KR101829132B1

KR101829132B1 - 성형된 박막 지지체를 이용한 3차원 조직 재생 방법

Info

Publication number: KR101829132B1
Application number: KR1020160077744A
Authority: KR
Inventors: 황창모; 홍소영
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2018-02-13
Also published as: KR20180000067A

Abstract

본 발명은 3차원 조직재생 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계; 2) 목적하는 성형용 패턴을 가지는 몰드 하에서 상기 고분자 박막 지지체에 열, 진공 혹은 압력을 가하여 박막 지지체를 성형하는 단계; 3) 성형된 박막 지지체에 세포를 배양하여 부착시키는 단계; 및 4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 3차원 조직재생을 위한 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

성형된 박막 지지체를 이용한 3차원 조직 재생 방법 {Three dimensional tissue regeneration with preformed thin membranes}

조직공학(tissue engineering)이란 과학의 발달과 함께 등장한 새로운 분야의 하나로서 생명과학과 공학, 의학 등의 기본 개념과 과학기술을 통합 응용하는 다학제간 학문으로 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고 더 나아가 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체하거나 재생시키기 위해 체내에 이식이 가능한 인공조직을 만들어 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용학문이다.

대표적인 조직공학 기법은 우선, 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 후 분리된 세포를 배양을 통해 필요한 양만큼 증식시키고 이를 다공성 생분해성 고분자 지지체에 심어 일정기간 동안 체외 배양하여 얻어지는 하이브리드형 세포/고분자 구조물을 다시 인체 내에 이식한다. 이식 후 세포들은 대부분의 조직이나 장기의 경우 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체 내에 혈관이 자라서 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식, 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 지지체는 그동안 분해되어 없어지게 되는 기법을 응용하는 것이다.

따라서, 이러한 조직공학 연구를 위해서는 우선 생체 조직과 유사한 생분해성 고분자 지지체를 제조하는 일이 중요하다. 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료의 주된 요건은 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할도 할 수 있어야 한다는 것이다. 이는 이식 후 혈액 응고나 염증 반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성을 가져야 함을 의미한다.

박막 지지체를 이용한 종래 3차원 조직재생 기술 중 하나인 캐스팅 방법(solvent cast process)은 복잡한 과정을 거쳐야 하고, 깊이-높이비가 큰 몰드 이용 시 성형용 몰드에 조직이 밀착될 가능성이 높아 몰드로부터 조직을 분리하는 방법이 별도로 필요하며, 분리가 어려워 조직재생의 효율이 낮은 문제가 있다. 또한 다공성 박막 지지체의 경우 효율적인 물질 전달이 가능하여 세포의 생존, 성장 및 조직 형성이 용이하나, 상기 캐스팅 방법은 다공성 재질 성형에 어려움이 있어 캐스팅 방법으로 제조된 다공성 재질의 지지체의 경우, 적층 시 세포배양액과 같은 물질을 전달하는 데에 어려움이 있다. 반면, 다공성 박막이 아닌 재질로 캐스팅 방법을 이용하여 제작된 지지체는 표면이 치밀한 구조를 가지고 있어 여러 겹으로 적층 시 산소 및 영양분의 효과적인 전달이 불가능하여 세포의 사멸이 잘 일어나고, 조직형성이 원활하지 않는 한계가 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 효율이 높고, 성형 효과가 큰 3차원 조직재생 방법을 연구한 결과, 고분자 박막 지지체에 열, 진공 혹은 압력을 가하여 성형을 한 후, 세포가 부착된 수 개의 박막 지지체를 적층하는 3차원 조직 재생 방법을 개발하였고, 본 발명의 방법을 통하여 제조된 3차원 조직 재생의 경우, 물질 전달이 원활할 수 있으며, 두꺼운 조직의 형성도 가능한 이점 등이 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

한국공개특허공보 제10-2013-0042238호

본 발명의 목적은

1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;

2) 목적하는 성형용 패턴을 가지는 몰드 하에서 상기 고분자 박막 지지체에 열, 진공 혹은 압력을 가하여 박막 지지체를 성형하는 단계;

3) 성형된 박막 지지체에 세포를 배양하여 부착시키는 단계; 및

4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;

4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생을 위한 스캐폴드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 3차원 조직 혹은 3차원 조직재생을 위한 스캐폴드를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 과제들을 해결하고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여

1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;

4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법의 단계들은 모두 생체 외(in vitro)에서 수행된다.

본 발명에 있어서, “고분자”란 분자량이 매우 큰 분자인 거대분자로 구성된 물질을 의미하며, 본 발명의 고분자는 다공성 재질(예, 메쉬)일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 다공성 재질의 고분자는 기공이 연결된 구조일 수 있다. 본 발명에 있어서, “다공성”이란, 고체의 내부 또는 표면에 작은 공극이 있는 상태를 의미한다.

본 발명에 있어서,“생분해성 고분자”란 적어도 분해의 한 과정에서 생물의 대사가 관여하여 저분자량 화합물로 변하는 고분자 물질을 의미한다. 상기 생분해성 고분자로는 생분해성을 가지는 것이라면 당업계에 공지된 다양한 생체 고분자를 포함한다. 상기 생분해성 고분자는 카르보닐기(C=O)의 한쪽에 산소, 질소, 황 원자가 결합된 에스테르, 아미드, 티오에스테르를 포함하는 고분자, 카르보닐기에 양쪽에 산소, 질소, 황 원자가 결합된 카보네이트, 우레탄, 우레아 등을 포함하는 고분자, 또는 두 개의 카르보닐 기 사이에 산소, 질소, 황 원자가 연결된 아미드, 안하이드라이드 등을 포함하는 고분자를 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 생분해성 고분자는 알지네이트, 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스, 키토산, 실크(silk), 폴리디옥산(Polydioxanone, PDO), 폴리락트산(poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤, PLCL), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리비닐알코올(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 (poly (N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체 (poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer), 및 이들의 공중합체 군으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리락트산, 혹은 폴리카프로락톤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

현재까지는 PGA, PLA, PLGA, PCL, PDO 등만이 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용 가능한 생분해성 고분자로 승인되어 인체 조직의 체내 재생을 위한 고분자 지지체 재료로서 사용되고 있다.

상기 폴리카프로락톤(polycarprolactone)은 낮은 용융점을 가지며 기계적 성형이 용이하여 일정 수준 이상의 적당한 기계적 강도를 형성할 수 있고, 생체 친화적인 재료로 체내에서 가수 분해와 효소 활동 등의 방법으로 분해되어 이산화탄소와 물의 형태로 배출되며, 독성이 없어 많이 개발, 사용되고 있다.

조직공학 분야에서 지지체 상에 새로운 조직을 형성하는 것은 지지체의 다공성, 크기 및 3차원적 다공간 연결구조에 따라 크게 영향을 받기 때문에 이들은 매우 중요한 요소가 될 수 있다. 적절한 다공 구조는 충분한 수의 세포를 운반하기 위해서 필요하며, 상호 연결된 다공 구조는 영양성분 확산을 위해서 필요하다. 본 발명의 생분해성 고분자는 다공성 재질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “박막 지지체”는 얇은 막 형태의 지지체를 의미하며, 구체적으로 가열압연, 캐스팅 후 건조, 전기방사, 스핀코팅, 스프레이, 블로우몰딩, 계면중합법 등의 방법으로 제조할 수 있으며, 보다 구체적으로 전기방사의 방법을 이용하여 박막 지지체를 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 박막 지지체 제조 방법의 일반적인 원리는 하기와 같다. 가열압연은 성형용 소재를 용융 압출하면서 롤러를 통과시켜 얇은 성형물을 연속적으로 제작하는 방법으로서, 롤러 사이의 간격이나 롤러 회전 속도의 차이에 의한 신연으로 얇은 형상을 제작하는 원리를 가지며, 이를 응용한 다양한 방법이 가능하다. 캐스팅 후 건조는 고분자 용액을 판상 또는 롤러의 표면에 묻힌 후 건조하여 막을 제조하는 원리를 가진다. 전기방사는 고분자용액을 끝이 뭉툭한 관으로 밀어내면서 고전압을 가하여 전기장에 의해 목표한 표면에 가느다란 실 형태로 쌓이면 박막이 형성되는 원리를 가진다. 스핀코팅은 고속회전 디스크에 놓인 고분자 용액이 원심력에 의해 얇게 펴지면서 박막이 생성되는 원리이다.

본 발명에 있어서, 전기방사의 방법은 생분해성 고분자를 유기용매에 용해하여 방사액을 제조하고, 방사액을 방사기를 이용하여 방사함으로써 지지체를 제조하는 방법을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 생분해성 고분자 물질이자 열가소성 물질로 폴리카프로락톤을 80℃의 용매에서 6시간 동안 녹인 후 전기 방사하여 콜렉터에 모아 박막 지지체를 제조하였다(실시예 1).

본 발명에 있어서, 제공된 박막 지지체는 성장인자, 세포 움직임 조절 물질 또는 줄기세포의 호밍(homing) 효과를 일으키는 물질을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 성장인자로서, 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 VEGF(Vascular endothelial cell growth factor), EGF(epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), IGF (insulin growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), EPO (erythropoietin), angiopoietin-1, SDF-1 (stromal derivedfactor-1), macrophage inflammatory protein-1, HGF (hepatocyte growth factor), HDGF (hepatoma-derived growth factor), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF (transforming growth factor), BMP (bone morphogenic protein) 등이 박막 지지체에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성장인자 외에 성장인자의 방출 속도를 조절할 수 있는 헤파린이 박막 지지체에 포함될 수 있다.

다른 예로, 세포 움직임 조절 물질로서, 세포의 움직임을 조절할 수 있는 siRNA, shRNA, mRNA 또는 이들을 포함한 마이크로 비드 등이 박막 지지체에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 예로, 줄기세포의 호밍(homing) 효과를 일으키는 물질로서, 펩타이드 물질 P(peptide substance P)가 박막 지지체에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서 제공된 박막 지지체의 두께는 몰드의 두께에 따라 조절 가능하며, 특히 3D 프린터를 이용하여 제작된 박막 지지체는 보다 더 두꺼운 두께를 가질 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 제공된 박막 지지체는 0.01 내지 0.5 mm의 두께를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 방법은 성형과 박막 지지체의 제조를 동시에 수행하는 것이 아니라, 박막 지지체를 제조/제공하고, 이에 대해 성형을 수행하는 순서로 수행된다는 것을 하나의 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, “지지체의 성형”은 상기 지지체가 목적하는 패턴을 가질 수 있도록 특정 몰드를 이용하여 성형하는 것을 의미한다.

본 발명의 목적상 바람직한 성형 방법은 박막 지지체에 열, 진공 또는 압력을 가하여 성형하는 방법으로, 그 예로 진공 성형, 가압 성형 혹은 상하부몰드 가압성형을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용매 캐스팅 방법의 경우, 깊이-높이비가 큰 몰드를 이용하는 경우 별도의 분리 방법이 요구되는 반면, 본 발명에 따른 성형 방법을 이용하여 성형하는 경우, 성형용 몰드에 밀착될 가능성이 낮아 분리 효율이 높고 성형 효과가 큰 이점을 가진다. 아울러, 다양한 형태의 박막 지지체를 제조할 수 있는 이점을 또한 가진다.

한편, 본 발명의 박막 지지체의 성형은 밀봉 박막 또는 이형용 박막을 박막 지지체와 함께 성형한 후 밀봉 박막 또는 이형용 박막을 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 상기의 밀봉 박막 또는 이형용 박막을 사용하여 다공성 재질의 생분해성 고분자 박막 지지체를 성형하는 경우, 다공성 구조를 통한 공기 흐름을 차단하여 진공에 의한 성형력을 높일 수 있다.

본 발명에 있어서, “진공 성형”은 성형 가능한 온도 범위로 가열된 박막 소재의 하단에 성형하고자 하는 형상을 가진 성형 몰드를 위치시킨 후 몰드 하단으로 진공을 가하여 박막 지지체로 몰드의 표면 요철을 전이하는 방법이다.

본 발명자는, 이때 지지체가 공기가 잘 통과하여 성형 효과가 충분하지 않은 경우에는 얇은 밀봉 필름을 얹어서 박막 지지체와 함께 성형하고, 밀봉 필름을 제거하는 경우, 성형 효과가 우수한 박막 지지체를 얻을 수 있음을 확인하였다.

한편, 성형 전 히터로 박막형 지지체를 가열할 수 있으나, 히터 가열이 없는 상태에서도 성형 효과가 달성될 수 있다.

본 발명에 있어서, “가압 성형”은 박막 소재의 하단에 성형 몰드를 위치시킨 후 상기 진공 성형과는 반대로 높은 공기 압력을 가하여 성형하는 방법이다.

본 발명에 있어서, “상하부몰드 가압 성형”은 성형하고자 하는 몰드의 음각을 가지는 상부 몰드를 제작하여 상하부를 정밀하게 배열한 상태에서 박막 지지체를 중간에 삽입한 후 가압하여 성형된 지지체를 얻는 방법이다.

상기 성형 방법은 조합하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방법을 통하여 성형된 생분해성 고분자 지지체는 레이저 또는 다른 표준 기계 가공 기술에 의해 그의 요구되는 최종 형태로 성형될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 레이저 성형은 레이저를 사용하여 물질을 제거하는 과정을 의미한다.

본 발명의 성형용 패턴 몰드는 혈관 조직, 신경조직, 림프조직, 근육조직, 점막조직, 각막조직, 심장조직, 간조직의 네트워크 패턴, 혹은 엠보싱 패턴을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 엠보싱 패턴은 부정형 또는 평행한 홈을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 제조된 박막 지지체 상단에 밀봉 박막을 위치시켜 박막 지지체와 함께 진공 성형 또는 가압 성형 방법으로 성형한 후, 밀봉 박막을 제거하여 성형된 박막 지지체를 수득하였다. 다른 방법으로, 제조된 박막 지지체 상단에 이형용 박막을 위치시켜 박막 지지체와 함께 성형한 후, 이형용 박막을 제거하여 성형된 박막 지지체를 수득하였다(실시예 2 및 3).

본 발명의 방법은 상기와 같이 고분자 박막 지지체를 성형한 후 성형된 박막 지지체에 세포를 배양하여 부착시키는 단계를 포함한다.

삭제

본 발명에 있어서, 상기 성형된 박막 지지체에 부착되는 세포는 최종적으로 재생하고자 하는 조직의 종류에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 비제한적인 예로, 상피세포, 뼈세포, 연골세포, 모낭세포, 망막세포, 각막내피세포, 각막상피세포, 혈액 내 전구세포, 각종 암세포, 심장세포, 슈반세포, 갑상선 구성세포, 침샘 구성세포, 췌장도세포, 장점막세포, 혈관내피세포, 중간엽세포, 섬유아세포, 피부세포, 지방세포, 신경세포, 각막세포, 점막세포, 심장근육세포, 근육세포, 간세포 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세포가 있다. 보다 구체적으로, 상기 줄기세포는 신경세포, 림프세포, 혹, 신경, 림프, 혈관 조직으로 분화 가능한 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 줄기세포는 지방줄기세포, 각막줄기세포, 치아유래줄기세포, 소변유래줄기세포, 양수유래줄기세포, 태반유래줄기세포, 탯줄유래 줄기세포, 제대혈줄기세포, 배아줄기세포 및 이에서 분화된 세포, 역분화줄기세포 및 이에서 분화된 세포, 직접 재프로그래밍으로 유도된 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계에서 성형된 박막 지지체에 세포를 부착시키기 위하여 세포 부착 전에 성형된 박막 지지체에 세포 부착 물질을 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “세포 부착 물질”은 세포 부착을 맡는 물질로서, 보다 구체적으로 세포 부착 단백질일 수 있다. 상기 세포 부착 단백질의 예로서, 동물세포를 기질에 부착하는 기능이 있는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 젤라틴 등의 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 세포 부착 활성부위 펩타이드는 RGD(Arg-Gly-Asp), IKVA, YIGSR 또는 상기 펩타이드를 포함하는 단백질이나 펩타이드를 포함할 수 있으며, 비제한적인 예로서, 폴리라이신(polylysine)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포 측의 반응 분자는 인테그린을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 세포 부착 전 성형된 박막 지지체를 코팅하는 단계에서, 성형된 박막 지지체에 상기 세포 부착 물질 이외의 물질을 물리적, 화학적으로 코팅할 수 있다. 예를 들어, 폴리에딜렌 글리콜, 폴리테트라플루오르 에틸렌 등은 공유결합, 이온결합, 반데르발스 결합, 수소결합 또는 정전기력에 의해 코팅될 수 있으며, 상기 물질들은 예시일 뿐 이들 물질에 국한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 세포 부착 전 성형된 박막 지지체를 코팅하는 단계에서, 성형된 박막 지지체에 상기 세포 부착 물질 외에도 성장인자, 세포 움직임 조절 물질 또는 줄기세포의 호밍(homing) 효과를 일으키는 물질을 코팅할 수 있다.

예를 들어, 상기 성장인자로서, 세포 성장을 촉진시킬 수 있는 VEGF(Vascular endothelial cell growth factor), EGF(epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), IGF (insulin growth factor), KGF (keratinocyte growth factor), EPO (erythropoietin), angiopoietin-1, SDF-1 (stromal derivedfactor-1), macrophage inflammatory protein-1, HGF (hepatocyte growth factor), HDGF (hepatoma-derived growth factor), NGF (nerve growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF (transforming growth factor), BMP (bone morphogenic protein) 등을 세포 부착 전 성형된 박막 지지체에 코팅할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성장인자 외에 성장인자의 방출 속도를 조절할 수 있는 헤파린을 성형된 박막 지지체에 코팅할 수 있다.

다른 예로, 세포 움직임 조절 물질로서, 세포의 움직임을 조절할 수 있는 siRNA, shRNA, mRNA 또는 이들을 포함한 마이크로 비드 등을 세포 부착 전 성형된 박막 지지체에 코팅할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 예로, 줄기세포의 호밍(homing) 효과를 일으키는 물질로서, 펩타이드 물질 P(peptide substance P)를 세포 부착 전 성형된 박막 지지체에 코팅할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 성형된 박막 지지체에 피브로넥틴을 코팅한 뒤 상기 코팅된 박막 지지체 위에 세포를 시딩하여, 인큐베이터에서 3 시간 동안 놔두어 성형된 박막 지지체에 세포가 부착되도록 하였다(실시예 4).

본 발명의 세포가 부착된 성형된 박막 지지체는 배양하는 과정을 포함할 수 있다.

상기 성형된 박막 지지체는 일반적인 조직 배양 과정을 거쳐 배양될 수 있으며, 적용되는 세포의 종류에 따라 적절한 배지 혹은 배양환경을 당업자가 적절히 선택하며 조절할 수 있다.

본 발명의 방법은 3 차원 조직재생을 위하여 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 적층된 박막 지지체는 0.01 내지 100 mm의 두께를 형성할 수 있으며, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 mm의 두께를 형성할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 0.2 내지 3mm의 두께를 형성할 수 있으나, 상기 적층된 박막 지지체의 두께는 몰드의 두께에 따라 조절 가능하며, 특히 3D 프린터를 이용하여 제작된 박막 지지체는 보다 더 두꺼운 두께를 가질 수 있을 뿐만 아니라, 박막 지지체의 적층의 수에 제한이 없으므로 상기 두께에 제한되는 것은 아니다.

상기 성형된 박막 지지체를 적층하여 재생된 3차원 “조직”은 심장, 간, 피부, 신경, 각막, 근육 및 혈관 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 요철에 따라 성형된 박막 지지체에 세포가 부착될 수 있으며, 상기 세포가 부착된 수개의 박막 지지체를 적층함으로써 인체 내 조직과 유사한 구조의 3차원 조직을 재생할 수 있음을 확인하였다(실시예 6).

본 발명의 다른 양태로서,

1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;

4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생을 위한 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

상기 각 단계, 그리고 고분자, 박막 지지체의 성형, 세포 부착 및 박막 지지체 적층에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 있어서, “스캐폴드”란 구조 내외에 파종된 세포의 부착, 분화 및 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 증식과 분화에 적합한 환경을 제공하는 역할을 하는 구조물을 의미하는 것으로, 구조체 또는 지지체라고도 불리우며, 조직 재생 공학 분야에서 중요한 기본 요소 중의 하나이다.

본 발명의 성형된 박막 지지체를 적층하는 과정을 통해 3차원 조직을 재생하기 위한 스캐폴드를 제조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 방법으로 제조된 3차원 조직 혹은 스캐폴드를 제공한다.

이에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 3차원 조직재생 방법은 기 제조된 박막 지지체를 필요한 경우 밀봉 박막 또는 이형성 박막과 함께 열, 진공 또는 압력을 가하여 성형함으로써 몰드로부터 성형된 박막 지지체를 분리하는 것이 용이하여 성형 효율 및 성형 효과가 우수하며, 다양한 형태로 박막 지지체를 성형할 수 있는 특징이 있다. 또한, 다공성 재질의 성형이 가능하여 성형된 박막 지지체 적층 시 효율적인 물질 전달이 가능한바, 3차원 조직 형성이 용이하여 인체 조직과 유사한 3차원 조직을 재생할 수 있다.

도 1은 본 발명의 성형된 박막 지지체를 이용한 대표적인 3차원 조직 재생방법을 도식화한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 박막 지지체를 성형하는 방법을 도식화한 것으로, 도 2a는 진공 성형, 도 2b는 가압 성형, 도 2c는 상하부몰드 가압 성형 방법을 도식화한 것이다.
도 3a 및 도 3b는 박막 지지체를 성형하는 데에 사용되는 성형용 몰드 패턴의 예시로서, 도 3a는 혈관 네트워크 패턴으로 소형 또는 미세혈관 네트워크와 유사한 패턴의 도면이고, 도 3b는 엠보싱 패턴으로 단순 기둥의 배열 또는 무늬가 배열된 패턴의 도면이다.
도 4는 박막 지지체의 제조 과정을 단계별로 보여주는 사진이다.
도 5는 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 배양하기 위해 제작된 플로우 챔버의 구조를 도식화한 것이다.
도 6은 혈관내피세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 배양한 뒤 상기 세포가 부착된 모습을 관찰한 사진이다.
도 7a 내지 도 7c는 혈관내피세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 관찰한 사진으로, 도 7b 및 도 7c는 상기 박막 지지체를 3차원으로 관찰한 사진이다.
도 8은 혈관내피세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 3차원으로 관찰한 사진으로, 붉은색 점선은 박막 지지체 성형 시에 사용된 패턴의 모양을 나타낸 것이다.
도 9는 세포가 부착된 수개의 성형된 박막 지지체를 적층하여 3차원 조직을 재생하는 과정을 도식화한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 박막 지지체의 제조

다음과 같은 전기방사의 방법을 이용하여 박막 지지체를 제조하였다. 전기방사 시 열가소성 물질로 PLGA, 폴리카프로락톤(PCL, polycaprolactone) 등도 사용 가능하나, 이하의 방법에서는 PCL을 사용하였다.

먼저, 15 중량%의 폴리카프로락톤(PCL, polycaprolactone)을 80℃의 용매에서 6시간 동안 녹인 후, 시간당 0.5 ml, 18 kV의 직류 전압, 15 cm의 작동 거리의 조건으로 전기 방사하여 콜렉터에 모아 박막 지지체를 수득하였다.

실시예 2. 성형용 패턴이 새겨진 몰드 제작

성형을 위한 패턴 몰드는 SU-8로 제작(MicroFIT, Korea)한 후, 폴리(디메틸실록산)(PDMS, Poly(dimethylsiloxane), Dow corning)을 이용하여 마스터 몰드로 제작하였으며, 이 때 패턴의 높이는 250 μm로 제작되었다. 몰드 제작 시에 도 3a 또는 도 3b와 같은 패턴의 몰드를 제작할 수 있다.

실시예 3. 박막 지지체의 성형

상기 실시예 1에서 수득한 박막 지지체를 진공 성형, 가압 성형 및 상하부몰드 가압성형 방법을 이용하여 성형하였다. 이 때 성형 몰드로는 상기 실시예 2에서 제작된 몰드를 이용하였으며, 각각의 구체적인 성형 방법은 다음과 같다.

<3-1> 진공 성형

도 4와 같이 자체 제작한 시스템 내에서, 상기 실시예 2에서 제작된 몰드를 진공 성형기에 고정시키고, 55℃로 가열된 상기 실시예 1에서 수득한 박막 지지체를 상기 몰드에 얹은 후, 박막 지지체와 몰드 사이에 진공을 가하여 1시간 동안 성형하였다. 이 때 박막 지지체 상단에 밀봉 박막을 위치시켜 박막 지지체와 함께 성형한 후, 밀봉 박막을 제거하여 성형된 박막 지지체를 얻었다. 그 후, SEM을 이용하여 패턴된 표면을 확인하였다. 진공 성형의 방법은 도 2a와 같다.

<3-2> 가압 성형

상기 실시예 2에서 제작된 몰드를 가압 챔버 하단에 놓고, 상기 실시예 1에서 수득한 박막 지지체를 상기 몰드 상단에 얹은 후, 가압 챔버에 공기 압력과 열을 동시에 가하여 55℃의 조건에서 1시간 동안 성형하였으며, 이 때 박막 지지체 상단에 밀봉 박막을 위치시켜 박막 지지체와 함께 성형한 후, 밀봉 박막을 제거하여 성형된 박막 지지체를 얻었다. 가압 성형의 방법은 도 2b와 같다.

<3-3> 상하부몰드 가압성형

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 제작된 몰드의 음각을 가지는 상부 몰드를 제작하고, 상기 실시예 2에서 제작된 몰드를 하부 몰드로 하여 상부 몰드와 하부 몰드 중간에 상기 실시예 1에서 수득한 박막 지지체를 삽입한 후, 가압 챔버에 공기 압력을 가하여 성형하였다. 이 때, 성형된 박막 지지체의 이탈이 용이하도록 이형용 박막을 박막 지지체 상단에 위치시켜 박막 지지체와 함께 성형한 후, 이형용 박막을 제거하여 성형된 박막 지지체를 얻었다. 상하부몰드 가압성형의 방법은 도 2c와 같이 압력과 열을 동시에 가하여 55℃의 조건에서 1시간 동안 성형하였다..

실시예 4. 성형된 박막 지지체에 세포 부착

상기 실시예 3 에서 제조된 성형된 박막 지지체를 이용하여 3차원 조직을 재생하기 위해, 상기 성형된 박막 지지체에 RFP(red fluorescent protein)을 발현하여 있는 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs, human umbilical vein endothelial cells)를 부착하였다. 구체적인 방법은 다음과 같다.

먼저, HUVECs를 1% (v/v)의 안티바이오틱-안티마이코틱(AA)(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)가 첨가된 내피세포 성장 배지(EGMTM-2)(Lonza,MD,USA)를 이용하여 37 ℃, 5%의 CO₂의 인큐베이터 안에서 배양하였다. 그 후, 0.25 중량%의 트립신/EDTA (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 배양 접시에 부착되어 있던 세포를 떼어내고, 2 × 10⁶cells/ml의 농도로 재부유하여, 박막 지지체에 부착시킬 수 있도록 세포를 준비하였다.

또한, 실시예 3에서 성형된 박막 지지체는 소독 과정을 거친 후, 상기 소독된 박막 지지체에 1 μg/cm²농도의 피브로넥틴(Sigma)을 프로토콜대로 코팅하여 세포 부착을 위한 준비를 하였다.

그럼 다음, 상기 코팅된 박막 지지체 위에 상기 준비된 세포 1 × 10⁵개를 배지 50 μl에 시딩한 후, 인큐베이터에서 3 시간 동안 박막 지지체에 세포가 부착될 수 있도록 놔두었다. 이후, 상기 세포가 부착된 박막 지지체를 배지가 2 ml 들어있는 6 웰(well)에 넣었다.

실시예 5. 세포가 부착된 성형된 박막 지지체의 배양

상기 실시예 3에서 제조된 성형된 박막 지지체를 이용하여 3차원 조직을 재생하기 위해, 상기 실시예 4의 과정을 통해 박막 지지체에 부착된 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다.

먼저, 도 5와 같은 플로우 챔버(flow chamber)를 제작하였으며, 상기 플로우 챔버 내부에서 상기 실시예 4에서 제조된 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 배양하였다. 상기 플로우 챔버는 PDMS로 제작되었으며, 주입구와 배출구 모두 14G의 바늘로 구멍을 냈으며, PDMS와 글래스(glass)를 40초간 산소 플라즈마 처리를 하고 난 후, 상기 실시에 4에서 제조된 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 가운데 넣은 후 본딩을 하였다. 이 때, 상기 성형된 박막 지지체를 플로우 챔버에 넣은 후, 하루 동안은 배지를 흘려주지 않고 배양하다가, 다음 날부터 실린지 펌프를 연결하여 1일 당 10 ml의 배지를 흘려주면서 배양하였다.

실시예 6. 세포가 부착된 성형된 박막 지지체의 적층

상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 성형된 박막 지지체를 이용하여 3차원 조직을 재생하기 위해, 다음과 같은 방법으로 상기 성형된 박막 지지체를 적층하였다.

상기 성형된 박막 지지체에 연결되는 플라스틱, 금속, 세라믹 중 하나 이상의 재질을 포함하는 프레임을 고정하여, 지지체를 이동시키거나 세포를 이식할 때 용이하도록 준비를 한 후, 상기 성형된 박막 지지체에 세포 부착 단백질(collagen, laminin, fibronectin 등)을 코팅하였다. 그런 다음, 형성되길 원하는 조직을 구성하는 세포를 상기 준비된 성형된 박막 지지체에 이식하였다. 이식 후, 바로 세포 배지를 공급하지 않고 인큐베이터에서 세포가 성형된 박막 지지체에 부착되도록 2 내지 4시간 정도 기다렸다. 이후, 상기 세포가 이식된 성형된 박막 지지체를 세포 배양용 웰(well) 내의 배지에 첨가한 후, 세포 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포가 부착된 성형 세포 시트의 프레임 및 프레임용 지그를 이용하여 상기 성형된 박막 지지체를 고정한 뒤 적층하였다. 적층 후 만들어진 다층의 3차원 구조물은 펀치를 이용하여 프레임에서 세포 시트만 분리해낸 후, 흐름을 줄 수 있는 배양기 내에 고정 후 배양하거나, 동물실험에 이용할 수 있다.

실험예 : 성형된 박막 지지체 관찰

상기 실시예 3 내지 5에서 제조된 성형된 박막 지지체를 이용한 3차원 조직 재생 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 5의 배양된 성형된 박막 지지체를 팔로이딘 염색(phalloidin staining)을 하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5에서 3일간 배양된 성형된 박막 지지체를 플로우 챔버에서 꺼내어 4 중량%의 PFA에 고정시킨 뒤, 1/40로 희석된 팔로이딘(Alexa Fluor-488)과 1/1000로 희석된 DAPI를 사용하여 염색하였다. 상기 염색된 박막 지지체는 공초점 레이저 주사 현미경(LSM 710, Zeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였으며, 공초점 Z-스택 이미지는 Zen 2012(Zeiss, Germany)를 사용하여 수득하였다.

그 결과 도 6 내지 8에 나타난 바와 같이, 목적하는 성형용 패턴을 가진 3차원 조직이 형성된 것을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

1) 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;
2) 목적하는 성형용 패턴을 가지는 몰드 하에서 상기 고분자 박막 지지체에 열, 진공 혹은 압력을 가하여 박막 지지체를 성형하는 단계;
3) 성형된 박막 지지체에 세포를 배양하여 부착시키는 단계; 및
4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 고분자는 다공성 재질인 것인,
3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서 상기 고분자는 생분해성 고분자인 3차원 조직재생 방법.

제3항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 에스테르, 아미드, 티오에스테르, 카보네이트, 우레탄, 우레아, 아미드, 안하이드라이드, 알지네이트, 히알루론산, 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로오스 메틸 셀룰로오스, 키토산, 실크(silk), 폴리디옥산(Polydioxanone, PDO), 폴리락트산(poly(lactic acid)), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-coglycolic acid), PLGA), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤, PLCL), 폴리안하이드리드(poly(anhydrides)), 폴리오르토에스테르 (polyorthoesters), 폴리비닐알코올(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜 (poly(ethyleneglycol)), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 (poly (N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체 (poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly (ethyleneoxide) copolymer), 및 이들의 공중합체 군으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 고분자 박막 지지체는 10 내지 500㎛의 두께를 가지는, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 몰드는 혈관 네트워크 패턴을 가지거나, 엠보싱 패턴을 가지는, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 박막 지지체의 성형은 진공 성형, 가압 성형 및 상하부몰드 가압 성형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 성형 방법에 의한 것인, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 박막 지지체의 성형은 밀봉 박막 또는 이형용 박막을 박막 지지체와 함께 성형 후 밀봉 박막 또는 이형용 박막을 제거하는 과정을 포함하는 것인,
3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 세포는 혈관 내피 세포, 근육세포, 신경세포, 상피세포, 뼈세포, 연골세포, 모낭세포, 피부세포, 지방줄기세포, 중간엽세포, 섬유아세포, 망막세포, 각막세포, 각막내피세포, 각막상피세포, 각막줄기세포, 혈액 내 전구세포, 각종 암세포, 심장세포, 간세포, 슈반세포, 갑상선 구성세포, 침샘 구성세포, 췌장도세포, 장점막세포, 치아유래줄기세포, 소변유래줄기세포, 양수유래줄기세포, 태반유래줄기세포, 탯줄유래 줄기세포, 제대혈줄기세포, 배아줄기세포 및 이에서 분화된 세포, 역분화줄기세포 및 이에서 분화된 세포, 직접 재프로그래밍으로 유도된 세포, 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 3) 단계에서 세포를 부착시키기 전에 성형된 박막 지지체에 세포부착 물질을 코팅하는 단계를 더 포함하는, 3차원 조직재생 방법.

제10항에 있어서, 상기 세포부착 물질은 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin) 또는 이들의 조합인, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 적층된 성형된 박막 지지체는 0.1 내지 50 mm의 두께를 가지는, 3차원 조직재생 방법.

제1항에 있어서, 상기 조직은 심장, 간, 피부, 신경, 림프, 또는 혈관 조직을 포함한 체내의 손상된 장기 또는 조직인, 3차원 조직재생 방법.

1) 생분해성 고분자 박막 지지체를 제공하는 단계;
2) 목적하는 성형용 패턴을 가지는 몰드 하에서 상기 생분해성 고분자 박막 지지체에 열, 진공 혹은 압력을 가하여 박막 지지체를 성형하는 단계;
3) 성형된 박막 지지체에 세포를 배양하여 부착시키는 단계; 및
4) 목적하는 3차원 조직이 형성될 수 있도록 세포가 부착된 성형된 박막 지지체를 적층하는 단계를 포함하는, 3차원 조직재생을 위한 스캐폴드의 제조방법.