CN115414532B - 具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，由软骨层、界面阻隔层和软骨下骨层组成，软骨层、界面阻隔层和软骨下骨层各层材料均为细菌纤维素纳米纤维，界面阻隔层的孔隙结构相比软骨层和软骨下骨层的孔隙结构更为致密，以阻隔骨组织与软骨组织相互迁移，制备过程中，在细菌纤维素膜内引入微米级孔隙的同时膜液界面细菌纤维素纳米纤维连续不断地分泌，使得细菌纤维素纳米纤维贯穿各层，提高了支架各层的界面结合强度，从而使界面阻隔层与软骨下骨层和软骨层为不可分割的一体化结构，界面阻隔层的纳米纤维网络结构为维持软骨和软骨下骨相异的生理环境提供了重要结构基础。
Description
技术领域
本发明属于医用高分子生物材料及骨软骨组织工程技术领域，具体涉及一种以细菌纤维素为基质材料构建用于骨软骨修复的细菌纤维素基一体化骨软骨支架及其制备方法。
背景技术
关节软骨缺损伴随膝关节软骨下骨退行性病变是临床上常见的疾病，可导致膝关节功能障碍、明显疼痛甚至残疾。由于软骨组织缺乏血管、淋巴，加之本身软骨细胞微乎其微的再生能力，较大的软骨缺损(>4mm)难以自我愈合。软骨下骨作为支持软骨代谢和提供力学支撑的重要组织，软骨的病变也会直接影响软骨下骨的正常功能。因此，作为结构与功能上互相依存的两个组织，当其中一层发生长期病变时，对于骨软骨全层的组织修复就变得尤为重要。临床上常用的治疗方法有自/异体骨移植法、微骨折法和自体软骨细胞移植等，由于其治疗手段伴随有供体有限、修复组织以纤维软骨为主和修复组织易退化等手术问题，目前临床上还没有根治的治疗方法。近年来，组织工程技术的迅猛发展为关节骨软骨损伤的再生修复提供了新的解决方案。人体关节骨软骨组织由关节软骨、钙化软骨和软骨下骨三部分构成，其中处于界面阻隔层的钙化软骨在正常人体中起传导关节所受应力、阻隔骨组织与软骨组织相互迁移的关键作用。
传统的骨软骨组织工程支架要么缺少钙化软骨层，要么是堆垛式的非一体化结构，因而易发生层间剪切破坏。如：公布号为CN113018509A，公布日为2021年6月25日的专利文献中，公开了一种复合骨软骨支架。该支架从下至上依次包括软骨下骨层、纤维膜状的过渡层和具有网状结构的软骨层。并结合熔融沉积成型打印、水热法、静电纺丝工艺和挤出成型工艺先逐层制备之后再堆垛成型，从而导致支架的各层界面过渡区域发生结构的突变，支架的各层之间结合不紧密，界面结合强度低，植入受体缺损部位后，各层间易发生分离和脱落，不利于受损组织的长期稳定修复。因此，如何构建从软骨－钙化软骨－软骨下骨区无缝过渡的一体化骨软骨支架是目前骨软骨修复支架的难点。
细菌纤维素是一种性能优异的新型天然纳米材料，不仅具有良好的生物相容性，无免疫原性，而且具有与体内细胞外基质相似的纳米纤维三维网络结构。与其它材料相比，细菌纤维素的制备过程简单、绿色无污染，可降解，成本低廉，生物合成过程调控，这些优点使其成为目前最具发展前景的生物材料之一，已在许多组织工程领域(如皮肤、血管、神经等)呈现出巨大应用潜力。更为重要的是，细菌纤维素的致密纳米纤维网络结构特别适于构建理想的界面阻隔层，能够有效地阻止软骨组织与成骨组织地相互迁移，维持组织修复微环境。然而，至今没有采用细菌纤维素构建一体化骨软骨支架的公开报道。
发明内容
针对现有技术，本发明的目的旨在提供一种具有界面阻隔层的一体化骨软骨支架及制备方法，即采用模板法和膜液界面培养法，原位调控细菌纤维素膜的孔隙率、厚度和三维形状，在保持细菌纤维素一体化纳米纤维网络结构的同时，在支架软骨层和软骨下骨层引入适宜组织修复的微米级孔隙。该方法克服了传统骨软骨多层支架结构不稳定，制备流程复杂的缺陷。本发明制备方法获得一体化支架，界面阻隔层的纳米纤维网络结构为维持软骨和软骨下骨相异的生理环境和阻隔软骨组织和软骨下骨组织相互迁移提供了保障，且制备工艺简便、成本低廉及易实现规模化生产，对推动细菌纤维素在骨软骨支架乃至其它组织工程支架方面的应用都具有重要的意义。
为了解决上述技术问题，本发明提出的一种具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，该一体化骨软骨支架由软骨层、界面阻隔层和软骨下骨层组成，所述软骨层、界面阻隔层和软骨下骨层各层材料均为细菌纤维素纳米纤维，所述界面阻隔层为软骨下骨层与软骨层的过渡区域，其中，所述界面阻隔层的孔隙结构相比所述软骨层和软骨下骨层的孔隙结构更为致密、且所述软骨层的孔隙结构比所述软骨下骨层的孔隙结构致密，即所述界面阻隔层为结构致密的细菌纤维素，能够阻隔骨组织与软骨组织相互迁移，所述界面阻隔层与软骨下骨层和软骨层为不可分割的一体化结构；该一体化结构的骨软骨支架采用模板法和膜液界面培养法制备。
进一步讲，制备过程中，通过在阵列型针状模具内连续地间歇添加细菌培养基，实现在形成所述软骨层和软骨下骨层过程中引入微米级孔隙的同时膜液界面细菌纤维素纳米纤维连续不断地分泌，从而获得细菌纤维素纳米纤维贯穿所述的软骨层、界面阻隔层和软骨下骨层、且相互交织的一体化多孔细菌纤维素支架。
该一体化骨软骨支架的所述软骨层和软骨下骨层内的孔隙均为微米级孔隙，该微米级孔隙由在阵列型针状模具内培养细菌纤维素膜过程中模具微针所阻碍细菌纤维素纳米纤维分布的空间形成，所述微米级孔隙的孔径及孔间距与分布在所述阵列型针状模具上的微针的粗细及阵列的中心间距基本一致。
该一体化骨软骨支架的整体形状根据受体骨软骨缺损部位的实际需求，通过调整所述阵列型针状模具的形状和尺寸来确定。
同时本发明还提出了用于制备该一体化骨软骨支架的阵列型针状模具，该阵列型针状模具包括底座和上盖，所述底座和上盖的相对面上均设置有呈阵列型均匀分布的微针；所述上盖与所述底座的边缘之间留有空隙；所述底座上微针的粗细、高度和阵列的中心间距均大于或等于所述上盖上微针的粗细、高度和阵列的中心间距。
进一步讲，所述底座和上盖的材质包括PDMS、PMMA、PTFE、铝和铜中的一种。
所述阵列型针状模具的底座和上盖上的微针的形状包括圆柱、圆锥、圆台、棱锥和棱台中的一种。微针的形状优选的是圆柱：所述底座上，微针直径为D1，微针高度为H1，阵列中心间距为A1；所述上盖上，微针直径为D2，微针高度为H2，阵列中心间距为A2；其中，D1为300～600μm，D2为200～400μm，A1为0.5～2mm，A2为0.5～2mm，H1为2～6mm，H2为2～4mm。
本发明所述的一体化骨软骨支架的制备方法，采用上述的阵列型针状模具，并包括以下步骤：
步骤一、在无菌环境下，将菌液接种到经紫外灭菌的阵列型针状模具的底座内，在30℃条件下静态培养2天，制得厚度为1mm细菌纤维素基底膜；所用的菌种是木醋杆菌、醋化醋杆菌、木葡糖酸醋杆菌、产醋醋杆菌和巴氏醋杆菌中的一种。
步骤二、制备软骨下骨层：在30℃条件下，以0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基从所述的阵列型针状模具上方均匀地添加在细菌纤维素基底膜表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液10～40次，至细菌纤维素膜表面没过底座的微针针头，最终在基底膜上形成厚度为1～4mm、且具有微米级孔隙结构的软骨下骨层。
步骤三、制备界面阻隔层：按照0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基均匀地添加在软骨下骨层的表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液1～3次，最终在所述的软骨下骨层上形成厚度为60～200μm，具有致密纳米纤维网络结构的界面阻隔层。
步骤四、制备软骨层：将阵列型针状模具的上盖盖在界面阻隔层上，按照0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基经过上盖周边与底座侧壁之间的空隙均匀地添加在界面阻隔层的表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液10～20次，最终在所述的界面阻隔层2上形成厚度为1～2mm、且具有微米级孔隙结构的软骨层，所述软骨层的微米级孔隙结构比所述软骨下骨层的微米级孔隙结构致密。
步骤五、静置培养1天后，去除所述上盖和底座及细菌纤维素基底膜，将制备的细菌纤维素基一体化支架纯化并冷冻干燥后，即为具有软骨下骨层、界面阻隔层和软骨层三层结构的一体化骨软骨支架。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明是以细菌纤维素为材料，基于模板法和膜液界面培养法一体化逐层制备，可个性化地定制具有界面阻隔层的一体化骨软骨支架；
(2)本发明制备方法通过在模具内一次性逐层培养实现了具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架的制备，界面阻隔层的纳米纤维网络结构为维持软骨和软骨下骨相异的生理环境和阻隔软骨组织和软骨下骨组织相互迁移提供了重要结构基础；
(3)本发明制备方法制备工艺简便、成本低廉、绿色无污染及易实现规模化生产，该方法制备的界面阻隔层可以有效的模拟钙化软骨层的界面阻隔作用，能为一体化骨软骨支架的制备提供借鉴。
附图说明
图1为本发明含界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架的结构示意简图；
图2为本发明制备方法中所用阵列型针状模具底座的结构示意简图；
图3为本发明制备方法中所用阵列型针状模具上盖的结构示意简图；
图4为本发明制备方法中所有阵列型针状模具的剖面结构示意简图。
附图标记说明：1-软骨层；2-界面阻隔层；3-软骨下骨层；4-底座；5-微针；6-上盖。
具体实施方式
本发明的设计思路是：采用模板法和膜液界面培养法制备具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，即采用模板法在一体化细菌纤维素膜内引入微米级孔隙，采用膜液界面培养法制备一体化细菌纤维素支架，以致密的细菌纤维素纳米纤维网络作为界面阻隔层，通过改变模具的结构参数来调控细菌纤维素基一体化支架的结构，从而制备出具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步的说明，但下述实施例绝非对本发明有任何限制。
如图1所示，本发明提出的一种具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，由软骨层1、界面阻隔层2和软骨下骨层3组成，所述软骨层1、界面阻隔层2和软骨下骨层3各层材料均为细菌纤维素纳米纤维，所述界面阻隔层2为软骨下骨层3与软骨层1的过渡区域，其中，所述界面阻隔层2的孔隙结构相比所述软骨层1和软骨下骨层3的孔隙结构更为致密、且所述软骨层1的孔隙结构比所述软骨下骨层3的孔隙结构致密，以阻隔骨组织与软骨组织相互迁移，所述界面阻隔层2与软骨下骨层3和软骨层1为不可分割的一体化结构，
本发明的一体化结构的骨软骨支架采用模板法和膜液界面培养法制备，在制备过程中，通过在阵列型针状模具内连续地间歇添加细菌培养基，实现在形成所述软骨层1和软骨下骨层3过程中引入微米级孔隙的同时膜液界面细菌纤维素纳米纤维连续不断地分泌，从而获得细菌纤维素纳米纤维贯穿所述的软骨层1、界面阻隔层2和软骨下骨层3、且相互交织的一体化多孔细菌纤维素支架。
本发明所述的一体化结构的骨软骨支架，其中，所述软骨层1和软骨下骨层3内的孔隙均为微米级孔隙，该微米级孔隙由在阵列型针状模具内培养细菌纤维素膜过程中模具微针所阻碍细菌纤维素纳米纤维分布的空间形成，所述微米级孔隙的孔径及孔间距与分布在所述阵列型针状模具上的微针的粗细及阵列的中心间距基本一致。该一体化骨软骨支架的整体形状根据受体骨软骨缺损部位的实际需求，通过调整所述阵列型针状模具的形状和尺寸来确定。
如图2和图3所示，用于制备该一体化骨软骨支架的阵列型针状模具的结构是：包括底座4和上盖6，所述底座4的外形为筒状，所述底座4和上盖6的相对面上均设置有呈阵列型均匀分布的微针5；所述上盖6与筒状的底座4的边缘之间留有空隙；所述底座4上微针的粗细、高度和阵列的中心间距均大于或等于所述上盖6上微针的粗细、高度和阵列的中心间距。
所述底座4和上盖6的材质包括PDMS、PMMA、PTFE、铝和铜中的一种，考虑到降低成本，优选的为PDMS。
所述阵列型针状模具的底座4和上盖6上的微针的形状包括圆柱、圆锥、圆台、棱锥和棱台中的一种，考虑到自然骨组织的孔隙多为圆形，优选的为圆柱状微针。
所述界面阻隔层2由阵列型针状模具的底座4和上盖6间的致密细菌纤维素层形成，界面阻隔层2的厚度与阵列型针状模具的底座4和上盖6间的间距一致，如图4所示。
本发明中，添加细菌培养基的加液方式是雾状喷洒或是液态注射，以使细菌培养基在细菌纤维素基底膜表面或是细菌纤维素膜表面均匀浸润。
实施例1
以细菌纤维素为原料，采用模板法和膜液界面培养法制备具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架。
本实施例1中，所使用的所述阵列型针状模具为PDMS阵列型针状模具，如图2和图3所示，底座4的外轮廓为圆筒，上盖6的轮廓为圆盘，所述圆盘的外径略小于圆筒的内径，使得作为底座4的圆筒的上边缘与作为上盖6的圆盘之间留有空隙，如图4所示，该空隙在制备支架过程充当注液口。在底座4和上盖6相对的面上均设有圆柱状的微针5，PDMS阵列型针状模具的底座4盖上上盖6后，两层微针间的间距即为最终制得的支架的界面阻隔层2的厚度。本实施例中所用模具中微针的结构参数是：所述底座4上：微针直径为500μm，微针高度为6mm，微针排布的阵列中心间距为1mm；所述上盖6上：微针直径为300μm，微针高度为4mm，阵列中心间距为1mm。
具体制备步骤如下：
1、配制细菌培养基：将葡萄糖(25g/L)、酵母粉(7.5g/L)、蛋白胨(10g/L)和磷酸氢二钠(10g/L)依次加入装有1000mL超纯水的烧杯中，搅拌直至其完全溶解；用冰醋酸调节溶液的pH值至4～5，配制成培养基后置入灭菌锅中在115℃、0.1MPa下灭菌30min；
2、在无菌环境下，将混合木醋杆菌菌液的培养基接种到经紫外灭菌的PDMS阵列型针状模具底座4内，在30℃条件下静态培养2天，得到厚度为2mm用于膜液界面培养细菌纤维素的基底膜；
3、制备软骨下骨层3：在30℃条件下，以雾状形式、并按照0.03ml/cm2的喷洒量将步骤1配制的细菌培养基从模具上方均匀的喷洒在细菌纤维素基底膜表面，待细菌纤维素膜表面的培养基消耗完毕后再次喷洒，重复喷洒40次，至细菌纤维素膜表面没过模具底座4的微针针头，最终在基底膜上形成厚度为4mm，孔间距为1mm，孔径为500μm的具有微米级孔隙结构的软骨下骨层3。
4、制备界面阻隔层2：仍然以雾状形式，在30℃条件下，按照0.04mL/cm2的喷洒量将细菌培养基均匀地喷洒在软骨下骨层3的细菌纤维素膜表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次喷洒1次，在所述的软骨下骨层3上形成厚度为80μm，具有致密纳米纤维网络结构的界面阻隔层2。
5、制备软骨层1：将模具的上盖6盖在界面阻隔层2上，用注射器以液态形式从上盖6周边与底座4侧壁上边缘之间的空隙将细菌培养基均匀地添加到界面阻隔层2的细菌纤维素膜表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液20次，最终在所述的界面阻隔层2上形成厚度为2mm、孔间距为1mm，孔径为300μm的具有微米级孔隙结构的软骨层1。
6、静置培养1天后，去除所述上盖6和底座4及细菌纤维素基底膜，将制备的细菌纤维素基一体化支架纯化并冷冻干燥后，即为具有软骨下骨层3、界面阻隔层2和软骨层1三层结构的一体化骨软骨支架。
图1为实施例1所制备的一体化骨软骨支架的结构示意图，其中，1处为支架的软骨层，厚度为2mm，微孔中心间距为1mm，孔径为300μm；2处为支架的界面阻隔层，厚度为80μm；3处为支架的软骨下骨层，厚度为4mm，微孔中心间距为1mm，孔径为500μm。
实施例2
以细菌纤维素为原料，采用模板法和膜液界面培养法，制备具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨仿生支架。
本实施例2所使用的所述阵列型针状模具与实施例1的结构一样，不同仅为微针的参数不同，本实施例2中微针的结构参数是：所述底座4上：微针直径为400μm，微针高度为6mm，微针排布的阵列中心间距为1.5mm；所述上盖6上：微针直径为200μm，微针高度为4mm，阵列中心间距为1.5mm。
具体的制备步骤与实施例1基本相同，不同仅为最终形成的具有软骨下骨层3、界面阻隔层2和软骨层1三层结构的一体化骨软骨支架，其中，软骨下骨层3的厚度为4mm，孔间距为1.5mm，孔径为400μm；界面阻隔层2的厚度为80μm；软骨层1的厚度为2mm、孔间距为1.5mm，孔径为200μm。
实施例3
以细菌纤维素为原料，采用模板法和膜液界面培养法，制备具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架。
本实施例3所使用的所述阵列型针状模具与实施例1的结构一样，不同仅为微针的参数不同，本实施例3中微针的结构参数是：所述底座4上：微针直径为500μm，微针高度为4mm，微针排布的阵列中心间距为1mm；所述上盖6上：微针直径为300μm，微针高度为3mm，阵列中心间距为1mm。
实施例3的具体的制备步骤与实施例1基本相同，不同仅为：步骤3中，细菌培养的喷洒的次数由40次改为20次；步骤4中，将细菌培养的喷洒的次数由2次改为3次；步骤5中，将细菌培养的喷洒的次数由20次改为10次；最终形成的具有软骨下骨层3、界面阻隔层2和软骨层1三层结构的一体化骨软骨支架，其中，软骨下骨层3的厚度为2mm，孔间距为1mm，孔径为500μm；界面阻隔层2的厚度为160μm；软骨层1的厚度为1mm、孔间距为1mm，孔径为300μm。
对比例
以公布号为CN113018509A的披露的复合骨软骨支架为例，基本步骤是：利用熔融沉积成型工艺将聚醚醚酮3D打印出孔径为800μm的网状结构软骨下骨层；利用水热法将生物相容溶液涂覆在所述软骨下骨层表面,形成孔隙为1.1μm的生物相容层；利用静电纺丝工艺将聚己内酯浆料在所述生物相容层表面3D打印出孔隙为17μm的纤维膜状过渡层；利用挤出成形工艺将壳聚糖和明胶混合水溶液在所述过渡层表面3D打印出具有网状结构的孔径为750μm的软骨层,挤出成形的原料中包含软骨基质和生物因子，得到复合骨软骨支架；制备得到具有纤维膜状过渡层的堆垛式三层复合骨软骨支架。
本发明采用模板法和膜液界面培养法制备具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，使用模板法在一体化细菌纤维素膜内引入微米级孔隙，使用膜液界面培养法制备一体化细菌纤维素膜，以致密的细菌纤维素纳米纤维网络作为界面阻隔层，通过改变模具的结构参数来调控细菌纤维素基一体化支架的结构，从而制备出具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架。对比例中的复合骨软骨支架由于相邻层之间是堆垛式物理连接方式，因此，易发生层间剪切破坏，存在三层复合骨软骨支架易解体脱落问题。实施例1-3中制备得到的具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，能够更好的仿生骨软骨组织的多层结构和力学性能，在骨软骨组织工程技术领域具有更大的应用潜力。本发明制备方法提高了支架各层的界面结合强度，克服了传统支架各层间因连接不紧密而易解体问题，界面阻隔层的纳米纤维网络结构为软骨和软骨下骨相异的生理环境和阻隔软骨组织与软骨下骨组织相互迁移提供了重要结构基础。本发明制备方法且制备工艺简便、成本低廉、绿色无污染及易实现规模化生产，能为一体化骨软骨仿生支架的制备提供借鉴。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变化，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (9)
1.一种具有界面阻隔层的细菌纤维素基一体化骨软骨支架，其特征在于，该一体化骨软骨支架由软骨层(1)、界面阻隔层(2)和软骨下骨层(3)组成，所述软骨层(1)、界面阻隔层(2)和软骨下骨层(3)各层材料均为细菌纤维素纳米纤维，所述界面阻隔层(2)为软骨下骨层(3)与软骨层(1)的过渡区域，其中，所述界面阻隔层(2)的孔隙结构相比所述软骨层(1)和软骨下骨层(3)的孔隙结构更为致密、且所述软骨层(1)的孔隙结构比所述软骨下骨层(3)的孔隙结构致密，以阻隔骨组织与软骨组织相互迁移，所述界面阻隔层(2)与软骨下骨层(3)和软骨层(1)为不可分割的一体化结构；该一体化结构的骨软骨支架采用模板法和膜液界面培养法制备；
制备过程中，通过在阵列型针状模具内间歇添加细菌培养基，实现在形成所述软骨层(1)和软骨下骨层(3)过程中引入微米级孔隙的同时膜液界面细菌纤维素纳米纤维连续不断地分泌，从而获得细菌纤维素纳米纤维贯穿所述的软骨层(1)、界面阻隔层(2)和软骨下骨层(3)、且相互交织的一体化多孔细菌纤维素支架。
2.根据权利要求1所述的一体化骨软骨支架，其特征在于，所述软骨层(1)和软骨下骨层(3)内的孔隙均为微米级孔隙，该微米级孔隙由在阵列型针状模具内培养细菌纤维素膜过程中模具微针所阻碍细菌纤维素纳米纤维分布的空间形成，所述微米级孔隙的孔径及孔间距与分布在所述阵列型针状模具上的微针的粗细及阵列的中心间距基本一致。
3.根据权利要求2所述的一体化骨软骨支架，其特征在于，该一体化骨软骨支架的整体形状根据受体骨软骨缺损部位的实际需求，通过调整所述阵列型针状模具的形状和尺寸来确定。
4.根据权利要求1所述的一体化骨软骨支架，其特征在于，所述阵列型针状模具包括底座(4)和上盖(6)，所述底座(4)和上盖(6)的相对面上均设置有呈阵列型均匀分布的微针(5)；所述上盖(6)与所述底座(4)的边缘之间留有空隙；所述底座(4)上微针的粗细、高度和阵列的中心间距均大于或等于所述上盖(6)上微针的粗细、高度和阵列的中心间距。
5.根据权利要求4所述的一体化骨软骨支架，其特征在于，所述底座(4)和上盖(6)的材质包括PDMS、PMMA、PTFE、铝和铜中的一种。
6.一种如权利要求1至3中任一所述的一体化骨软骨支架的制备方法，其特征在于，采用如权利要求4或5中所述的阵列型针状模具，并包括以下步骤：
步骤一、在无菌环境下，将菌液接种到经紫外灭菌的阵列型针状模具的底座(4)内，在30℃条件下静态培养2天，制得厚度为1mm细菌纤维素基底膜；
步骤二、制备软骨下骨层(3)：在30℃条件下，以0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基从所述的阵列型针状模具上方均匀地添加在细菌纤维素基底膜表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液10～40次，至细菌纤维素膜表面没过底座(4)的微针针头，最终在基底膜上形成厚度为1～4mm、且具有微米级孔隙结构的软骨下骨层(3)；
步骤三、制备界面阻隔层(2)：按照0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基均匀地添加在软骨下骨层(3)的表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液1～3次，最终在所述的软骨下骨层(3)上形成厚度为60～200μm，具有致密纳米纤维网络结构的界面阻隔层(2)；
步骤四、制备软骨层(1)：将阵列型针状模具的上盖(6)盖在界面阻隔层(2)上，按照0.02～0.04mL/cm2的加液量将细菌培养基经过上盖(6)周边与底座(4)侧壁之间的空隙均匀地添加在界面阻隔层(2)的表面，待细菌纤维素膜表面的细菌培养基消耗完毕后再次加液，重复加液10～20次，最终在所述的界面阻隔层(2)上形成厚度为1～2mm、且具有微米级孔隙结构的软骨层(1)，所述软骨层(1)的微米级孔隙结构比所述软骨下骨层(3)的微米级孔隙结构致密；
步骤五、静置培养1天后，去除所述上盖(6)和底座(4)及细菌纤维素基底膜，将制备的细菌纤维素基一体化支架纯化并冷冻干燥后，即为具有软骨下骨层(3)、界面阻隔层(2)和软骨层(1)三层结构的一体化骨软骨支架。
7.根据权利要求6所述的一体化骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述阵列型针状模具的底座(4)和上盖(6)上的微针的形状包括圆柱、圆锥、圆台、棱锥和棱台中的一种。
8.根据权利要求7所述的一体化骨软骨支架的制备方法，其特征在于，所述阵列型针状模具的底座(4)和上盖(6)上的微针均为圆柱：所述底座(4)上，微针直径为D1，微针高度为H1，阵列中心间距为A1；所述上盖(6)上，微针直径为D2，微针高度为H2，阵列中心间距为A2；其中，D1为300～600μm，D2为200～400μm，A1为0.5～2mm，A2为0.5～2mm，H1为2～6mm，H2为2～4mm。
9.根据权利要求6所述的一体化骨软骨支架的制备方法，其特征在于，添加细菌培养基的加液方式是雾状喷洒或是液态注射，以使细菌培养基在细菌纤维素基底膜表面或是细菌纤维素膜表面均匀浸润。
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Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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