”独立地包括促成骨因子中的至少一种。
可选地，所述多糖I带有负电荷。
可选地，所述多糖II带有正电荷。
可选地，所述多糖-1包括透明质酸、海藻酸钠、木葡聚糖、葡聚糖中的至少一种；
所述多糖-2包括壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、硫酸软骨素中的至少一种；
所述促成骨因子包括羟基磷灰石、Β-磷酸三钙、生物活性玻璃、胶原蛋白中的至少一种。
可选地，所述多糖I氧化改性包括以下步骤：
将含有多糖-1与高碘酸钠的溶液反应，获得所述多糖I；
所述甲基丙烯酰化改性包括以下步骤：
将含有多糖-2和甲基丙烯酸酐的溶液反应，得到所述多糖I。
可选地，所述生物支架具有多级孔结构；
其中，所述透明软骨层中的孔隙孔径为150~200㎛、所述钙化软骨层中的孔隙孔径为200~300㎛、所述软骨下骨层中的孔隙孔径为300~400㎛。
可选地，所述透明软骨层的厚度为0.3~0.7cm、所述钙化软骨层的厚度为0.2~0.5cm和所述软骨下骨层的厚度为0.5~1cm 。
可选地，所述生物支架为圆柱形，直径为1~2cm。
根据本申请的另一个方面，提供上述任一项所述的生物支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（S1）将含有组分A”、组分B”和组分C”的生物墨水I进行生物3D打印I，得到软骨下骨层结构；
（S2）在所述软骨下骨层结构上，将含有组分A’、组分B’和组分C’的生物墨水II进行生物3D打印II，得到钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构；
（S3）在所述钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构中的钙化软骨层上，将含有组分A和组分B的生物墨水III进行生物3D打印III，得到透明软骨层-钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构，即得到所述生物支架。
可选地，所述组分A、所述组分A’、所述组分A” 均为氧化改性的透明质酸，所述氧化改性的透明质酸通过以下步骤得到：
将含有透明质酸与高碘酸钠的溶液反应，获得所述氧化改性的透明质酸。
可选地，所述组分B、所述组分B’、所述组分B” 均为甲基丙烯酰化改性的壳聚糖，所述甲基丙烯酰化改性的壳聚糖通过以下步骤得到：
将含有壳聚糖和甲基丙烯酸酐的溶液反应，得到所述甲基丙烯酰化改性的壳聚糖。
可选地，所述组分A”、所述组分B”和所述组分C”的质量比为1.5 ~6.0： 0.75 ~1.5：5~7；
所述组分A’、所述组分B’和所述组分C’的质量比为1.5 ~6.0：0.75 ~1.5： 2~4；
所述组分A和所述组分B的质量比为1.5 ~6.0：0.75 ~1.5。
可选地，所述生物墨水I中，所述组分A”的浓度为0.75~3%；
所述生物墨水II中，所述组分A’的浓度为0.75~3%；
所述生物墨水III中，所述组分A的浓度为0.75~3%。
可选地，所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III独立地还包括静电屏蔽剂中的至少一种。
可选地，所述静电屏蔽剂包括氯化钙、氯化镁、氯化亚铁、氯化铜中的至少一种。
可选地，所述静电屏蔽剂在所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III中的浓度独立地为50~150mM。
可选地，所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III独立地还包括光引发剂中的至少一种。
可选地，所述光引发剂包括LAP（苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂）、1173（2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮）、184（1-羟基环己基苯基丙酮）中的至少一种。
可选地，所述生物墨水I中，所述光引发剂与所述组分A”质量比为0.1：1.5 ~6.0；
所述生物墨水II中，所述光引发剂与所述组分A’质量比为0.1：0.75~3；
所述生物墨水III中，所述光引发剂与所述组分A质量比为0.1：0.75~3。
可选地，所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III中的溶剂独立地包括为磷酸缓冲液中的至少一种。
可选地，所述磷酸缓冲液的pH值为7.4。
可选地，所述生物3D打印I结束后，还包括紫外光照射I：功率I 为4~12W，波长I为300~400 nm、时间I为1~3min；
所述生物3D打印II结束后，还包括紫外光照射II：功率II 为4~12W，波长II为300~400 nm、时间II为1~3min；
所述生物3D打印III结束后，还包括紫外光照射III：功率III 为4~12W，波长III为300~400 nm、时间III为3~7min 。
根据本申请的另一个方面，提供上述任一项所述的生物支架或根据上述任一项所述的制备方法制备得到的生物支架中的至少一种作为骨软骨损伤修复支架的应用。
针对目前一体化梯度支架界面融合连接的不足以及受损部位原位仿生修复的问题，本发明将甲基丙烯酰化壳聚糖、氧化透明质酸及羟基磷灰石等天然材料，通过不同组分配比构建梯度生物墨水。以动态交联作用实现层级界面的有效融合，利用光固化生物3D打印技术制备出具有仿生梯度且各层级界面相融的定制化水凝胶支架。
本发明制备的骨软骨一体化梯度支架是以透明质酸和壳聚糖为原料经过改性构建动态共价交联网络，赋予水凝胶自愈合性能进行界面连接，以改性多糖复合溶液和纳米羟基磷灰石混溶模拟钙化软骨层及软骨下骨层的取向梯度结构与成分仿生。
本发明中支架材料来源仿生体内骨软骨组织：透明质酸带有负电荷，具有较强的亲水性和高粘附性，其可诱导软骨细胞增值与分化；壳聚糖带有正电荷，可止血同时具有抗菌性和可生物降解性；纳米羟基磷灰石本身作为骨组织的成分之一，具有良好的生物活性、骨传导性和生物相容性。
本发明充分利用动态共价键的可逆调控自愈合性能，不光在生物3D打印过程中保证了生物墨水可挤压成型，同时在层层界面连接融合过程发挥重要作用，有效促进分子间稳定结合。
本发明中通过调控纳米羟基磷灰石分散相的浓度，纵向模拟骨软骨钙化程度，其增强了水凝胶生物墨水的力学性能，赋予了梯度支架匹配性的力学性能。
本发明所制备的梯度支架具有三层多级结构，控制纳米羟基磷灰石添加含量，使支架呈现从钙化软骨层向软骨下骨层逐渐增多的仿生梯度分布变化；同时，利用生物3D打印进行层级支架一体化制备，使得三层结构可有效互穿，构成一体化交织的多级孔结构，且由于羟基磷灰石添加含量的不同使得各层级由上到下孔隙出现由小到大的情况。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种可界面融合的仿生梯度一体化水凝胶支架，通过选择壳聚糖、透明质酸与羟基磷灰石等天然材料，在保证优异的生物相容性的同时，对两种多糖进行改性构建动态共价键，各层级主要原料为改性壳聚糖与改性透明质酸，通过控制羟基磷灰石含量实现支架的梯度化。
首先对透明质酸进行氧化改性，引入醛基，其与壳聚糖分子链中的氨基结合，形成席夫碱键（酰胺键），该键作为动态共价键，通过可逆化分离与键合，赋予水凝胶自愈合性能，在后续支架制备当中保证了各层级支架界面的有效融合。其次对壳聚糖进行甲基丙烯酰化改性，引入双键，提供了光引发成胶的条件，对于支架整体的结构固化与支撑具有重要意义。
在一体化梯度支架结构中：透明软骨层由氧化透明质酸和甲基丙烯酰化壳聚糖以动态共价键结合形成水凝胶互穿网络结构；钙化软骨层由以上两种改性多糖溶液和较少量的羟基磷灰石复合形成低钙浓度的多孔结构；软骨下骨层是两种改性多糖溶液和较多量的羟基磷灰石复合形成高钙浓度的均质多孔结构。各层级结构经过生物3D打印技术层层打印，利用光交联固化支架一体结构，界面层间以可控的动态共价交联网络紧密结合，同时，羟基磷灰石的可控浓度实现支架的梯度构建。
本申请的缩写说明如下：
PPS：磷酸缓冲液；
SEM：扫描电子显微镜；
LAP：苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂；
1173：2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮；
184：1-羟基环己基苯基丙酮；
BMSCs细胞：SD大鼠骨髓间充质干细胞。
本申请能产生的有益效果包括：
1、本申请所提供的生物支架，通过采用氧化改性的多糖和含有氨基的多糖为原料，氧化改性的多糖中的醛基与含有氨基的多糖中的氨基可以形成动态共价键酰胺键，由此可以构建动态共价交联网络，赋予原料水凝胶自愈合性，本发明充分利用了动态共价键的可逆调控自愈合性能，不仅在生物3D打印过程中保证了生物墨水可挤压成型，同时在层层界面连接融合过程发挥重要作用，有效促进分子间稳定结合，能进行界面连接，解决了现有技术中支架的界面融合问题，而且，动态共价交联网络在维持生物支架自身结构中也起到了不可或缺的作用。
2、本申请所提供的生物支架，通过以特定多糖和促成骨因子为原料，模拟钙化软骨层及软骨下骨层的取向梯度结构与成分仿生。
3、本发明中通过调控促成骨因子的添加量，纵向模拟骨软骨钙化程度，其增强了水凝胶生物墨水的力学性能，赋予了梯度支架匹配性的力学性能。
4、本申请所提供的生物支架，材料来源仿生体内骨软骨组织：多糖I带有负电荷，具有较强的亲水性和高粘附性，其可诱导软骨细胞增值与分化；多糖II带有正电荷，可止血同时具有抗菌性和可生物降解性；纳米羟基磷灰石本身作为骨组织的成分之一，具有良好的生物活性、骨传导性和生物相容性。
5、本申请所提供的生物支架，具有三层多级结构，控制纳米羟基磷灰石添加含量，使支架呈现从钙化软骨层向软骨下骨层逐渐增多的仿生梯度分布变化；同时，利用生物3D打印进行层级支架一体化制备，使得三层结构可有效互穿，构成一体化交织的多级孔结构，且由于羟基磷灰石添加含量的不同使得各层级由上到下孔隙出现由小到大的情况。本申请所提供的经生物3D打印技术得到的一体化梯度支架完美仿生骨软骨结构，有效填补破损部位。该结构可为细胞提供附着位点和增殖空间，同时，促成骨因子的加入利于成骨分化，益于骨软骨损伤的修复。
6、本申请所提供的生物支架的制备方法，通过对壳聚糖进行甲基丙烯酰化改性，引入双键，提供了光引发成胶的条件，对于支架整体的结构固化与支撑具有重要意义。
7、本申请所提供的生物支架的制备方法，通过在打印结束后进行光照射固化，并控制光固化的条件，可以使生物支架各层具有较好的稳定结构，保持不变形塌陷。同时也不会影响各层界面融合的效果。
附图说明
图1 为本申请实施例3所制备的生物支架示意图。
图2为本申请实施例中所用的生物3D打印设备，其中A为打印机打印部分器件，B为支架结构打印示意图。
图3为本申请实施例3所制备的生物支架界面融合性测试结果，其中A为正置观察结果，B为倒置观察结果。
图4为本申请实施例3所制备的生物支架表面SEM图。
图5为本申请实施例3所制备的生物支架表面细胞生长情况。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请实施例中所用的生物3D打印设备如图2所示，品牌：RegenHU，型号：3DDiscovery 。
本申请实施例中所用的磷酸缓冲液（PBS）的配制方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、0.2g KH2PO4和2.89gNa2HPO4·12H2O溶于1000 mL的超纯水中，将溶液pH值调节至7.4，4℃保存。
本申请实施例中所用DMEM培养基品牌为HyClone高糖(PM150210)。
本申请实施例中所用Calcein-AM品牌为Beyotime（C2012）。
实施例1 氧化透明质酸的制备
（1）称取3.0g透明质酸溶于300mL去离子水中，得到浓度1wt%透明质酸溶液；
（2）称取1g高碘酸钠加入到上述溶液中，避光搅拌4h进行氧化反应；
（3）吸取1.0ml乙二醇加入到上述溶液中，反应2h，去除过量的高碘酸钠；
（4）将上述反应好的溶液透析4天，冷冻干燥得到海绵状固体物，即氧化透明质酸(氧化改性的多糖)。
实施例2 甲基丙烯酰化壳聚糖的制备
（1）称取3 g壳聚糖置于300 mL去离子水中，滴加4 mL乙酸助溶，待搅拌至壳聚糖完全溶解，将温度升到60℃；
（2）吸取2 mL甲基丙烯酸酐逐滴加入上述溶液中，在60℃下反应3 h ；
（3）滴加10%碳酸氢钠水溶液，中和过量的酸，调节pH至6.0，过夜搅拌，减少气泡产生；
（4）将上述反应好的溶液透析4天，冷冻干燥得到海绵状固体物，即甲基丙烯酰化壳聚糖（甲基丙烯酰化改性的多糖）。
实施例1和实施例2中制备得到的氧化透明质酸和甲基丙烯酰化壳聚糖用于后续的一体化梯度支架的制备。
实施例3 一体化梯度支架的制备
（1）、梯度生物墨水的制备
（a）透明软骨层生物墨水：分别用PBS作为溶剂制备1.5 wt%的甲基丙烯酰化壳聚糖溶液和6.0 wt%氧化透明质酸溶液；分别向上述两种多糖溶液中溶解100 mM/L氯化钙作为降低静电作用的静电屏蔽剂、加入0.1wt%的1173（2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮）作为光引发剂。随后将两种溶液1：1等体积在涡旋振荡器上快速混合，利用动态共价键获得透明软骨层水凝胶生物墨水，备用。
（b）钙化软骨层生物墨水：分别用PBS作为溶剂制备0.75 wt%的甲基丙烯酰化壳聚糖溶液和6.0 wt%氧化透明质酸溶液；将3 wt %的羟基磷灰石加入到氧化透明质酸溶液中，超声20min进行分散，得到复合透明质酸溶液。分别向甲基丙烯酰化壳聚糖溶液和复合透明质酸溶液中溶解100 mM/L氯化钙作为降低静电作用的静电屏蔽剂、加入0.1wt%的1173（2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮）作为光引发剂。随后将两种溶液1：1等体积在涡旋振荡器上快速混合，利用动态共价键获得钙化软骨层水凝胶生物墨水，备用。
（c）软骨下骨层生物墨水：分别用PBS作为溶剂制备1.5 wt%的甲基丙烯酰化壳聚糖溶液和6.0 wt%氧化透明质酸溶液；将6 wt %的羟基磷灰石加入到透明质酸溶液中，超声20min进行分散，得到复合透明质酸溶液。分别向甲基丙烯酰化壳聚糖溶液和复合透明质酸溶液中溶解100 mM/L氯化钙作为降低静电作用的静电屏蔽剂、加入0.1wt%的1173（2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮）作为光引发剂。随后将两种溶液1：1等体积在涡旋振荡器上快速混合，利用动态共价键获得软骨下骨层水凝胶生物墨水，备用。
（2）生物3D打印
（a）首先将制备好的软骨下骨层生物墨水加入生物3D打印机的加料针筒中，设定打印机的程序，启动打印机，制备得到直径为1cm，修复层高度为0.5cm的圆形孔软骨下骨修复层支架。打印方法为：将样品玻璃托板放置于打印位置卡槽；设置打印机出料管气压为0.168Mpa（范围小于1Mpa）；打印针头选择27G（白色）；移动打印机轴臂至待打印位置，将建好的模型转换为G-code语言加载入程序菜单栏；设置针头移动速度为1mm/s；选择打印头PH1下沉，点击“启动”按钮开始打印。在打印结束后对软骨下骨层支架进行功率为8W，波长为365nm的紫外光照射2min，使该层支架固化。
（b）将制备好的钙化软骨层生物墨水加入生物3D打印机的加料针筒中，设定打印机的程序，启动打印机，在软骨下骨层支架层上打印直径为1cm，层高为0.3cm的钙化软骨修复层支架，在动态共价交联作用下得到钙化软骨-软骨下骨一体化梯度支架。打印方法为：将样品玻璃托板放置于打印位置卡槽；设置打印机出料管气压为0.168Mpa（范围小于1Mpa）；打印针头选择27G（白色）；移动打印机轴臂至待打印位置，将建好的模型转换为G-code语言加载入程序菜单栏；设置针头移动速度为1mm/s；选择打印头PH2下沉，点击“启动”按钮开始打印。在打印结束后对钙化软骨层支架进行功率为8W，波长为365nm的紫外光照射2min，使该层支架固化。
（c）将制备好的透明软骨层生物墨水加入生物3D打印机的加料针筒中，设定打印机的程序，启动打印机，在钙化软骨层支架层上打印直径为1cm，层高为0.5cm的透明软骨层修复层支架，在动态共价交联作用下得到透明软骨-钙化软骨-软骨下骨一体化梯度支架。打印方法为：将样品玻璃托板放置于打印位置卡槽；设置打印机出料管气压为0.168Mpa（范围小于1Mpa）；打印针头选择27G（白色）；移动打印机轴臂至待打印位置，将建好的模型转换为G-code语言加载入程序菜单栏；设置针头移动速度为1mm/s；选择打印头PH3下沉，点击“启动”按钮开始打印。在打印结束后对透明软骨层支架进行功率为6W，波长为365nm的紫外光照射5min，使该层支架固化。
制备得到的透明软骨-钙化软骨-软骨下骨一体化梯度支架记为1#支架，示意图如图1所示。
（3）1#支架性能测试
①支架界面融合性测试
将制备好的1#支架置于玻璃板上，倒置观察，如图3所示，其中A为正置观察结果，B为倒置观察结果，从图3可以看出1#支架各层级紧密结合未出现层间脱落情况，说明动态共价键的有效作用。
②SEM表面形貌观察
取已制备的1#支架。-80℃下冷冻12小时；支架样本冻干机冻干48小时；根据实验需要将1#支架适度剪裁后贴到样品托上；上机前以30 m A电流喷涂钯-铂合金90s；将制备的已喷金的1#支架放入扫描电镜，通过扫描电子显微镜（HITACHI S-4800）观察表面微观形貌，如图4为1#支架表面SEM图：脱水冻干后的1#支架在SEM下显示规则的孔隙结构，结构紧凑规则，上表面SEM观察孔径形态比较规则的正方形分布。1#支架具有多级孔结构；其中，透明软骨层孔径为400㎛、软骨下骨层孔径为600㎛、钙化软骨层孔径为800㎛。
③支架表面细胞黏附性测试
通过观察不同浓度支架表面细胞的粘附情况，了解支架的细胞相容性，使用上述3D打印方法制备的1#支架进行检测，具体操作如下：
首先将A液(冰醋酸+硫酸，两者体积比为100：1)和B液（过氧化氢）按 2:1 比例混合，在 25℃的环境下静置24h，获得过氧乙酸混合溶液；使用超纯水稀释静置后得到的过氧乙酸混合溶液浓度至0.1%( g/L)；将待消毒1#支架表面清洗干净，将1#支架完全浸没于过氧乙酸溶液内，在室温下消毒60min，PBS冲洗三遍，获得无菌的1#支架，置于无菌培养皿中；消化离心BMSCs后加DMEM培养基重悬 BMSCs 细胞，将细胞悬液接种至1#支架表面，并加入足够量的DMEM培养基浸没1#支架表面，使细胞在1#支架表面均匀分布，细胞接种密度为2x106cell/ml；放入培养箱培养，36h后更换培养液，72h后观察细胞在1#支架表面粘附情况；将含细胞的1#支架在浓度为1μmol/L的Calcein-AM染液中孵育30min；荧光显微镜下观察并分析。图5为1#支架表面细胞生长情况，由图5可以看出，活细胞在支架结构中分布均匀，且生长情况良好，说明支架的细胞相容性良好，且作为细胞质基质利于细胞增殖分化。
实施例4~6 一体化梯度支架的制备
实施例4~6的制备方法与实施例3的区别仅在于如下表1所示。
表1实施例4~6与实施例3的区别之处
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (12)

1.一种生物支架，其特征在于，所述生物支架由上到下包括：透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨层；
所述生物支架通过将透明软骨层的制备原料、钙化软骨层的制备原料和软骨下骨层的制备原料进行生物3D打印得到；
所述透明软骨层的制备原料包括组分A和组分B；
所述钙化软骨层的制备原料包括组分A’、组分B’和组分C’；
所述软骨下骨层的制备原料包括组分A”、组分B”和组分C”；
所述透明软骨层的制备原料、所述钙化软骨层的制备原料、所述软骨下骨层的制备原料独立地还包括静电屏蔽剂和光引发剂；
所述组分A、所述组分A’、所述组分A”独立地包括多糖I；
所述多糖I为透明质酸与高碘酸钠溶液反应得到的氧化透明质酸；
所述组分B、所述组分B’、所述组分B”独立地包括多糖II；
所述多糖II为壳聚糖和甲基丙烯酸酐溶液反应得到的甲基丙烯酰化壳聚糖；
所述组分C’、所述组分C”独立地包括羟基磷灰石；
所述组分A”、所述组分B”和所述组分C”的质量比为1.5 ~6.0： 0.75 ~1.5：5~7；
所述组分A’、所述组分B’和所述组分C’的质量比为1.5 ~6.0：0.75 ~1.5：2~4；
所述组分A和所述组分B的质量比为1.5 ~6.0：0.75 ~1.5；
所述组分A”的浓度为0.75~3%；
所述组分A’的浓度为0.75~3%；
所述组分A的浓度为0.75~3%；
所述生物支架具有多级孔结构；所述透明软骨层中的孔隙孔径为150~200 μm、所述钙化软骨层中的孔隙孔径为200~300 μm、所述软骨下骨层中的孔隙孔径为300~400 μm。
2.根据权利要求1所述的生物支架，其特征在于，所述多糖I带有负电荷；所述多糖II带有正电荷。
3.根据权利要求1所述的生物支架，其特征在于所述透明软骨层的厚度为0.3~0.7cm、所述钙化软骨层的厚度为0.2~0.5cm和所述软骨下骨层的厚度为0.5~1cm。
4.根据权利要求1所述的生物支架，其特征在于所述生物支架为圆柱形，直径为1~2cm。
5.权利要求1~4任一项所述的生物支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（S1）将含有组分A”、组分B”和组分C”的生物墨水I进行生物3D打印I，得到软骨下骨层结构；
（S2）在所述软骨下骨层结构上，将含有组分A’、组分B’和组分C’的生物墨水II进行生物3D打印II，得到钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构；
（S3）在所述钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构中的钙化软骨层上，将含有组分A和组分B的生物墨水III进行生物3D打印III，得到透明软骨层-钙化软骨层-软骨下骨层一体化结构，即得到所述生物支架。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述静电屏蔽剂包括氯化钙、氯化镁、氯化亚铁、氯化铜中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述静电屏蔽剂在所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III中的浓度独立地为50~150mM。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂包括苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂、2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基丙酮中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水I中，所述光引发剂与所述组分A”质量比为0.1：0.75~3；
所述生物墨水II中，所述光引发剂与所述组分A’质量比为0.1：0.75~3；
所述生物墨水III中，所述光引发剂与所述组分A质量比为0.1：0.75~3。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述生物墨水I、所述生物墨水II、所述生物墨水III中的溶剂独立地为磷酸缓冲液。
11.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述生物3D打印I结束后，还包括紫外光照射I：功率I 为4~12W，波长I为300~400 nm、时间I为1~3min；
所述生物3D打印II结束后，还包括紫外光照射II：功率II 为4~12W，波长II为300~400nm、时间II为1~3min；
所述生物3D打印III结束后，还包括紫外光照射III：功率III 为4~12W，波长III为300~400 nm、时间III为3~7min 。
12.权利要求1~4任一项所述的生物支架或根据权利要求5~11任一项所述的制备方法制备得到的生物支架作为骨软骨损伤修复支架的应用。
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