KR20200133098A

KR20200133098A - 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20200133098A
Application number: KR1020190057644A
Authority: KR
Inventors: 김강범; 엄규흠; 이원주; 김종희; 이민수
Original assignee: 덕우전자주식회사
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2020-11-26
Also published as: KR102281502B1

Abstract

세포 독성을 일으키지 않고 접합 품질 또한 향상된 세포 배양 용기가 제공된다.세포 배양 용기는 적어도 하나 이상의 세포 배양 영역과 웰 정의 영역을 포함하는 세포 배양 용기로, 상기 세포 배양 영역은 슬라이드와 슬라이드 위에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지는 나노패터닝된 무독성의 경화층을 포함하고, 상기 웰 정의 영역은 상기 슬라이드와 상기 슬라이드 위에 형성되고 상기 마루 및 골 패턴을 가지는 상기 나노패터닝된 무독성의 경화층과 상기 경화층과 웰을 정의하는 웰 디쉬 사이에 개재되어 상기 경화층과 상기 웰 디쉬를 접합하는 양면 테이프를 포함하고, 상기 웰 정의 영역의 상기 골은 에어 갭으로 채워진다.

Description

세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법{CELL CULTURE CONTAINER, PREPARATION METHOD THEREOF AND METHOD USING THE SAME}

본 기재는 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 세포 독성이 없으면서 배양액 누출이 없고 품질 안정성이 향상된 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.

일반적인 디쉬 또는 웰 플레이트와 같은 세포 배양 용기는 세포가 성장하는 바닥면과 디쉬 또는 웰 플레이트를 정의하는 벽이 일체형으로 주조되어 형성된다.

그러나, 좀 더 세포 배양 환경을 실제 세포 성장 환경과 동일 또는 유사하게 하거나 세포 성장에 적합한 환경을 구현하기 위해서는 세포가 직접적으로 접촉하는 기판의 소재와 형태를 다양하게 형성할 필요가 있다. 따라서, 세포 배양 용기는 세포 배양면을 구비하는 기판과 천공을 구비하는 웰을 접합하는 방식으로 제작되어야 한다.

그런데, 종래에 사용되는 일반적인 접합 방식은 UV 레진 등을 적용하여 접합을 하기 때문에 UV 레진이 세포 배양 영역으로 퍼져서 세포독성을 유발하여 세포의 성장에 영향을 주고, 접합력 또한 견고하지 않아서 배양 용기로서의 품질이 저하되는 경우가 종종 발생한다.

따라서, 세포배양의 다양한 환경을 부여할 수 있으면서 세포 독성을 일으키지 않고 접합 품질이 향상된 세포 배양 용기에 대한 요구가 증대하고 있다.

본 개시는 세포배양에 적합한 환경을 부여하면서 세포 독성을 일으키지 않고 접합 품질 또한 향상된 세포 배양 용기를 제공하고자 하는 것이다.

본 개시는 세포배양에 적합한 환경을 부여하면서 세포 독성을 일으키지 않고 접합 품질 또한 향상된 세포 배양 용기의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 개시는 세포배양에 적합한 환경을 부여하면서 세포 독성을 일으키지 않고 접합 품질 또한 향상된 세포 배양 용기를 사용하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

실시예들에 따른 배양용기는 적어도 하나 이상의 세포 배양 영역과 웰 정의 영역을 포함하는 세포 배양 용기로, 상기 세포 배양 영역은 슬라이드와 슬라이드 위에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층을 포함하고, 상기 웰 정의 영역은 상기 슬라이드와 상기 슬라이드 위에 형성되고 상기 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층과 상기 무독성의 경화층과 웰을 정의하는 웰 디쉬 사이에 개재되어 상기 무독성의 경화층과 상기 웰 디쉬를 접합하는 양면 테이프를 포함하고, 상기 웰 정의 영역의 상기 골은 에어 갭으로 채워진다. .

실시예들에 따른 배양용기의 제조방법은 슬라이드 및 상기 슬라이드 상에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지는 나노패터닝된 경화층을 포함하는 세포 배양 기판을 준비하고, 상기 세포 배양 기판과 웰이 될 천공 영역을 적어도 하나 이상 포함하는 웰 디쉬를 양면 테이프를 사용하여 접합하고, 상기 접합된 결과물을 고압의 오븐에서 고압 압착하여 적어도 하나 이상의 세포 배양 영역과 웰 정의 영역을 포함하는 세포 배양 용기로, 상기 세포 배양 영역은 슬라이드와 슬라이드 위에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층을 포함하고, 상기 웰 정의 영역은 상기 슬라이드와 상기 슬라이드 위에 형성되고 상기 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층과 상기 무독성의 경화층과 웰을 정의하는 웰 디쉬 사이에 개재되어 상기 무독성의 경화층과 상기 웰 디쉬를 접합하는 양면 테이프를 포함하고, 상기 웰 정의 영역의 상기 골은 에어 갭으로 채워진 세포 배양 용기를 완성한다.

실시예들에 따른 배양용기에 따르면 독성이 없으며 누출(leak)의 염려가 없는 양면 테이프로 세포 배양 기판과 웰 디쉬를 접합하기 때문에 세포 독성의 염려가 없다.

또한, 양면 테이프 접합 후에 고압 분위기하에서 압착을 진행하여 기포 프리한 형태로 제조되므로 세포 배양시 세포 배양액 등이 누출되는 염려가 없으므로 세포 배양기의 내구성을 향상시킬 수 있다.

또한, 웰 정의 영역을 나노패터닝된 형태로 형성한 후 고압 분위기에서 압착을 진행할 경우 마루 및 골 패턴으로 이루어진 나노패턴에서 골이 기포의 통로로 작용하여 기포가 쉽게 빠져나가도록 하여서 고압 분위기에서 압착 후 형성된 세포 배양기에서 나노패터닝된 무독성의 경화층과 양면 테이프 사이가 기포 프리 상태가 되게 된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 용기를 제조하기 위한 세포 배양 기판을 제조하는 방법을 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 세포 배양 기판과 멀티 웰 디쉬를 접합하는 공정을 설명하기 위한 개략도이다.
도 3은 24웰 플레이트의 양면 테이프 접합 직후 및 고압 분위기하에서 압착 후에 각각 촬영한 사진을 나타낸다.
도 4는 96웰 플레이트의 양면 테이프 접합 직후 및 고압 분위기하에서 압착 후에 각각 촬영한 사진을 나타낸다.
도 5는 세포 배양 기판(50)의 웰 정의 영역(B)이 마루 및 골 패턴으로 이루어진 나노 패턴을 포함하는 경우와 패턴화되지 않은 경우에 압착에 미치는 영향을 살펴보기 위한 사진들이다.
도 6은 싱글 웰 디쉬의 사진 및 단면도를 나타낸다.

이하 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 실시예들에 대하여 상세히 설명한다. 실시예는 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구체적인 실시예로만 한정되지 않는다.

이하 설명에서 세포 배양 용기는 1536-웰 플레이트, 384-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 현미경용 세포배양 슬라이드 또는 싱글 웰 디쉬(dish)일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 웰 부분과 플레이트 부분을 구비한 모든 세포 배양 용기를 포함한다.

이하 도 1을 참조하여 세포 배양 환경을 실제 세포 성장 환경과 실질적으로 동일 또는 유사하게 할 수 있는 나노 패턴을 포함하는 세포 배양 기판(50)의 제조 공정을 설명한다.

제1단계: PUA 몰드 제조

표준 포토리소그라피(photolithography) 및 드라이 에칭(dry etching)을 통하여 실리콘 마스터 주형(master)(10)을 제조한다. 이어서 폴리 우레탄 아크릴레이트(PUA) 몰드를 제조한다. PUA 전구체를 표준 리소그래피 기술을 사용하여 제조된 실리콘 마스터 상에 적하(drop dispense)한다. 투명 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 필름을 지지 백플레인으로 사용하기 위해 PUA 전구체(20)에 부드럽게 압착한다. PUA전구체(20)는 UV 광에 50 초간 노출시켜 경화시킬 수 있다. 경화 후, 실리콘 마스터(10)의 네거티브형태를 가지며 PET 필름이 부착된 PUA 몰드(25)를 실리콘 마스터(10)로부터 벗기고 추가의 12 시간 동안 UV 광에 노출시켜 경화를 완료시킨다.

제2단계: 세포 배양 기판 제조

세포 배양 기판을 제조하기 위해 글래스 슬라이드(30)를 물 초음파(water sonicator)에서 30 분 동안 이소프로필알코올에 넣고 질소 기류 하에서 건조시킨다. 모세관 힘 리소그래피(Capillary force lithography)를 적용하여 PUA 몰드(25)로부터 이방성 나노패턴된 기판(50)을 제조한다.

구체적으로, 글래스 슬라이드(30)의 중앙에 티오 에스테르 예비 중합체(40)를 적하(drop dispense)하고 PUA 몰드(25)의 패턴이 아래를 향하게 하여 놓는다. 고무 롤러를 사용하여 예비 중합체(40)를 글래스 슬라이드(30)의 표면에 고르게 퍼지게 한다. 그 후, 티오 에스테르 예비 중합체(40)를 UV 광에 60 초 동안 노출시켜 경화층(45)을 형성한다. 경화층(45)으로부터 PUA 몰드(25)를 조심스럽게 벗겨 내어 평행한 마루(ridge) 및 골(groove) 패턴을 가지는 나노패터닝된 기판(50)을 제조하였다. 경화층의 두께는 10 내지 40 ㎛일 수 있다. 티오 에스테르 중합체는 세포 무독성 물질이므로 기존의 다른 경화층 대비 세포 배양의 무독성 환경을 구현할 수 있는 장점이 있다.

마루 및 골 패턴의 크기는 구현하고자 하는 셀 배양 환경에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면,마루 및 골 패턴에서 마루의 폭(width)은 5~1000nm, 마루의 높이(height)(또는 골의 깊이(depth))는 10~1000nm 일 수 있다. 골의 폭(width)은 마루의 폭과 다를 수도 동일할 수도 있다. 더욱 바람직하기로는 마루의 폭은 200~800nm이고 골의 폭 또한 마루의 폭과 동일할 수 있다. 즉, 마루의 폭:골의 폭은 1:1 일 수 있으며, 이 때 마루의 높이는 마루의 폭보다 작을 수 있다. 바람직하기로는 마루의 폭과 상기 골의 폭은 각각 800nm 일 수 있으며, 마루의 높이는 600nm 일 수 있다. 이와 같은 나노패턴의 디멘젼을 가질 경우 근육세포, 특히 심근 세포 등과 같은 세포의 성장에 매우 효과적일 수 있다. 따라서, 배양하고자 하는 세포의 종류에 따라 나노패턴의 디멘젼은 변화될 수 있다.

도 1에서는 경화층(45)이 형성되는 슬라이드로 글래스 슬라이드(30)를 예시하여 설명하였으나, 글래스 슬라이드 대신 PET, PC, 또는 실리콘 재질의 슬라이드가 사용될 수 있다.

이하 도 2를 참조하여 멀티 웰 플레이트의 제조 공정을 설명한다.

제3단계:양면 테이프 부착

마루 및 골 패턴을 가지는 나노패터닝된 세포 배양 기판(50)을 준비한 후, 나노패터닝된 세포 배양 기판(50)과 웰이 될 천공 영역을 포함하는 멀티 웰 디쉬(60)를 양면 테이프(80)을 이용하여 접합한다. 양면 테이프는 종래에 사용되는 UV 레진에 비해 접착력도 좋고 누출(leak)의 문제도 없으므로 세포 독성의 염려도 없게 된다. 양면 테이프는 아크릴계 공중합체로 이루어질 수 있다. 양면 테이프를 세포 배양 기판(50)과 멀티 웰 디쉬(60)의 웰 정의 영역(B) 사이에 놓고 고무 롤러를 사용하여세포 배양 기판(50)과 멀티 웰 디쉬(60)가 잘 접합하도록 한다.

제4단계:고압 분위기로 압착

롤링 방식을 적용하여 세포 배양 기판(50)과 멀티 웰 디쉬(60)를 접합할 경우 접합부에 다수의 기포가 발생한다. 이는 도 3 및 도 4의 양면테이프 접합 직후의 멀티 웰 플레이트의 하면 사진으로부터 명확하게 알 수 있다. 웰 정의 영역(B)에 다수의 기포들이 형성되어 있는 것을 육안으로도 확인할 수 있다. 따라서, 양면테이프에 의해 접합된 멀티 웰 플레이트를 고압의 오븐에 넣고 고압 분위기를 형성하여 순간적인 압착을 진행한다. 고압의 오븐의 압력은 4 내지 16기압일 수 있다. 4 내지 16기압 사이의 기압이 압착에 효과적일 수 있다. 바람직하기로는 고압의 오븐의 압력은 약 14기압 전 후 일 수 있다. 오븐의 온도는 30 내지 80도 일 수 있다. 30 내지 80도 사이의 온도가 압착에 효과적일 수 있다. 고압 분위기하에서의 압착은 5 내지 20분간 진행될 수 있다. 5 내지 20분간의 압착 시간이 압착에 효과적일 수 있다. 고압의 오븐에서 고압 분위기에 의해 의한 압착을 진행한 결과 도 3 및 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 기포가 완전히 제거된 것을 확인할 수 있다.

제5단계:플라즈마 처리

멀티 웰 플레이트의 제조가 완료된 후에는 세포 배양 영역(A)의 나노 패턴의 소수성을 친수성으로 전환시키기 위한 플라즈마 처리를 더 수행할 수 있다. 플라즈마 처리는 산소 플라즈마일 수 있다. 산소 플라즈마 대신 자외선 오존(UVO)을 처리할 수도 있다.

플라즈마 처리시 웰 정의 영역(B)은 양면 테이프(80)와 웰 디쉬(60)에 의해 가려져 있게 된다.따라서, 최종 완성된 멀티 웰 플레이트의 웰 정의 영역(B)의 나노 패터닝된 무독성의 경화층(45)의 표면은 소수성 상태로 남아 있고 세포 배양 영역(A)의 나노 패터닝된 무독성의 경화층(45)의 표면은 친수성을 나타내게 된다.

도 5는 세포 배양 기판(50)의 웰 정의 영역(B)이 마루 및 골 패턴으로 이루어진 나노 패턴을 포함하는 경우와 패턴화되지 않은 경우에 고압 분위기의 압착에 미치는 영향을 살펴보기 위한 사진들이다.

제3 단계에서 설명한 바와 같이 마루 및 골 패턴을 가지는 나노패터닝된 세포 배양 기판(50)을 준비한 후, 나노패터닝된 세포 배양 기판(50)과 웰이 될 천공 영역을 포함하는 멀티 웰 디쉬(60)를 양면 테이프(80)을 이용하여 접합한다. 이어서 제4 단계에서 설명한 바와 같이 고압 분위기로 압착을 진행하면 도 5의 상부(a)와 같이 기포가 완전히 제거된 것을 알 수 있다.

반면 세포 배양 기판으로 웰 정의 영역(B)이 패터닝되지 않은 패턴 없는 일반 글래스 슬라이드를 사용한 후 위에서 설명한 바와 같이 동일하게 제3 단계 및 제4 단계를 진행한 후에 육안으로 관찰하면 도 5의 하부(b)와 같이 여전히 기포가 다수 남아 있음을 알 수 있다.

이는 웰 정의 영역(B)을 나노패터닝된 형태로 형성한 후 고압 분위기에서 압착을 진행할 경우 마루 및 골 패턴으로 이루어진 나노패턴에서 골이 기포의 통로로 작용하여 기포가 쉽게 빠져나가도록 하여서 고압 분위기에서 압착 후 형성된 세포 배양기에서 나노패터닝된 무독성의 경화층과 양면 테이프 사이가 기포 프리 상태가 되기 때문임을 알 수 있다. 그 결과 웰 정의 영역(B)의 마루 및 골 패턴에서 골은 에어 갭으로 채워져 있음을 알 수 있다.

종래의 UV 레진으로 접합하는 경우에는 웰 정의 영역(B)의 나노 패턴을 UV 레진이 채우고 있기 때문에 세포 배양 영역(A)에 채워진 세포 배양액이 나노 패턴과 UV 레진 사이를 타고 웰 정의 영역(B) 쪽으로 쉽게 누출되고 동시에 UV 레진이 세포 배양 영역으로 퍼져서 세포 독성을 유발하는 문제가 있었다.

반면, 본 발명의 실시예에 따르면, 웰 정의 영역(B)의 골이 에어 갭으로 채워져 있고 웰 정의 영역(B)의 나노 패턴은 소수성 상태이기 때문에 소수성 상태의 나노 패턴과 그 사이를 채우는 에어 갭이 서로 협동적으로 그리고 상승적으로(co-operativley and synergistically) 세포 배양액의 누출에 대한 베리어(barrier)로 기능한다. 따라서, 세포 배양 영역(A)에 세포 배양액을 채우더라도 세포 배양액이 웰 정의 영역(B)으로 누출되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.

도 6은 도 1 내지 도 4를 참조하여 설명한 멀티 웰 플레이트와 동일 방식을 적용하여 형성한 싱글 웰 디쉬의 사진 및 이의 단면도를 나타낸다.

멀티 웰 플레이트와 마찬가지로 웰 정의 영역에 양면 테이프를 이용하여 나노패턴과 싱글 웰 디쉬가 접합되며 웰 정의 영역(B)이 기포 프리 상태가 된다.

이와 같이 제조된 세포 배양 용기는 다양한 세포의 배양, 세포의 조직 공학적 용도 등에 다양하게 적용될 수 있다.

상기에서는 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였지만, 권리범위는 이에 의해 한정되는 것이 아니다. 구현되는 형태는 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 권리 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims

적어도 하나 이상의 세포 배양 영역과 웰 정의 영역을 포함하는 세포 배양 용기로,
상기 세포 배양 영역은 슬라이드와 슬라이드 위에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층을 포함하고,
상기 웰 정의 영역은 상기 슬라이드와 상기 슬라이드 위에 형성되고 상기 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층과 상기 무독성의 경화층과 웰을 정의하는 웰 디쉬 사이에 개재되어 상기 무독성의 경화층과 상기 웰 디쉬를 접합하는 양면 테이프를 포함하고, 상기 웰 정의 영역의 상기 골은 에어 갭으로 채워진 세포 배양 용기.
제1항에 있어서,
상기 웰 정의 영역에서 상기 무독성의 경화층과 상기 양면 테이프 사이가 기포 프리 상태인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서,
상기 세포 배양 영역의 상기 나노 패터닝된 무독성의 경화층의 표면은 친수성이고,
상기 웰 정의 영역의 상기 나노 패터닝된 무독성의 경화층의 표면은 소수성인 세포 배양 용기
제1항에 있어서,
상기 마루의 폭:골의 폭의 비율이 1:1 이고, 상기 마루의 높이는 상기 마루의 폭보다 작은 세포 배양 용기.
제1항에 있어서,
상기 마루의 폭과 상기 골의 폭은 각각 800nm이고 상기 마루의 높이는 600nm인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서,
상기 무독성의 경화층은 티오 에스테르 중합체로 이루어진 세포 배양 용기.
슬라이드 및 상기 슬라이드 상에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지는 나노패터닝된 경화층을 포함하는 세포 배양 기판을 준비하고,
상기 세포 배양 기판과 웰이 될 천공 영역을 적어도 하나 이상 포함하는 웰 디쉬를 양면 테이프를 사용하여 접합하고,
상기 접합된 결과물을 고압의 오븐에서 고압 압착하여
적어도 하나 이상의 세포 배양 영역과 웰 정의 영역을 포함하는 세포 배양 용기로,
상기 세포 배양 영역은 슬라이드와 슬라이드 위에 형성되고 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층을 포함하고,
상기 웰 정의 영역은 상기 슬라이드와 상기 슬라이드 위에 형성되고 상기 마루 및 골 패턴을 가지며 나노패터닝된 무독성의 경화층과 상기 무독성의 경화층과 웰을 정의하는 웰 디쉬 사이에 개재되어 상기 무독성의 경화층과 상기 웰 디쉬를 접합하는 양면 테이프를 포함하고, 상기 웰 정의 영역의 상기 골은 에어 갭으로 채워진 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7 항에 있어서,
상기 고압 압착은 4 내지 16 기압 하에서 수행되는 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 고압 압착에 의해 상기 웰 정의 영역에서 상기 무독성의 경화층과 상기 양면 테이프 사이가 기포 프리 상태가 되는 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7 항에 있어서,
상기 고압의 오븐에서 고압 압착 한 후,
상기 세포 배양 용기의 표면에 플라즈마 처리를 수행하여 상기 세포 배양 영역의 상기 나노 패터닝된 무독성의 경화층의 표면은 친수성이고, 상기 웰 정의 영역의 상기 나노 패터닝된 무독성의 경화층의 표면은 소수성이 되도록 하는 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 마루의 폭:골의 폭의 비율이 1:1 이고, 상기 마루의 높이는 상기 마루의 폭보다 작은 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 마루의 폭과 상기 골의 폭은 각각 800nm이고 상기 마루의 높이는 600nm인 세포 배양 용기의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 무독성의 경화층은 티오 에스테르 중합체로 이루어진 세포 배양 용기의 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.