CN111330084A - 一种仿生异质一体化骨-软骨修复支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种仿生异质一体化骨‑软骨修复支架及其制备方法,为多层结构支架材料,自上到下依次包括:透明软骨层,以透明质酸和壳聚糖两种生物相容性材料交织形成互穿多孔结构;钙化软骨层,以壳聚糖和纳米羟基磷灰石复合形成的取向梯度多孔结构;软骨下骨层,由类骨基质成分的壳聚糖和纳米羟基磷灰石杂化形成的均质多孔结构;采用原位合成方法,并结合定向冷冻技术构建具有类骨‑软骨异质结构的一体化多层修复支架材料。本发明合成的复合材料综合了各组分的自身优势,具有良好的抑菌性、生物相容性和原位诱导骨、软骨双向再生的功效;增强了界面的结合力,从而实现支架结构一体化。
Description
技术领域
本发明属于复合材料领域,具体涉及一种仿生异质一体化骨-软骨修复支架及其制备方法。
背景技术
由创伤、疾病、退变等因素导致的关节软骨损伤是目前临床常见的骨科疾病,特别是面对全球人口老龄化趋势的加剧,关节软骨处组织损伤尤为突出,昂贵的医疗费用给病人家庭、社会和国家带来巨大的精神压力和沉重的经济负担。因为关节软骨细胞为分化终末期细胞,且关节软骨处无血管、淋巴管和神经,缺乏相应的神经和体液调节,使得软骨缺损的自我修能力有限,一旦损伤,常常累及软骨下骨,加剧病情恶化。
此外,关节软骨主要由透明软骨、钙化软骨及软骨下骨三部分组成,自体骨髓腔中的间充质干细胞参与软骨重建,可通过软骨下骨穿过钙化软骨层从而到达表层透明软骨。根据天然软骨层结构特点,其软骨层具有圆形的交错结构孔型,主要成分为有机基质,而钙化软骨层具有垂直孔道结构,这种垂直孔道方便营养物质的输送;同时,钙化软骨层至软骨下骨部分显著矿化,无机纳米羟基磷灰石粒子呈现出上少下多的梯度分布,且各层之间连接紧密,相互渗透,过渡性良好。
针对于骨软骨缺损的治疗,组织工程策略的提出成为科研界关注的焦点,而制备植入性的支架材料在诱导缺损组织修复生长方面扮演着重要角色。因此,成功仿生制备能够满足上述天然骨-软骨修复多层支架,是实现软骨及骨组织原位内源性双向修复的关键。例如,申请号为201810059754.2的发明专利公布了一种双因子程序释放的仿生取向骨软骨支架,将分别制备的上层表面层和下层移行层通过丝素蛋白粘合形成完整的支架;然而,上下两部分通过组合方式结合形成的整体支架,界面结合力较弱;并且没有完整性的模拟关节处骨软骨一体化的多级结构,特别是软骨下骨结构部分
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿生异质一体化骨-软骨修复支架及其制备方法,借鉴仿生思想,结合原位沉淀法和定向冷冻技术实现对天然关节软骨处组织结构、组成和功能仿生。所得支架具有三层结构,透明软骨层和软骨下骨层均为相互贯穿的交织多级孔结构,钙化软骨层则是具有轴向排列的上下贯通的阵列微管结构,无机成分纳米羟基磷灰石呈现从钙化软骨层向软骨下骨层逐渐增多的仿生梯度分布变化;各层之间利用相同高分子溶液互溶的特性进行有机连接,在满足成分和结构仿生的同时,可实现原位诱导骨-软骨再生的功能仿生。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种异质一体化骨-软骨修复支架,其透明软骨层是以透明质酸和壳聚糖两种生物相容性材料交织形成互穿多孔结构;钙化软骨层是以壳聚糖和纳米羟基磷灰石复合形成的取向梯度多孔结构;而软骨下骨层则是由类骨基质成分的壳聚糖和纳米羟基磷灰石杂化形成的均质多孔结构。经原位仿生构建过程形成类骨磷灰石梯度分布及钙化层孔取向排列的骨-软骨修复材料。
所述骨-软骨修复支架的制备方法包括以下步骤:
一、软骨下骨层前驱体物的制备
(1)将0.75~1.25g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(2)将2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液各8mL,依次加入到步骤(1)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到软骨下骨层复合物前驱体溶液;
(3)将(2)中制备的壳聚糖及无机离子均匀混合物注入模具中,静置于-20℃的冰箱中冷冻形成固体A;
二、钙化软骨层及软骨下骨层的前驱体复合物制备
(4)将0.75~1.00g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(5)将2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液各6mL,依次加入到步骤(4)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到钙化软骨层复合物前驱体溶液;
(6)将第一部分制备的A固体从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(5)中制备的钙化软骨层复合物前驱体溶液缓慢覆盖于A表面,然后将其小心放置于液氮气流中,冷冻20min左右,转移至-20℃的冰箱中,形成固体B;
三、骨-软骨复合物前驱体的制备
(7)将50~150mg透明质酸溶于10mL去离子水中,搅拌至全部溶解,得透明质酸水溶液;
(8)将0.5~0.75g壳聚糖溶解于体积分数为2%的乙酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(9)磁力搅拌条件下,将步骤(7)所得透明质酸水溶液缓慢加入到步骤(8)所得壳聚糖乙酸溶液中,充分搅拌,形成均匀混合液;
(10)在步骤(9)所得混合液中加入交联剂,常温交联4~8h,得到软骨层复合物前驱体溶液;
(11)将第二部分制备的B固态前驱体复合物从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(10)中制备的软骨层前驱体溶液缓慢覆盖于B表面,然后将其放置于-80℃的冰箱中,冷冻过夜,形成固体C;
四、骨-软骨多层一体化复合物支架的制备
(12)将步骤(11)得到的固体C于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥,除去样品中的水分;
(13)将(12)中冷冻干燥后的成型样品浸没于pH=9~11的碱性溶液中,并置于37℃恒温振荡器中持续反应8-12h后,水洗至中性后,重新冷冻再干燥成型,即得仿生异质一体化骨-软骨修复支架。
步骤(1)、步骤(4)和(步骤8)中是将壳聚糖于37℃水浴条件下磁力搅拌30min,使其溶于乙酸溶液。
步骤(2)和(5)中所用可溶性钙盐为硝酸钙或无水氯化钙;所用可溶性磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的一种或多种混合;其中Ca/P摩尔比为1.67:1。
步骤(6)中的液氮氛围是样品平行置于液氮罐的出口罐口处。
步骤(7)中是将透明质酸于室温条件下磁力搅拌30min,使其于水中完全溶解。
步骤(10)中所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液混合物;其中1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺的浓度为2~4mg/mL,N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1~3mg/mL。
步骤(12)中冷冻干燥的温度为零下109℃;干燥时间3d。
步骤(13)中所述的碱性溶液为NaOH或KOH溶解于乙醇和水的混合溶液,其中乙醇与水的体积比为1:1。
本发明的显著优点在于:
本发明所得骨-软骨修复支架是以透明质酸和壳聚糖复合物构成交织多级孔结构的软骨层,以壳聚糖和纳米羟基磷灰石构成取向梯度结构的钙化软骨层及软骨下骨层,其综合了透明质酸良好的润滑保湿性,壳聚糖的抗菌性和可生物降解性,以及纳米羟基磷灰石优越的类骨活性和生物相容性,并借鉴原位仿生思想和定向冷冻技术实现对天然关节软骨处组织进行结构、组成和功能仿生。
本发明充分利用溶液中质子化的壳聚糖与透明质酸表面官能团间能通过静电相互吸引和共价结合方式,促进分子间结合的稳定性;同时,羟基磷灰石无机纳米粒子的梯度掺杂,在一定程度上增强有机质力学性能,赋予了杂化支架匹配性的力学性能。
本发明所得支架具有三层多级结构,通过重力沉降过程,纳米羟基磷灰石呈现从钙化软骨层向软骨下骨层逐渐增多的仿生梯度分布变化;同时,不同的冷冻技术,使得上层软骨层及软骨下骨为相互贯穿的交织多级孔结构,且孔隙大小不同;软骨下骨层是具有轴向排列的上下贯通的阵列微管结构,很好的实现了支架材料对天然关节软骨处组织的结构和组成的仿生过程。本发明合成的骨-软骨修复复合材料相对于其他修复材料有以下优点:
(1)合成的复合材料综合了各组分的自身优势,具有良好的抑菌性、生物相容性和原位诱导骨、软骨双向再生的功效;
(2)支架上下层孔隙呈现出“上大下小”的类骨软骨基质差异;中间钙化层具有轴向排列的贯通的阵列微管结构,这种取向结构有利于骨髓腔内的干细胞定向迁移和分化以及营养物质的运输、交换和代谢产物的输出;
(3)支架软骨层是由壳聚糖与透明质酸两种类似透明软骨有机成分通过、静电吸引、共价交联相互作用形成相互贯穿的微纳多级孔交织结构,空间力学性能稳固;
(4)钙化软骨层羟基磷灰石梯度分布于壳聚糖基质中,形成类天然钙化软骨基质成分及分布,无机粒子的原位生长及梯度分布,赋予了支架材料梯度的力学性能及良好的生物活性;
(5)支架各层之间通过相同有机成分互溶结合,增强了界面的结合力,从而实现支架结构一体化;
(6)可以通过各组分间的配比、交联剂的用量及模具样式来调控和匹配生物体不同部位所需修复材料的降解速率、力学性能及形状;
(7)该复合支架的制备条件温和,可塑性强,工艺较简单,操作方便,成本低。
附图说明
图1是本发明仿生梯度骨-软骨修复支架的结构图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
该仿生异质一体化骨-软骨修复支架,如图1所示,为多层结构支架材料,自上到下依次包括:
透明软骨层,以透明质酸和壳聚糖两种生物相容性材料交织形成互穿多孔结构;
钙化软骨层,以壳聚糖和纳米羟基磷灰石复合形成的取向梯度多孔结构;
软骨下骨层,由类骨基质成分的壳聚糖和纳米羟基磷灰石杂化形成的均质多孔结构;
采用原位合成方法,并结合定向冷冻技术构建具有类骨-软骨异质结构的一体化多层修复支架材料。
制备方法通过以下实施例予以说明。
实施例1
一、软骨下骨层前驱体物的制备
(1)将1.00g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(2)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各8mL,依次加入到步骤(1)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到软骨下骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(3)将(2)中制备的壳聚糖及无机离子均匀混合物注入模具中,静置于-20℃的冰箱中冷冻形成固体A;
二、钙化软骨层及软骨下骨层的前驱体复合物制备
(4)将0.75g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(5)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各8mL,依次加入到步骤(4)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到钙化软骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(6)将第一部分制备的A固体从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(5)中制备的钙化软骨层复合物前驱体溶液缓慢覆盖于A表面,然后将其小心放置于液氮气流中,冷冻20min左右,转移至-20℃的冰箱中,形成固体B;
三、骨-软骨复合物前驱体的制备
(7)将50mg透明质酸溶于10mL去离子水中,室温下,磁力搅拌至全部溶解,得透明质酸水溶液;
(8)将0.5g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(9)磁力搅拌条件下,将步骤(7)所得透明质酸水溶液缓慢加入到步骤(8)所得壳聚糖乙酸溶液中,充分搅拌,形成均匀混合液;
(10)在步骤(9)所得混合液中加入4.5mL、4mg/mL的EDC和5.6mL、1mg/mL的NHS,常温交联4h后,得到软骨层复合物前驱体溶液;
(11)将第二部分制备的B固态前驱体复合物从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(10)中制备的软骨层前驱体溶液缓慢覆盖于B表面,然后将其放置于-80℃的冰箱中,冷冻过夜,形成固体C;
四、骨-软骨多层一体化复合物支架的制备
(12)将步骤(11)得到的固体C于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥,于-109℃下进行冷冻干燥3d;
(13)将(12)中冷冻干燥后的成型样品浸没于pH=10的NaOH乙醇/水溶液(1:1,v/v)中浸泡,并置于37℃恒温摇床中持续反应8h后,水洗至中性,重新于-109℃下进行冷冻干燥,即得仿生异质一体化骨-软骨修复支架。
实施例2
一、软骨下骨层前驱体物的制备
(1)将1.00g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(2)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各8mL,依次加入到步骤(1)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到软骨下骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(3)将(2)中制备的壳聚糖及无机离子均匀混合物注入模具中,静置于-20℃的冰箱中冷冻形成固体A;
二、钙化软骨层及软骨下骨层的前驱体复合物制备
(4)将0.75g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(5)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各6mL,依次加入到步骤(4)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到钙化软骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(6)将第一部分制备的A固体从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(5)中制备的钙化软骨层复合物前驱体溶液缓慢覆盖于A表面,然后将其小心放置于液氮气流中,冷冻20min左右,转移至-20℃的冰箱中,形成固体B;
三、骨-软骨复合物前驱体的制备
(7)将75mg透明质酸溶于10mL去离子水中,室温下,磁力搅拌至全部溶解,得透明质酸水溶液;
(8)将0.5g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(9)磁力搅拌条件下,将步骤(7)所得透明质酸水溶液缓慢加入到步骤(8)所得壳聚糖乙酸溶液中,充分搅拌,形成均匀混合液;
(10)在步骤(9)所得混合液中加入4.5mL、4mg/mL的EDC和5.6mL、1mg/mL的NHS,常温交联4h后,得到软骨层复合物前驱体溶液;
(11)将第二部分制备的B固态前驱体复合物从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(10)中制备的软骨层前驱体溶液缓慢覆盖于B表面,然后将其放置于-80℃的冰箱中,冷冻过夜,形成固体C;
四、骨-软骨多层一体化复合物支架的制备
(12)将步骤(11)得到的固体C于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥,于-109℃下进行冷冻干燥3d;
(13)将(12)中冷冻干燥后的成型样品浸没于pH=10的NaOH乙醇/水溶液(1:1,v/v)中浸泡,并置于37℃恒温摇床中持续反应8h后,水洗至中性,重新于-109℃下进行冷冻干燥,即得仿生异质一体化骨-软骨修复支架。
实施例3
一、软骨下骨层前驱体物的制备
(1)将1.25g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(2)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各8mL,依次加入到步骤(1)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到软骨下骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(3)将(2)中制备的壳聚糖及无机离子均匀混合物注入模具中,静置于-20℃的冰箱中冷冻形成固体A;
二、钙化软骨层及软骨下骨层的前驱体复合物制备
(4)将1.00g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(5)将2mol/L硝酸钙溶液和1.2mol/L磷酸氢二钾溶液各8mL,依次加入到步骤(4)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到钙化软骨层复合物前驱体溶液;其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1;
(6)将第一部分制备的A固体从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(5)中制备的钙化软骨层复合物前驱体溶液缓慢覆盖于A表面,然后将其小心放置于液氮气流中,冷冻20min左右,转移至-20℃的冰箱中,形成固体B;
三、骨-软骨复合物前驱体的制备
(7)将150mg透明质酸溶于10mL去离子水中,室温下,磁力搅拌至全部溶解,得透明质酸水溶液;
(8)将0.75g壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,37℃水浴条件下磁力搅拌30min,得壳聚糖酸溶液;
(9)磁力搅拌条件下,将步骤(7)所得透明质酸水溶液缓慢加入到步骤(8)所得壳聚糖乙酸溶液中,充分搅拌,形成均匀混合液;
(10)在步骤(9)所得混合液中加入4.5mL、4mg/mL的EDC和5.6mL、1mg/mL的NHS,常温交联6h后,得到软骨层复合物前驱体溶液;
(11)将第二部分制备的B固态前驱体复合物从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(10)中制备的软骨层前驱体溶液缓慢覆盖于B表面,然后将其放置于-80℃的冰箱中,冷冻过夜,形成固体C;
四、骨-软骨多层一体化复合物支架的制备
(12)将步骤(11)得到的固体C于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥,于-109℃下进行冷冻干燥3d;
(13)将(12)中冷冻干燥后的成型样品浸没于pH=10的NaOH乙醇/水溶液(1:1,v/v)中浸泡,并置于37℃恒温摇床中持续反应10h后,水洗至中性,重新于-109℃下进行冷冻干燥,即得仿生异质一体化骨-软骨修复支架。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种仿生异质一体化骨-软骨修复支架,其特征在于:为多层结构支架材料,自上到下依次包括:
透明软骨层,以透明质酸和壳聚糖两种生物相容性材料交织形成互穿多孔结构;
钙化软骨层,以壳聚糖和纳米羟基磷灰石复合形成的取向梯度多孔结构;
软骨下骨层,由类骨基质成分的壳聚糖和纳米羟基磷灰石杂化形成的均质多孔结构;
采用原位合成方法,并结合定向冷冻技术构建具有类骨-软骨异质结构的一体化多层修复支架材料。
2.根据权利要求1所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
一、软骨下骨层前驱体物的制备
(1)将0.75~1.25g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(2)将2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液各8mL,依次加入到步骤(1)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到软骨下骨层复合物前驱体溶液;
(3)将(2)中制备的壳聚糖及无机离子均匀混合物注入模具中,静置于-20℃的冰箱中冷冻形成固体A;
二、钙化软骨层及软骨下骨层的前驱体复合物制备
(4)将0.75~1.00g壳聚糖溶解于体积分数为2%的醋酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(5)将2mol/L可溶性钙盐溶液和1.2mol/L可溶性磷酸盐溶液各6mL,依次加入到步骤(4)所得混合液中,充分搅拌,使其混合均匀,得到钙化软骨层复合物前驱体溶液;
(6)将第一部分制备的A固体从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(5)中制备的钙化软骨层复合物前驱体溶液缓慢覆盖于A表面,然后将其小心放置于液氮氛围中,冷冻20min左右,转移至-20℃的冰箱中,形成固体B;
三、骨-软骨复合物前驱体的制备
(7)将50~150mg透明质酸溶于10mL去离子水中,搅拌至全部溶解,得透明质酸水溶液;
(8)将0.5~0.75g壳聚糖溶解于体积分数为2%的乙酸溶液中,得壳聚糖的酸溶液;
(9)磁力搅拌条件下,将步骤(7)所得透明质酸水溶液缓慢加入到步骤(8)所得壳聚糖乙酸溶液中,充分搅拌,形成均匀混合液;
(10)在步骤(9)所得混合液中加入交联剂,常温交联4~8h,得到软骨层复合物前驱体溶液;
(11)将第二部分制备的B固态前驱体复合物从冰箱中取出,静止于室温下3~5min,待其表面出现胶质态时,将(10)中制备的软骨层前驱体溶液缓慢覆盖于B表面,然后将其放置于-80℃的冰箱中,冷冻过夜,形成固体C;
四、骨-软骨多层一体化复合物支架的制备
(12)将步骤(11)得到的固体C于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥,除去样品中的水分;
(13)将(12)中冷冻干燥后的成型样品浸没于pH=9~11的碱性溶液中,并置于37℃恒温振荡器中持续反应8-12h后,水洗至中性后,重新冷冻再干燥成型,即得仿生异质一体化骨-软骨修复支架。
3.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(1)、步骤(4)和步骤(8)中将壳聚糖于37℃水浴条件下磁力搅拌30min,使其溶于乙酸溶液。
4.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(2)和步骤(5)中所用可溶性钙盐为硝酸钙或无水氯化钙;所用可溶性磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠中的一种或多种混合;其中Ca/P摩尔比为1.67:1。
5.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(7)中将透明质酸于室温条件下磁力搅拌30min,使其于水中完全溶解。
6.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(6)中的液氮氛围是样品平行置于液氮罐的出口罐口处。
7.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(10)中所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液混合物;其中1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺的浓度为2~4mg/mL,N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1~3mg/mL。
8.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(12)中冷冻干燥的温度为零下109℃;干燥时间3d。
9.根据权利要求2所述的仿生异质一体化骨-软骨修复支架的制备方法,其特征在于:步骤(13)中所述的碱性溶液为NaOH或KOH溶解于乙醇和水的混合溶液,其中乙醇与水的体积比为1:1。
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