KR20170073337A - 기판의 방수 접합에 의해 얻어지는 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 상기 세포 배양 용기의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기판의 방수 접합에 의해 얻어지는 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 상기 세포 배양 용기의 사용 방법에 관한 것으로, 웰 플레이트에 기능성을 부여하기 위하여 기능성을 가지는 다양한 재료의 바닥(플레이트)을 이루는 기판(제1기판)과 웰을 형성하기 위한 천공을 구비한 기판(제2기판)을 등각 접촉(conformal contact)이 가능하도록 접합시켜 다양한 기능성을 구비한 세포 배양 용기를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 기판의 방수 접합에 의해 얻어지는 세포 배양 용기, 이의 제조 방법 및 상기 세포 배양 용기의 사용 방법에 관한 것이다.
일반적인 세포배양용 웰 플레이트는 측벽과 바닥이 일체로 된 고분자 소재 주조성형물이다. 세포배양 환경의 다양성을 부여하기 위하여 세포가 직접적으로 배양되는 지점인 바닥의 소재를 배양액을 담고 있는 웰부분(천공된 웰)과 달리해야 할 필요가 있다. 이러한 웰 플레이트는 별도로 준비한 바닥과 측벽을 접합하는 형태로 제작되어야만 경제적이다. 이때 접합을 하는데 필수적인 요구사항은 배양액을 100% 밀폐시켜 배양액이 새지않게 하면서 동시에 세포에 독성이 없고 세포의 성장에 영향을 주지 않아야 한다.
현재까지 고분자 소재로는 이와 같은 접합의 요구 조건을 충족시키지 못하고 있다. 따라서, 세포배양의 다양한 환경을 부여할 수 있는 바닥소재와 측벽과의 완벽한 방수 접합 방법 및 이를 이용한 새로운 형태의 기능성 웰 플레이트에 대한 기술이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 기능성 바닥면(플레이트)을 갖는 제1기판과 천공(웰)을 구비한 제2기판의 방수 접합으로 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태는 100 MPa 이하의 탄성계수를 갖는 고무 재질의 제1기판; 및 하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판;을 포함하고, 상기 제1기판이 상기 제2기판과 접합되어 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한, 세포 배양 용기를 제공한다.
본 발명의 제2양태는 100 MPa 이하의 탄성계수를 갖는 고무 재질의 제1기판을 준비하는 제1단계; 하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판을 준비하는 제2단계; 및 상기 제1기판과 제2기판을 접합하여 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한 세포 배양 용기을 얻는 제3단계;를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양 용기의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 상기 제1양태에 따른 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 제4양태는 상기 제1양태에 따른 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포 배양 용기 상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 세포 분석 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 등각 접촉(conformal contact)이 가능하도록 100 MPa 이하의 탄성계수를 갖는 고무 재질의 바닥(플레이트)을 이루는 기판(제1기판)과 웰 측벽을 형성하기 위한 천공을 구비한 기판(제2기판)으로서 상기 제1기판에 비해 더욱 높은 탄성계수를 갖는 기판(제2기판)을 선택하고, 필요에 따라 웰 플레이트에 기능성을 부여하기 위하여 제1기판으로서 다양한 기능성을 가지는 소재를 선택한 후 이들을 등각 접촉 하에 접합시킴으로써 완전한 방수가 가능하고 다양한 기능성을 구비한 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 제공하는 것이 특징이다.
일반적인 웰 플레이트는 세포와 배양액을 담지할 수 있도록 플라스틱 몰딩공정을 통해 우물 모양을 형성하여 제작된다. 최근, 표면의 물리적, 화학적 특성 또는 구조에 의해 세포의 형질전환 및 분화제어가 가능함이 밝혀지면서, 이와 같은 물리적 구조 또는 자극을 통해 세포의 형질전환을 연구하거나 신약개발 등으로 응용이 활발히 되고 있다. 이와 같이 세포에 물리적 구조, 전기적인 자극을 인가하기 위해서는, 이에 적합한 웰 플레이트가 필요하나, 기존의 주조형 플라스틱 공정으로는 원하는 기능성 웰 플레이트의 제작이 불가능하다.
본 발명에서는 주조형 플라스틱 공정으로 제작하는 일체형의 웰 플레이트 대신, 기능성 바닥면(플레이트)을 갖는 제1기판과 천공(웰 측벽)을 구비한 제2기판을 준비하고 이들을 방수 접합하여 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 기능성 세포 배양 용기(웰 플레이트)를 목적하는 바와 같이 방수 접합시키기 위한 방안을 강구한 결과, 본 발명자들은 제1기판으로서 고무 재질의 연성체(elastomer)를 선택하고, 제2기판으로서 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질을 선택함으로써 탄성계수가 작은 고무 재질의 제1기판이, 더욱 큰 탄성계수를 가진, 경질(rigid)의 표면을 가지고 있는 제2기판과 등각 접촉(conformal contact)이 가능하다는 것을 발견하였다. 즉, 바닥면을 형성하는 기판(제1기판)으로서 고무 재질로 이루어진 기판만이 웰의 측벽들을 형성하는 제2기판과 접합이 될 때, 웰 부분의 모폴로지를 그대로 따라가면서 접합되어 배양액이 담지되어도 새어나오지 않도록 할 수 있다. 다시 말해, 이종 소재 간의 접합이 등각 접촉이 되어야만 100% 방수가 가능한 견고한 접합을 이룰 수 있다. 본 발명은 이에 기초한다.
본 발명에서, 실질적인 제1기판과 제2기판 소재 간 접합은 서로 결합 가능한 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자, 예컨대 3-아미노프로필 트리에톡시실란과 3-글리시독시프로필 트리에톡시실란의 SAM(self assembly monolayer)을 매개로 형성할 수 있다. 즉, 탄성계수가 상이한 이종 소재 간 등각 접촉 하에 실란기를 갖는 화합물을 매개로 접합을 수행하여 온전한 방수 접합이 가능하다.
또한, 본 발명의 세포 배양 용기는 바닥면을 이루는 제1기판에 다양한 물리적 및/또는 전기적인 성질이 부여될 수 있고, 이러한 성질을 부여할 수 있는 나노크기 및/또는 마이크로 크기의 재료가 제1기판의 배양면에 해당하는 일면에 형성되도록 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 배양 용기는 제1기판이 가지는 연성 특성으로 인해 기계적인 변형이 가능하고, 이러한 기계적인 변형이 되었을 때 전기적인 신호가 발생하도록 제1기판 내부에 회로가 형성된 형태로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 배양 용기는 제1기판을 투명한 재질로 하여 빛이 투과하도록 구성되고, 빛이 조사되면 전기적인 신호가 발생하도록 제1기판 내부에 회로가 형성된 형태로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 배양 용기는 제1기판 내부에 자기장에 반응하는 물질을 삽입시켜 자기장을 걸어주었을 때 반응을 하도록 구성될 수 있다. 이외에도, 본 명세서에서 구체적으로 예시하지 않은 다양한 물리적 및/또는 전기적인 성질을 부여한 형태로 세포 배양 용기를 제조할 수 있으며, 이에 따라 본 발명은 더욱 다양한 기능성 세포 배양 용기를 설계할 수 있는 잠재적인 가능성을 가진다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 배양 용기는
고무 재질의 제1기판; 및
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판;을 포함하고,
상기 제1기판이 상기 제2기판과 접합되어 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한다.
상기 본 발명에 따른 세포 배양 용기는 하기 단계를 포함하는 제조방법으로 제조될 수 있다.
고무 재질의 제1기판을 준비하는 제1단계;
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판을 준비하는 제2단계; 및
상기 제1기판과 제2기판을 접합하여 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한 세포 배양 용기를 얻는 제3단계.
바람직한 양태로서, 상기 제3단계는 제1기판과 제2기판의 일 면에 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자를 코팅하고, 상기 실레인 작용기를 갖는 고분자를 산소 플라즈마로 개질시킨 후 열처리함으로써 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어, "탄성계수(elastic modulus)"는 고체 역학에서 재료의 강성도(stiffness)를 나타내는 값을 의미하며 영계수(Young's modulus)로도 불린다. 탄성계수(E)는 하기 수학식 1과 같이 응력(σ)과 변형도(ε)의 비율로 정의되며, 재질별로 각각의 고유한 값을 갖는다. 본 발명에서, 탄성계수는 구체적으로 명시되어 있지 않는 한, 측정온도가 상온(25℃)일 때의 값이다.
[수학식 1]
상기 식에서, F는 작용하는 하중, A0은 단면적, Δl는 재료의 길이 변화량, l0은 재료의 원래 길이이고, 단위는 파스칼(Pa)이다.
본 발명에서 사용하는 용어, "제1기판"은 웰의 바닥면을 형성하는 기판을 의미한다. 전술한 바와 같이, 상기 제1기판은 방수 접합을 위하여 연질 소재인 고무 재질로 선택할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1기판은 탄성계수가 0.1 MPa 내지 100 MPa, 예를 들어 1 MPa 내지 100 MPa, 또는 1 MPa 내지 10 MPa일 수 있다. 바람직하기로, 제1기판의 탄성계수는 1 MPa 내지 10 MPa일 수 있다. 일 구현예로서, 상기 제1기판은 실리콘계 고무 재질로 이루어진 것일 수 있다. 일 실시예로서, 폴리디메틸실록세인(polydimethylsiloxanes, PDMS)이 탄성계수가 약 1 MPa 내지 10 MPa 수준으로 매우 낮고 유연하고 접착성이 있어 바람직하다. PDMS는 가교 수준, 베이킹(baking) 온도 및 시간에 따라 탄성계수가 달라질 수 있으며, 예컨대 가교도가 높을수록 탄성계수가 증가하고 가교도가 낮을수록 탄성계수가 낮아진다. 상기 PDMS의 가교 수준은 가교제의 농도로 조절할 수 있다. 따라서, 원하는 탄성계수를 갖는 PDMS를 직접 제조하여 이를 제1기판 소재로서 사용할 수 있다. 또한, 원하는 탄성계수를 갖는 상용 PDMS 기판을 입수하여 제1기판 소재로서 사용할 수도 있다.
또한, 상기 제1기판은 투명한 재질로 이루어질 수 있다. 이와 같이 제1기판이 투명한 재질로 이루어진 경우, 세포 배양 용기의 배양 양상을 바닥면 방향으로도 관찰이 가능하고, 아울러 빛의 조사 하에 세포 분석을 실시하는 경우 유리하다.
본 발명에서는 다양한 기능성이 부여된 세포 배양 용기를 제공하기 위하여, 상기 제1기판이 하기 i) 내지 v) 중 적어도 하나 이상을 특징으로 하는 것인 세포 배양 용기를 제공할 수 있다.
i) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 마이크로 또는 나노 패턴을 구비함;
ii) 도체, 반도체 또는 자성 물질을 추가로 제1기판 내부에 포함하고, 여기에서 상기 도체, 반도체 또는 자성 물질이 제1기판 내부에서 회로를 형성하고 상기 회로의 말단이 웰의 바닥면에 대응되는 표면에 노출됨;
iii) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 정렬된 산화아연 나노로드층과 고무 코팅층이 교번하여 적층되어 피에조일렉트릭(piezoelectrics) 특성을 가짐;
iv) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 형성된 금 나노 입자 및 상기 금 나노 입자 위에서 성장된 산화아연 나노로드를 포함하여 파이로일렉트릭(pyroelectric) 특성을 가짐; 및
v) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 올리고머, 압타머, 유전자, 펩타이드, 단백질, 항체, 산화아연, 그라핀 또는 이의 조합의 코팅층을 포함함.
본 발명에서, 상기 i) 내지 v) 중 적어도 하나 이상의 특징에서 부가되는 물질의 양, 두께 또는 크기가 조절되어 각각의 부여되는 특징이 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예로서, 상기 i) 내지 v) 중 적어도 둘 이상의 특징이 조합되어 어레이(array) 형태로 제작된 세포 배양 용기를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어, "제2기판"은 하나 이상의 천공을 구비하고 있어 상기 제1기판과 접합되어 상기 천공이 웰의 측벽을 형성하는 기판을 의미한다.
본 발명에서, 천공은 원형, 타원형, 사각형, 육각형 등 다양한 단면 형태를 가질 수 있다. 바람직하기로, 천공은 상기 단면 형태가 모든 지점에서 동일한 기둥 형태를 가질 수 있다. 즉, 천공은 제2기판의 일면으로부터 타측의 일면까지 관통된 형태로서 원기둥, 타원기둥, 사각기둥, 육각기둥 등의 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서, 제2기판에 사용가능한, 탄성체 기반이 아닌 고분자 계열의 높은 탄성계수를 갖는 재질로는 폴리스티렌(polystyrene, PS)(3000~3600 MPa), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA)(~3.2 GPa), 폴리우레탄 아크릴레이트(polyurethane acrylate, PUA)(~1.6 GPa) 또는 이의 조합 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1기판과 제2기판은 제1기판과 제2기판의 일 면이 산소 플라즈마로 개질된 후 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자가 코팅되고, 상기 실레인 작용기를 갖는 고분자가 열처리되어 접합될 수 있다.
일 구현예로서 도 1 및 도 2를 참조하면, 원하는 개수의 천공이 뚫려있는 제2기판(1) 하부를 산소 플라즈마로 표면 개질한 후에 실레인 작용기를 갖는 고분자(3)를 처리하고, 마찬가지로 고무 재질의 제1기판(2) 상부를 산소 플라즈마로 표면 개질한 후에 실레인 작용기를 갖는 고분자(4)를 처리해준다. 이렇게 처리한 상태로 위 아래의 실레인 반응기를 열처리를 통해서 결합시켜 방수 접합을 완료함으로써 웰 플레이트 형태의 세포 배양 용기를 얻는다.
구체적으로, 상기 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자는 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리에톡시실란, 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 산소 플라즈마 개질은 산소 플라즈마를 10 내지 100 W로 10초 내지 10분 동안 처리함으로써 수행할 수 있다. 상기 제3단계에서, 열처리는 60 내지 100℃로 수행할 수 있다.
본 발명에서, 세포 배양 용기는 1536-웰 플레이트, 384-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 현미경용 세포배양 슬라이드 또는 배양 접시일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 웰 부분과 플레이트 부분을 구비한 모든 세포 배양 용기를 포함한다.
또한, 본 발명은 전술한 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 전술한 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계; 및
상기 세포 배양 용기 상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 세포 분석 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포 분석 방법은 모폴로지 분석법(morphologic analysis), 효소면역분석법(ELISA), 면역블로팅 분석법(Immunoblotting), 면역형광 분석법(Immumoflorescenece), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staning), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation assay), RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay) 및 보체 고정 분석법(Complement fixation assay)으로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 웰 플레이트에 기능성을 부여하기 위하여 기능성을 가지는 다양한 재료의 웰 바닥(플레이트)을 이루는 기판(제1기판)과 웰 측벽을 형성하기 위한 천공을 구비한 기판(제2기판)을 등각 접촉(conformal contact)이 가능하도록 접합시켜 다양한 기능성을 구비한 세포 배양 용기를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 다양한 물리적 및/또는 전기적인 성질을 부여한 형태로 세포 배양 용기를 제조할 수 있으며, 이에 따라 본 발명은 더욱 다양한 기능성 세포 배양 용기를 설계할 수 있는 잠재적인 가능성을 가진다.
도 1은 본 발명에 따른 고무재질의 기능성 바닥면을 갖는 웰 플레이트를 만드는 방법의 과정을 개략적으로 도시한 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 고무재질의 기능성 바닥면을 갖는 웰 플레이트의 접합 전 단면 구조를 개략적으로 나타낸 개념도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고 자외선 투과 기능성 웰 플레이트의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고 자외선 투과 기능성 웰 플레이트의 파장별 투과도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 다양한 모양의 나노 및 마이크로 구조를 갖는 제1기판의 표면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 다양한 전자기성 제1기판의 표면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 피에조일렉트릭 제1기판의 제조 과정을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 피에조일렉트릭 웰 플레이트의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 피에조일렉트릭 제1기판의 피에조일렉트릭 특성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 파이로일렉트릭 제1기판의 표면의 단면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따른 고무재질의 기능성 바닥면을 갖는 웰 플레이트의 접합 전 단면 구조를 개략적으로 나타낸 개념도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고 자외선 투과 기능성 웰 플레이트의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 고 자외선 투과 기능성 웰 플레이트의 파장별 투과도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 다양한 모양의 나노 및 마이크로 구조를 갖는 제1기판의 표면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 다양한 전자기성 제1기판의 표면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 피에조일렉트릭 제1기판의 제조 과정을 개략적으로 보여주는 개념도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 피에조일렉트릭 웰 플레이트의 모습을 보여주는 사진도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 피에조일렉트릭 제1기판의 피에조일렉트릭 특성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 파이로일렉트릭 제1기판의 표면의 단면 모습을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1: 고 자외선 투과 기능성 웰 플레이트의 제조 및 특성 분석
제1단계: 고무 재질의 고 자외선 투과 기능성 제1기판의 준비
PDMS의 모제와 경화제를 10 : 1의 무게 비율로 잘 교반한 후 가로 12 cm × 세로 12 cm의 사각 페트리 디쉬에 25 mL를 일회용 시린지를 사용하여 부었다. 이를 수평이 맞추어진 바닥에 1일 방치한 후 다시 80℃ 오븐에서 4시간 동안 경화시켰다. 경화된 PDMS의 두께는 대략 2.5 mm이었다. 이를 제2기판에 접합시키기 위하여 세로 7.5 cm × 가로 11 cm의 직사각형으로 재단하였다.
제2단계: 천공을 구비한 제2기판의 준비
폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA)(~3.2 GPa) 소재로 된 천공 프레임을 제2기판으로서 준비하였다.
제3단계: 제1기판 및 제2기판의 접합
상기에서 준비한 제1기판을 산소 플라즈마로 60 W 30 초 표면개질 후 3wt% GPTES((glycidoxypropyl)triethoxysilane) 수용액에 30분 담지 후 DI water로 3번 세정한 후 고순도 질소 블로잉으로 건조하였다.
한편, 상기에서 준비한 제2기판을 산소 플라즈마로 60 W 60 초 표면개질 후 3wt% GPTES 수용액에 30분 담지 후 DI water로 3번 세정한 후 고순도 질소 블로잉으로 건조하였다.
상기와 같이 실란기로 표면개질된 제1기판 및 제2기판을 실란기로 표면개질된 부분이 맞닿도록 접합한 후 75℃ 분위기에 4시간 열처리를 하여 웰 플레이트를 완성하였다. 상기와 같이 완성된 웰 플레이트의 모습을 도 3에 나타내었다.
상기에서 제조된 웰 플레이트의 파장별 투과도를 분석한 결과, 도 4에서 보여지듯이 자외선 영역에서 높은 투과도를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예
2: 마이크로 및/또는 나노 패턴을 갖는 웰 플레이트의 제조 및 특성 분석
제1단계: 고무 재질의 마이크로 및/또는 나노 패턴을 갖는 제1기판의 준비
세포 배양 용기에서 세포 배양 면이 되는 용기의 바닥 부분에 마이크로 및/또는 나노 수준의 다양한 패턴이 형성된 다양한 표면 모폴로지를 구현하기 위하여 포토리소그래피로 제작된 마이크로 및/또는 나노 패턴을 마스터 몰드로 활용하여 마이크로 및/또는 나노 패턴을 갖는 기판을 제조하였다.
먼저, 포토리소그래피로 제작된 마이크로 및/또는 나노 패턴으로 디자인된 마스터 몰드를 가로 12 cm × 세로 12 cm의 사각 페트리 디쉬에 넣고 25 mL PDMS의 모제와 경화제를 10 : 1의 무게 비율로 잘 교반한 후 일회용 시린지를 사용하여 이어서 부었다. 이를 수평이 맞추어진 바닥에 1일 방치한 후 다시 80℃ 오븐에서 4시간 동안 경화시켰다. 몰드로부터 이격시킨 경화된 PDMS의 두께는 대략 2.5 mm이었다. 이를 제2기판에 접합시키기 위하여 세로 7.5 cm × 가로 11 cm의 직사각형으로 재단하였다.
상기와 같이 제작된 제1기판은 천공 부분과 일치하는 바닥의 면은 나노 및 마이크로 구조를 나타내게 된다. 상기의 포토리소그래피법 이 외에도 나노 및 마이크로 입자의 파우더를 러버 위에 놓고 또 다른 러버로 문지르면 주어진 입자는 처음 놓인 러버 위에 조밀 충진된 모노레이어의 필름을 형성한다. 이러한 방식을 이용하여 다양한 모양의 나노 및 마이크로 구조를 형성할 수 있다.
다양한 모양의 나노 및 마이크로 구조를 갖는 제1기판의 표면 모습을 도 5에 나타내었다.
이후 제2단계 및 제3단계는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 기능성 웰 플레이트를 완성하였다.
실시예
3: 전자기성 웰 플레이트의 제조 및 특성 분석
제1단계: 고무 재질의 전자기성 제1기판의 준비
세로 7.5 cm 가로 11 cm의 직사각형보다 큰 면적의 기판 위에 도체 탄소나노튜브, 도체 실버나노와이어, 반도체 실리콘나노와이어, 자성 입자 (산화철, 산화니켈, 산화코발트 등)의 막을 대략 50 nm 스프레이 법을 이용하여 형성한 후 이를 가로 12 cm × 세로 12 cm의 사각 페트리 디쉬에 넣고 25 mL PDMS의 모제와 경화제를 10 : 1의 무게 비율로 잘 교반한 후 일회용 시린지를 사용하여 이어서 부었다. 이를 수평이 맞추어진 바닥에 1일 방치한 후 다시 80℃ 오븐에서 4시간 동안 경화시켰다. 기판으로부터 이격시킨 경화된 PDMS의 대략 두께는 2.5 mm이었다. 이를 well plate에 접합시키기 위하여 세로 7.5 cm 가로 11 cm의 직사각형으로 제단하였다. 이때 바닥의 면은 전자기성을 띤 기능성 면이 되므로 추후 천공이 된 플레이트와 접합해야하는 면이 된다.
또한 이러한 러버 내부에 도선(은 및 금)을 배치하고 웨플레이트 홀 바닥에 노출된 전극의 터미널을 형성하여 웰 플레이트 홀 각각의 위치에 전기적 자극을 줄 수 있고 또한 각 위치에서 나오는 전기적 시그날을 모니터링 할 수 있는 회로를 디자인 할 수 있었다.
다양한 전자기성 제1기판의 표면 모습을 도 6에 나타내었다.
이후 제2단계 및 제3단계는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 기능성 웰 플레이트를 완성하였다.
실시예
4:
피에조일렉트릭
웰 플레이트의 제조 및 특성 분석
제1단계: 고무 재질의
피에조일렉트릭
제1기판의 준비
피에조일렉트릭은 기계적인 힘을 전기적인 힘으로 바꿀 수 있는 특성을 의미한다. 본 실시예에서는 도 7과 같은 과정으로 피에조일렉트릭 제1기판을 제조하였다.
먼저 상기 실시예 1과 같은 방법으로 두께 2.5 mm의 PDMS(10:1) 세로 7.5 cm × 가로 11 cm의 직사각형 기판을 준비하였다. 미술용 브러쉬에 피에조일렉트릭 물질인 산화아연 나노로드(길이 3~10 ㎛, 지름 200 ~ 300 nm) 파우더를 묻힌 후 준비된 PDMS 기판에 발랐다. 투명한 기판이 균일한 반투명 상태가 될 때까지 산화아연 나노로드를 고르게 도포하였다. 도포 후 드라이 에어 브로잉을 통해 잔여 파우더를 제거하였다. 이와 같은 과정을 통해 산화아연 나노로드는 모노레이어로 PDMS 기판 위에 정렬되었다. 이와 같이 정렬된 산화아연 나노로드는 이후 PDMS 기판에 기계적 변형이 주어지게 되었을 때 벤딩 변형을 받게 되고 결과적으로 나노로드의 각각의 벤딩 면에 전위차를 발생시키게 되어 결과적으로 기판 표면 전체에 전기적 힘을 나타내게 하는 역할을 한다. 최종적으로 별로도 준비한 PDMS(10:1)를 노말 헥산 유기용매에 무게 비율로 50 % 희석한 용액을 산화아연 나노로드가 모노레이어로 정렬된 PDMS 기판 위에 2000 rpm으로 30초간 코팅한 후 90℃에서 30분간 열처리하여 제1기판 준비를 완료하였다.
이후 제2단계 및 제3단계는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 기능성 웰 플레이트를 완성하였다.
상기 제조된 피에조일렉트릭 웰 플레이트의 모습을 도 8에 나타내었다.
또한, 상기 제조된 피에조일렉트릭 제1기판의 피에조일렉트릭 특성을 분석한 결과 도 9와 같이 제1기판의 기계적인 변형으로 인해 전기적 특성이 발휘됨을 확인할 수 있다.
실시예
5:
파이로일렉트릭
웰 플레이트의 제조 및 특성 분석
제1단계: 고무 재질의
파이로일렉트릭
제1기판의 준비
파이로일렉트릭은 열 쇼크를 전기적인 힘으로 바꿀 수 있는 특성을 의미한다. 파이로일렉트릭 제1기판을 제조하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1과 같은 방법으로 두께 2.5 mm의 PDMS(10:1) 세로 7.5 cm × 가로 11 cm의 직사각형 기판을 준비하였다. 2 nm ~ 8 nm의 입자 크기를 갖는 골드를 플라즈마 표면처리가 된 준비된 PDMS 기판 위에 열증발법장치를 이용하여 코팅하였다. 이 과정을 통해 골드 나노 입자가 20 nm ~ 100 nm의 입자 크기로 PDMS 기판 위에 형성되었다. 골드 입자의 최종 입자 크기에 따라 가시광선의 국부 표면 프라즈모닉 공명 파장을 조절할 수 있다.
그 다음, 상기 골드 나노 입자를 씨앗으로 하여 산화아연 나노로드를 용액 공정을 이용하여 성장시켰다. Zinc nitrate hexahydrate 5 g을 500 mL의 초순수 물에 녹인 후 30% 암모니아수 25 mL을 추가로 넣은 후 위에서 준비한 골드 씨앗이 코팅된 PDMS을 장입한 후 90℃에서 1 ~ 2시간 동안 성장시켰다. 이렇게 하여 각각의 골드 씨앗을 중심으로 수직 성장된 산화아연 나노로드가 길이 1 ~ 3 ㎛, 지름 200 nm으로 형성되었다.
외부로부터 골드 나노 입자와 국부 표면 프라즈모닉 공명이 되는 파장의 집속된 광원(레이저 혹은 전력 LED)이 펄스 형태로 조사될 경우, 골드는 순간적으로 가열이되었다 냉각이 되었다. 이러한 열 충격은 산화아연 나노로드의 하부의 격자 변형을 유발시키게 된다. 이러한 순간적 격자 변형은 피에조일렉트릭 효과로 이어져 산화아연 나노로드의 길이방향의 전위를 발생시켰다. 결과적으로 기판 전체표면에 전기적 힘을 발생시킬 수 있었다.
최종적으로 별로도 준비한 PDMS(10:1)를 노말 헥산 유기용매에 무게 비율로 50 % 희석한 용액을 산화아연 나노로드가 수직으로 성장된 PDMS 기판 위에 2000 rpm으로 30초간 코팅한 후 90℃에서 30분간 열처리하여 기판 준비를 완료하였다.
상기 제조된 파이로일렉트릭 제1기판의 표면의 단면 모습을 도 10에 나타내었다.
이후 제2단계 및 제3단계는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 기능성 웰 플레이트를 완성하였다.
Claims (18)
100 MPa 이하의 탄성계수를 갖는 고무 재질의 제1기판; 및
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판;을 포함하고,
상기 제1기판이 상기 제2기판과 접합되어 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한, 세포 배양 용기.
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판;을 포함하고,
상기 제1기판이 상기 제2기판과 접합되어 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한, 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 제1기판은 탄성계수가 0.1 MPa 내지 100 MPa인 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 제1기판은 실리콘계 고무 재질로 이루어진 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 제1기판은 투명한 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 제1기판은 하기 i) 내지 v) 중 적어도 하나 이상을 특징으로 하는 것인, 세포 배양 용기:
i) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 마이크로 또는 나노 패턴을 구비함;
ii) 도체, 반도체 또는 자성 물질을 추가로 제1기판 내부에 포함하고, 여기에서 상기 도체, 반도체 또는 자성 물질이 제1기판 내부에서 회로를 형성하고 상기 회로의 말단이 웰의 바닥면에 대응되는 표면에 노출됨;
iii) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 정렬된 산화아연 나노로드층과 고무 코팅층이 교번하여 적층되어 피에조일렉트릭(piezoelectrics) 특성을 가짐;
iv) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 형성된 금 나노 입자 및 상기 금 나노 입자 위에서 성장된 산화아연 나노로드를 포함하여 파이로일렉트릭(pyroelectric) 특성을 가짐; 및
v) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 올리고머, 압타머, 유전자, 펩타이드, 단백질, 항체, 산화아연, 그라핀 또는 이의 조합의 코팅층을 포함함.
i) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 마이크로 또는 나노 패턴을 구비함;
ii) 도체, 반도체 또는 자성 물질을 추가로 제1기판 내부에 포함하고, 여기에서 상기 도체, 반도체 또는 자성 물질이 제1기판 내부에서 회로를 형성하고 상기 회로의 말단이 웰의 바닥면에 대응되는 표면에 노출됨;
iii) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 정렬된 산화아연 나노로드층과 고무 코팅층이 교번하여 적층되어 피에조일렉트릭(piezoelectrics) 특성을 가짐;
iv) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 형성된 금 나노 입자 및 상기 금 나노 입자 위에서 성장된 산화아연 나노로드를 포함하여 파이로일렉트릭(pyroelectric) 특성을 가짐; 및
v) 웰의 바닥면에 대응되는 제1기판의 표면에 올리고머, 압타머, 유전자, 펩타이드, 단백질, 항체, 산화아연, 그라핀 또는 이의 조합의 코팅층을 포함함.
제5항에 있어서, 상기 i) 내지 v) 중 적어도 하나 이상의 특징에서 부가되는 물질의 양, 두께 또는 크기가 조절되어 각각의 부여되는 특징이 조절되는 것인, 세포 배양 용기.
제5항에 있어서, 상기 i) 내지 v) 중 적어도 둘 이상의 특징이 조합되어 어레이(array) 형태로 제작된 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 제2기판은 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄 아크릴레이트 또는 이의 조합을 포함하는 고분자 재질인 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 제1기판과 제2기판은 제1기판과 제2기판의 일 면에 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자가 코팅되고, 열처리되어 접합된 것이 특징인 세포 배양 용기.
제1항에 있어서, 1536-웰 플레이트, 384-웰 플레이트, 96-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 현미경용 세포배양 슬라이드 또는 배양 접시인 것이 특징인 세포 배양 용기.
100 MPa 이하의 탄성계수를 갖는 고무 재질의 제1기판을 준비하는 제1단계;
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판을 준비하는 제2단계; 및
상기 제1기판과 제2기판을 접합하여 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한 세포 배양 용기를 얻는 제3단계;를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양 용기의 제조방법.
하나 이상의 천공을 구비하고, 상기 제1기판의 탄성계수보다 더욱 큰 탄성계수를 갖는 고분자 재질의 제2기판을 준비하는 제2단계; 및
상기 제1기판과 제2기판을 접합하여 상기 제1기판이 웰의 바닥면을 형성하고 상기 제2기판의 천공이 웰의 측벽을 형성한 세포 배양 용기를 얻는 제3단계;를 포함하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양 용기의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 제3단계는 제1기판과 제2기판의 일 면에 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자를 코팅하고, 열처리함으로써 수행하는 것이 특징인 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 실레인(silane) 작용기를 갖는 고분자는 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 3-글리시독시프로필 트리에톡시실란, 또는 이의 조합인 것이 특징인 제조방법.
제12항에 있어서, 고분자 코팅을 위해 제1기판과 제2기판의 일 면에 산소 플라즈마 개질을 수행하는 것이 특징인 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 열처리는 60 내지 100℃로 수행하는 것이 특징인 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 세포 배양 용기에서 세포를 배양하는 단계; 및
상기 세포 배양 용기 상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 세포 분석 방법.
상기 세포 배양 용기 상의 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 세포 분석 방법.
제17항에 있어서, 상기 세포 분석 방법은 모폴로지 분석법(morphologic analysis), 효소면역분석법(ELISA), 면역블로팅 분석법(Immunoblotting), 면역형광 분석법(Immumoflorescenece), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staning), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation assay), RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay) 및 보체 고정 분석법(Complement fixation assay)으로 구성된 군에서 선택된 것인 세포 분석 방법.
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KR20200095420A (ko) * | 2019-01-31 | 2020-08-10 | 고려대학교 산학협력단 | 웰 플레이트 기반의 키트 제조방법 및 이를 통해 제조된 키트 |
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