CN114949371A - 修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法 - Google Patents

修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法，1）以PVP为模板制备纳米羟基磷灰石，在第一烧杯加入Ca(NO3)2·4H2O；在第二烧杯加入(NH4)3PO4·3H2O，Ca/P摩尔比为1.5‑1.8；配制PVP水溶液，分别加入第一、第二烧杯；2）取卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑醛基和十八胺，在设定温度下溶于氯仿溶液，蒸发，在容器中形成薄膜；3）在模具中形成多孔支架的下层和支架的上层。本发明得到的负载TGF‑β与nHAp的双层多孔支架，双层支架的上下结构和负载的TGF‑β与nHAp为BMSCs提供了诱导信号，上层能诱导BMSCs分化为软骨细胞，下层能诱导BMSCs分化为成骨细胞。

Description

修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，尤其涉及一种修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法。
背景技术
骨软骨缺损是指软骨与软骨下骨的损伤，外伤是骨软骨损伤的重要原因。针对外伤引起的损伤，大部分研究往往着重于对软骨的修复，而忽略了对软骨下骨的修复，因此单一软骨修复对外伤引起损伤的修复效果并不令人满意。
在骨软骨缺损中，大量骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）从骨髓中释放出来，这些内源性干细胞被鉴定为具有在合适的微环境下分化为软骨和成骨谱系的特性。然而，支架材料本身通常缺乏诱导信号，可能无法激活BMSCs固有的再生潜能。因此，为内源性BMSCs的募集和双系分化提供支持和生化线索的细胞指导性支架的开发对于骨软骨再生具有巨大潜力。
目前，双层支架已成为骨软骨替代物的候选材料并且受到了广泛关注。双层水凝胶的两层中功能化的不同成分可以诱导BMSCs分化为不同的软骨细胞和成骨细胞，进一步促进软骨和软骨下骨的修复。通过脂质体包裹TGF-β，有效控制其释放过程，TGF-β生长因子在软骨细胞成熟和软骨内成骨过程中发挥关键作用，能够促进软骨细胞中蛋白多糖和II型胶原的合成，促进BMSCs的成软骨和成骨分化。纳米羟基磷灰石（nHAp）是软骨下层的组成部分，具有生物活性和生物相容性，具有良好的骨传导作用、生物可分解及诱导骨形成的能力。
软骨和软骨下骨具有不同的组成、结构和生物学性能，双层多孔支架的上层和下层的结构和组成也应该具有针对性，从而达到软骨与软骨下骨整合的目的。
发明内容
针对现有技术的所述不足，本发明第一目的是提供一种修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法，即用于促进关节骨软骨缺损协同再生修复的负载TGF-β与nHAp的双层多孔支架，其上层为模拟软骨层，下层为模拟软骨下骨层，能促进关节骨软骨缺损协同再生修复。
为了解决所述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，其特征在于包括如下步骤：
1）制备纳米羟基磷灰石：以PVP（聚乙烯吡咯烷酮）为模板制备纳米羟基磷灰石，在第一烧杯底部加入设定量的Ca(NO3)2·4H2O；在第二烧杯底部加入设定量的 (NH4)3PO4·3H2O，Ca/P摩尔比为1.5-1.8，将第二烧杯放入第一烧杯中；配制PVP水溶液，用氨水调节溶液的pH值，pH值控制在10.5~11范围；滴加PVP水溶液至第二烧杯中，直到加满；用同样方法将第一烧杯液面加至与第二烧杯齐平，静置设定时间，再滴加PVP水溶液，直到第一烧杯液面比第二烧杯高设定高度；将第一烧杯密封，室温静置设定时间；将烧杯中得到的沉积物用去离子水洗，再经过滤，干燥，得到纳米羟基磷灰石；
2）制备包裹有TGF-β生长因子的脂质体：分别取卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基和十八胺，卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为（3—5）:（1—1.5）:（0.1—0.2）:（0.1—0.2）；在设定温度下溶于氯仿溶液，然后在设定温度下蒸发，在容器中形成薄膜；然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理得到得脂质体；再将脂质体通过设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出，获得阳离子脂脂质体；将阳离子脂质体滴加到设定浓度的CMCS 溶液中，匀速搅拌，获得包裹有TGF-β生长因子的脂质体；
3）制作载有TGF-β生长因子的双层纳米羟基磷灰石的多孔支架：支架的下层，将氧化海藻酸钠溶于水，明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，搅拌均匀，注入成胶磨具中，成型后得到支架的下层结构；支架的上层，将氧化海藻酸钠溶于水，装载有TGF-β生长因子的脂质体、明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀；然后注入已成胶的支架的下层结构上面，冷冻干燥后得到本发明双层多孔支架。
本发明得到的负载TGF-β与nHAp的双层多孔支架，双层支架的上下结构和负载的TGF-β与nHAp为BMSCs提供了诱导信号，上层能诱导BMSCs分化为软骨细胞，下层能诱导BMSCs分化为成骨细胞。
进一步的，步骤A)中所述加入的Ca(NO3)2·4H2O和(NH4)3PO4·3H2O的Ca/P摩尔比为1.67。
进一步的，第一烧杯液面比第二烧杯液面高3—15mm。
进一步的，卵磷脂 、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为4:1:0.1:0.1。
进一步的，将卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基和十八胺，在35℃—40℃下水浴下，加入放置有氯仿溶液的圆底烧瓶的容器中，快速旋转下溶于氯仿溶液中；然后用旋转蒸发仪在 50 r/min（离心半径 4.5 cm）和 50—70℃下蒸发。
进一步的，将脂质体通过具有450 nm 和220 nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出。
进一步的，阳离子脂质体滴加到浓度为0.2%的 CMCS 溶液，二者体积比为1:1。
进一步的，在上下层支架中，15 wt%的明胶、5 wt%的羧甲基壳聚糖、10 wt%氧化海藻酸钠体积比为（2—3）:1:（2—3）。
修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，其特征在于，由上、下两层构成，所述下层，是将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，经搅拌均匀后注入成胶磨具中得到；所述上层，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀后，注入已成胶的下层上面，冷冻干燥后得到双层多孔支架；所述脂质体，是卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-CHO和十八胺，在设定温度下溶于氯仿溶液；然后在设定温度下蒸发，在容器中形成薄膜；然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，再将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理，得到脂质体，再将脂质体通过具有设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出以获得装载有TGF-β生长因子的脂质体；
在上、下层支架中，15 wt%的明胶、5 wt%的羧甲基壳聚糖、10 wt%氧化海藻酸钠体积比为（2—3）:1:（2—3）；
所述卵磷脂 、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为（3—5）:（1—1.5）:（0.1—0.2）:（0.1—0.2）。
这样，本发明的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，双层支架具有完整结构和一定的压缩力学性能，维持细胞形态和承受局部应力，上层支架和下层支架能促进关节骨软骨缺损协同再生修复。
进一步的，所述的羟基磷灰石，以PVP聚乙烯吡咯烷酮为模板制备纳米羟基磷灰石，在第一烧杯底部加入设定量的Ca(NO3)2·4H2O；在第二烧杯底部加入设定定量的 (NH4)3PO4·3H2O，Ca/P摩尔比为1.6-1.7，将第二烧杯放入第一烧杯中；配制PVP水溶液，用氨水调节溶液的pH值，pH值控制在10.5-11范围；滴加PVP水溶液至第二烧杯中，直到加满；用同样方法将第一烧杯液面加至与第二烧杯齐平，静置设定时间，再滴加PVP水溶液，直到第一烧杯液面比第二烧杯高设定高度；将第一烧杯密封，室温静置设定时间；将烧杯中得到的沉积物用去离子水洗，再经过滤，干燥，得到纳米羟基磷灰石。
总之，本发明的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架及其制备方法，具有如下优点：
1、本发明得到的负载TGF-β与nHAp的双层多孔支架，双层支架的上下结构和负载的TGF-β与nHAp为BMSCs提供了诱导信号，上层能诱导BMSCs分化为软骨细胞，下层能诱导BMSCs分化为成骨细胞；
2、本发明的双层支架具有完整结构和一定的压缩力学性能，维持细胞形态和承受局部应力，上层支架和下层支架能促进关节骨软骨缺损协同再生修复。
附图说明
图1是步骤A)纳米羟基磷灰石的制备装置。
图2是步骤B)脂质体的粒径。
图3是步骤C)双层多孔支架成胶后和冻干后的对比图。
图4是步骤C)双层多孔支架的力学性能对比图。
图5是步骤C)双层多孔支架对关节骨软骨缺损的修复图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架制备方法，包括如下步骤：
1、制备纳米羟基磷灰石（nHAp）：以PVP（聚乙烯吡咯烷酮）为模板制备纳米羟基磷灰石（nHAp），在第一烧杯（如100 ml烧杯）底部加入设定量的Ca(NO3)2·4H2O；同时，在第二烧杯（如25ml烧杯）底部加入设定定量的 (NH4)3PO4·3H2O，将第二烧杯放入第一烧杯中，即第二烧杯的容量或长宽高尺寸都少于第一烧杯；配制PVP水溶液，调节溶液的pH值，如用氨水调节溶液的pH值，pH值控制在10.5~11的范围；滴加PVP水溶液至第二烧杯中，直到加满，具体可用恒压漏斗缓慢滴加；用同样方法将第一烧杯液面加至与第二烧杯齐平，静置设定时间，如5 —10min，再滴加PVP水溶液，直到第一烧杯液面比第二烧杯高3—15mm；将第一烧杯用保鲜膜密封，室温静置设定时间，如4—8天；将烧杯中得到的沉积物用去离子水洗，如洗3-4次，也可以再用无水乙醇洗两次，再经过滤，干燥设定时间，如24 h，得到纳米羟基磷灰石（nHAp）。
第一、第二烧杯中分别加入的两种物质质量的关系，摩尔比在1.6-1.7这样的范围内。
2、制备包裹有TGF-β生长因子的脂质体：分别取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-CHO（磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基）和十八胺，在设定温度下溶于氯仿溶液，如在35℃—40℃下水浴下，加入放置有氯仿溶液的容器（如圆底烧瓶）中，快速旋转下溶于氯仿溶液中；然后在设定温度下蒸发，在容器（如圆底烧瓶）中形成薄膜；如用旋转蒸发仪在 50 r/min（离心半径4.5 cm）和 50—70℃下蒸发，在烧瓶（圆底烧瓶）中形成薄膜。然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，如用预热的含有TGF-β生长因子的4 mL超纯水在25℃、50r/min（离心半径4.5 cm）下对薄膜进行水化。将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理，经水浴超声清洗仪超声处理后得到得脂质体，经水浴超声清洗仪的额定功率为100 W，超声处理时间为15—30分钟，如为了处理方便，可以将水化溶液转移到小烧杯中。再将脂质体通过具有设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出，如450 nm 和220 nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器，以获得阳离子脂质体。将制备得到的阳离子脂质体滴加到浓度为0.2%的CMCS 溶液（羧甲基壳聚糖）中，二者体积比为1:1，匀速搅拌一段时间，如30 min，获得包裹有TGF-β生长因子的脂质体。
卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG-CHO、十八胺质量比为（3—5）:（1—1.5）:（0.1—0.2）:（0.1—0.2）。
1、制作载有TGF-β生长因子的双层纳米羟基磷灰石（nHAp）的多孔支架：支架的下层，将氧化海藻酸钠溶于水，明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，搅拌均匀，如磁力搅拌，注入成胶磨具中，成型后得到支架的下层结构。支架的上层，将氧化海藻酸钠溶于水，装载有TGF-β生长因子的脂质体、明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀，如磁力搅拌；然后注入已成胶的支架的下层结构上面，冷冻干燥后得到本发明双层多孔支架。
在上下层支架中，15 wt%的明胶、5 wt%的羧甲基壳聚糖、氧10 wt%化海藻酸钠体积比为（2—3）:1:（2—3）。
本发明的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，由上下两层构成，下层，是将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，经搅拌均匀后注入成胶磨具中得到；上层，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀后，注入已成胶的下层上面，冷冻干燥后得到双层多孔支架；所述脂质体，是卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基和十八胺，在设定温度下溶于氯仿溶液；然后在设定温度下蒸发，在圆底烧瓶中形成薄膜；然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，再将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理，得到脂质体，再将脂质体通过具有设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出以获得装载有TGF-β生长因子的脂质体。
实施例1
以PVP为模板制备nHAp，在100 ml烧杯底部加入一定量的Ca(NO3)2·4H2O；同时，在25 ml烧杯底部加入一定量的 (NH4)3PO4·3H2O ，Ca/P摩尔比为1.67；将25 ml烧杯放入100 ml烧杯中；配制不同质量分数的PVP水溶液，用氨水调PH至10.5；用恒压漏斗缓慢滴加PVP至25 ml烧杯中，直到加满；用同样方法将100 ml烧杯液面加至与25 ml烧杯齐平，静置5min；滴加PVP，直到100 ml烧杯液面比25 ml高出5 mm（如图1）；将100 ml烧杯用保鲜膜密封，室温静置5天，沉积物用去离子水洗3-4次，无水乙醇洗两次，过滤，干燥24 h；这样，制得本发明的纳米羟基磷灰石（nHAp）。
实施例2
分别取40 mg卵磷脂 /10 mg胆固醇 /1 mg DSPE-PEG-CHO/1 mg十八胺，37℃下水浴快速旋转溶于40 mL氯仿溶液于100 mL圆底烧瓶中。用旋转蒸发仪在 50 r/min（离心半径 4.5 cm）和 60 ℃下蒸发，在圆底烧瓶中形成薄膜。用预热的含有2 微克 TGF-β的40 mL超纯水在25℃、50 r/min（离心半径4.5 cm）下对薄膜进行水化20 min。将水化溶液转移到小烧杯中，置于水浴超声清洗仪（额定功率为100 W）中超声20 min,经超声后所得到得脂质体。通过具有450 nm 和220 nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出，以获得装载 TGF-β的脂质体。将制备得到的阳离子脂质体滴加到浓度为0.2%的 CMCS 溶液中（1：1），匀速搅拌工艺要求的一段时间，如30 min。图2为制得的脂质体的粒径和电位，主要分布在448 nm。
实施例3
下层，将1 g氧化海藻酸钠溶于10 mL水，15 g明胶和5 g羧甲基壳聚糖溶于100 ml水，将1 g羟基磷灰石分散在10 ml明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，然后把10 ml氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，磁力搅拌均匀，注入成胶磨具中。下层，将1 g氧化海藻酸钠溶于10 mL水，5 mL脂质体加入到10 ml明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，磁力搅拌均匀。注入已成胶的下层上面，冷冻干燥后得到双层多孔支架(如图3)，可见其具有非常完整的结构。图4为上层、下层和双层支架的力学性能对比图，其符合软骨和软骨下层的力学性能要求。
实施例4
将冻干后的双层多孔支架植入到成熟兔子左腿的关节管软骨缺损处，右腿为空白对照组，关节软骨缺损处未植入双层多孔支架。在一个月后，观察切面发现空白对照的软骨长进了软骨下层，而双层材料有明显的骨和软骨的界限，完成关节骨软骨缺损的界面修复（如图5）。并且在三个月后，效果将更加明显，有力证明本发明的上层支架和下层支架能促进关节骨软骨缺损协同再生修复。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）制备纳米羟基磷灰石：以PVP（聚乙烯吡咯烷酮）为模板制备纳米羟基磷灰石，在第一烧杯底部加入设定量的Ca(NO3)2·4H2O；在第二烧杯底部加入设定量的 (NH4)3PO4·3H2O，Ca/P摩尔比为1.5-1.8，将第二烧杯放入第一烧杯中；配制PVP水溶液，调节溶液的pH值，pH值控制在10.5~11范围；滴加PVP水溶液至第二烧杯中，直到加满；用同样方法将第一烧杯液面加至与第二烧杯齐平，静置设定时间，再滴加PVP水溶液，直到第一烧杯液面比第二烧杯高设定高度；将第一烧杯密封，室温静置设定时间；将烧杯中得到的沉积物用去离子水洗，再经过滤，干燥，得到纳米羟基磷灰石；
2）制备包裹有TGF-β生长因子的脂质体：分别取卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基和十八胺，卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为（3—5）:（1—1.5）:（0.1—0.2）:（0.1—0.2）；在设定温度下溶于氯仿溶液，然后在设定温度下蒸发，在容器中形成薄膜；然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理得到得脂质体；再将脂质体通过设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出，获得阳离子脂质体；将阳离子脂质体滴加到设定浓度的CMCS 溶液中，匀速搅拌，获得包裹有TGF-β生长因子的脂质体；
3）制作载有TGF-β生长因子的双层纳米羟基磷灰石的多孔支架：支架的下层，将氧化海藻酸钠溶于水，明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，搅拌均匀，注入成胶磨具中，成型后得到支架的下层结构；支架的上层，将氧化海藻酸钠溶于水，装载有TGF-β生长因子的脂质体、明胶和羧甲基壳聚糖溶于水，然后把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀；然后注入已成胶的支架的下层结构上面，冷冻干燥后得到本发明双层多孔支架。
2.根据权利要求1所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，步骤A)中所述加入的Ca(NO3)2·4H2O和(NH4)3PO4·3H2O的Ca/P摩尔比为1.6-1.7。
3.根据权利要求1所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，第一烧杯液面比第二烧杯液面高3—15mm。
4.根据权利要求1—3任一所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，卵磷脂 、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为4:1:0.1:0.1。
5.根据权利要求4所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，将卵磷脂、胆固醇、和十八胺，在35℃—40℃下水浴下，加入放置有氯仿溶液的圆底烧瓶的容器中，快速旋转下溶于氯仿溶液中；然后用旋转蒸发仪在 50 r/min、离心半径 4.5 cm和 50—70℃下蒸发。
6.根据权利要求4所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，将脂质体通过具有450 nm 和220 nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出。
7.根据权利要求4所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，阳离子脂质体滴加到浓度为0.2%的 CMCS 溶液，二者体积比为1:1。
8.根据权利要求1—3任一所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架的制备方法，其特征在于，在上下层支架中，15 wt%的明胶、5 wt%的羧甲基壳聚糖、10 wt%氧化海藻酸钠体积比为（2—3）:1:（2—3）。
9.修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，其特征在于，由上、下两层构成，所述下层，是将羟基磷灰石分散在明胶和羧甲基壳聚糖溶液中，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、纳米羟基磷灰石的混合溶液中，经搅拌均匀后注入成胶磨具中得到；所述上层，把氧化海藻酸钠溶液加入到明胶和羧甲基壳聚糖、脂质体的混合溶液中，搅拌均匀后，注入已成胶的下层上面，冷冻干燥后得到双层多孔支架；所述脂质体，是卵磷脂、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基和十八胺，在设定温度下溶于氯仿溶液；然后在设定温度下蒸发，在容器中形成薄膜；然后用含有设定含量的TGF-β生长因子的纯水对薄膜进行水化，再将水化溶液，置于超声清洗仪中超声处理，得到脂质体，再将脂质体通过具有设定孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出以获得装载有TGF-β生长因子的脂质体；
在上、下层支架中，15 wt%的明胶、5 wt%的羧甲基壳聚糖、10 wt%氧化海藻酸钠体积比为（2—3）:1:（2—3）；
所述卵磷脂 、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-醛基、十八胺质量比为（3—5）:（1—1.5）:（0.1—0.2）:（0.1—0.2）。
10.根据权利要求9所述的修复关节骨软骨缺损的双层多孔支架，其特征在于，所述的羟基磷灰石，以聚乙烯吡咯烷酮为模板制备纳米羟基磷灰石，在第一烧杯底部加入设定量的Ca(NO3)2·4H2O；在第二烧杯底部加入设定定量的 (NH4)3PO4·3H2O，Ca/P摩尔比为1.6-1.7，将第二烧杯放入第一烧杯中；配制PVP水溶液，用氨水调节溶液的pH值，pH值控制在10.5-11范围；滴加PVP水溶液至第二烧杯中，直到加满；用同样方法将第一烧杯液面加至与第二烧杯齐平，静置设定时间，再滴加PVP水溶液，直到第一烧杯液面比第二烧杯高设定高度；将第一烧杯密封，室温静置设定时间；将烧杯中得到的沉积物用去离子水洗，再经过滤，干燥，得到纳米羟基磷灰石。
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