CN110305253A - 氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络的医用复合型均相支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种医用支架，特别涉及一种氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络的医用复合型均相支架材料及其制备方法，属于医学组织工程技术领域。本发明以天然海藻酸盐作为主要研究对象，复合聚丙烯酰胺、羟基磷灰石和明胶等生物活性物质，采用互穿网络、均相交联、部分氧化、表面修饰和生物活性生长因子控释相结合的方法解决海藻酸盐在组织工程应用上存在的力学性能差、在人体内难以降解、缺乏细胞特异性结合位点等缺陷问题。

Description

氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络的医用复合型均相支架 及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种医用支架，特别涉及一种氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络的医用复合型均相支架材料及其制备方法，属于医学组织工程技术领域。
背景技术
海藻酸盐具有优异的生物相容性、生物降解性、无免疫原性、可塑性和包封性且价格低廉和来源广泛而备受关注。海藻酸盐在相对温和的pH值和温度条件下即可与二价钙离子发生交联，所形成的海藻酸钙水凝胶对细胞起到包覆和保护作用，而且其呈现开放的网状结构，可促进细胞营养和代谢物质的交换。研究结果证实人类脂肪干细胞、人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞均可在海藻酸钙水凝胶中成活并形成细胞外基质，为海藻酸凝胶作为组织工程基质材料的研究提供了依据。
理想的组织工程支架材料除了拥有良好的生物相容性、生物降解性和多孔性外，还需具有一定的表面活性以促进细胞的粘附、增殖和分化，具备足够的机械强度以确保支架材料的机械完整性，需要合适的降解速率来匹配骨组织的重生。然而由单一的海藻酸盐通过交联制备的支架材料，很难同时满足理想支架材料所有的性能要求。尤其是使用海藻酸盐这类天然高分子材料制造出质地均匀且结构规整的组织工程支架仍然是当前构建支架材料的一个难点。由于海藻酸盐亲水性太强，在组织工程支架材料的开发过程中不得不面临其自身的缺陷，概括起来可以总结为如下三点：(1)海藻酸盐凝胶易脆，力学性能差，其凝胶结构在生理盐水中容易遭受破坏；(2)海藻酸盐在人体内几乎不降解，支架材料的降解产物相对分子质量高于肾脏清除阈值，很难从体内排出；(3)海藻酸盐较强的亲水性导致其缺乏哺乳动物细胞特异性结合位点，致使细胞粘附性弱。因此，只有采取切实可行的技术方案解决这些关键基础研究问题，才能真正为海藻酸盐凝胶支架材料的应用开发扫清障碍。
发明内容
对海藻酸盐在组织工程应用上存在的力学性能差、在人体内难以降解、缺乏细胞特异性结合位点等缺陷问题，本发明提供一种氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络的医用复合型均相支架材料。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种医用复合型均相支架材料的制备方法，工艺流程示意图见图1，该方法包括如下步骤：
(1)通过控制氧化剂的化学计量比，以高碘酸钠将海藻酸钠(SA)部分单体上的连二羟基结构氧化为连二醛基，其反应式为：
制备氧化度为 10％～35％的部分氧化海藻酸衍生物(OSA)；
(2)制备负载生长因子的OSA溶液，向该OSA溶液中加入丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺混合均匀，作为溶液A，再加入内源交联剂组分，超声搅拌下混合均匀，最后加入葡萄糖酸内酯(GDL)引发离子交联，搅拌后将混合液迅速转入多孔组织培养板中，密封，使交联反应充分；
内源交联剂组分选自羟基磷灰石(HAP)、Ca3(PO4)2、CaSO4中的一种；内源交联剂组分和GDL构成海藻酸盐的内源交联体系；
(3)上一步形成的复合凝胶清洗后进行冷冻干燥，将干燥后的复合凝胶浸入A型明胶(GT)溶液中，孵化30～60min后取出，去离子水中浸泡并反复冲洗，最后将清洗干净的复合凝胶投入共价交联剂溶液中，孵育过夜，取出，超纯水反复清洗，之后的产物经冷冻干燥得到氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络的医用复合型均相支架材料。
上述冷冻干燥的条件一般是：样品先在冰箱中于-18℃下预冻30min，后转入冷阱中于-50～60℃下冷冻5～6小时。
作为组织工程支架材料，其所具备的首要因素是能够为细胞的粘附、增殖和分化提供机械支撑，同时满足各种受损组织的应力要求。由于单一的海藻酸盐凝胶易脆，力学性能差，为了使其满足理想支架材料的应用要求，学者们通常通过合适的方式将海藻酸盐与其它材料结合在一起制备复合材料的方法来提高海藻酸盐凝胶支架的机械性能。它不仅消除了单种材料的缺陷，而且赋予了材料许多独特而优异的理化性能和生物活性。在制备复合凝胶材料的各种方法中，通常互穿网络聚合物体系被认为是赋予凝胶材料高强度机械性能的最有效方法之一。互穿网络技术是指由两种或多种相互贯穿的交联聚合物组成共混物方法。其特点是通过化学交联进行强迫互容，使聚合物分子链之间相互缠结，并形成相互贯穿的聚合物网络。互穿网络结构可以显著改善聚合物共混体系的分散性、界面亲和性和相稳定性，实现不同聚合物之间的性能互补，提高聚合物材料的综合性能。IPN基于其独特的分子链拓扑结构，能够显著提高共混聚合物材料的力学特性，成为聚合物改性的研究热点之一。Nature上有报道称海藻酸钙/聚丙烯酰胺水凝胶具有优异的力学性能。在含水量高达90％时，海藻酸钙/聚丙烯酰胺水凝胶仍能拉伸至原长度的20倍，断裂能高达9000J·m-2。该水凝胶具有如此优异的机械性能是由于其含有两种类型的网络结构，离子交联的海藻酸钙网络和共价交联的聚丙烯酰胺网络。非共价的海藻酸钙网络受力破坏后，能够在一定的条件下再结合，实现复合凝胶结构和性能的回复，使其机械性能增强。除了优异的机械性能，海藻酸钙/聚丙烯酰胺水凝胶也具有良好的生物相容性，这促使人们进一步加深对于海藻酸钙/聚丙烯酰胺水凝胶的研究。
另外，海藻酸盐的离子交联方式也是影响支架材料结构和形貌及其机械性能的主要因素之一。通常采用的钙离子外源交联主要依靠钙离子的渗透进行交联，易造成交联不均匀，支架变形等缺陷。而有研究报道，海藻酸盐通过内源交联制备的均匀凝胶可以有效提高支架材料的机械强度和机械完整性。海藻酸盐的内源交联是指预先将钙的难溶盐与海藻酸盐溶液混合均匀，再通过葡萄糖酸内酯(GDL)降低溶液pH，使Ca2+缓慢释放出来从而引发的均匀交联。
尽管海藻酸盐在人体内几乎不降解，但是以高碘酸钠、高锰酸钾和过氧化物等氧化剂氧化得到的部分氧化海藻酸盐可有望改善海藻酸盐在人体内的降解性，且保留其凝胶性。特别是高碘酸钠氧化得到的醛基海藻酸盐，其降解产物的分子量会大大减小，降解速率能得到较大的提高。采用部分氧化的醛基海藻酸盐与丙烯酰胺构建互穿网络凝胶支架，除了离子交联的海藻酸钙网络和共价交联的聚丙烯酰胺网络，部分氧化海藻酸盐上的醛基基团与聚丙烯酰胺上的胺基基团可通过席夫碱桥联形成第三重网络，可进一步提升复合凝胶支架材料的机械性能。
近年来，模仿天然组织的成分及结构特征，运用仿生学原理将多肽、生长因子、基因等特定分子识别信号固定在材料表面和结构中，对其进行分子设计和生化处理，研制成具有特定结构和功能的仿生组织工程支架材料是当前组织工程学研究的前沿课题。海藻酸盐本身缺乏各种生物活性分子，无法与细胞发生相互作用。但是，海藻酸盐是一种聚阴离子电解质，可以与聚阳离子电解质通过静电相互作用形成聚电解质复合凝胶。采用生物大分子间的静电作用力，以一种可控的方式修饰材料表面是本发明构建复合支架材料的关键技术。由于海藻酸盐与A型明胶之间带有相反电荷，它们能够形成聚电解质复合物。并且部分氧化海藻酸盐醛基官能团的存在，加固了明胶分子在支架表面的覆积。明胶分子链中含有的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)多肽序列是细胞及其细胞外基质相互识别的特异性蛋白，它可以调节细胞的粘附力和生理活性。同时将一些具有生物活性的生长因子(如TGF-β、BMP和VEGF)掺入海藻酸盐凝胶基体中，通过活性生长因子的控制释放，可调节细胞的分化行为。活性生物生长因子可以发挥识别和诱导新生细胞和组织生长的能力，利于形成细胞外基质材料，从而达到修复组织的目的。这种从结构和性能上分析和解决海藻酸盐在组织工程应用上的功能性缺陷问题，以从根本上提高海藻酸盐医用复合型均相支架材料的临床应用性，目前报道甚少。
本发明从仿生学结构和性能上分析和解决海藻酸盐在组织工程应用上的功能性缺陷问题，通过高碘酸钠部分氧化的方法改善海藻酸盐在生理条件下的降解性能，采用与聚丙烯酰胺构建的互穿网络结构提高海藻酸盐凝胶的机械性能，采用明胶分子在支架材料表面覆积的方法增强细胞在海藻酸盐支架材料上的粘附性能，在均相交联和物理共混的辅助作用下制备了适用于临床研究的组织工程支架材料。其中，在以内源交联体系制备海藻酸盐均相凝胶均相凝胶过程中，通过交联密度的调控来实现对支架材料微观孔结构的控制。本发明所述的支架材料，呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，在以共价交联网络和离子交联网络复合的方法构建高强韧互穿网络凝胶过程中，通过改变两种交联网络的比例可以实现对支架材料机械性能的调控，可以满足不同组织修复的应力要求。
本发明制得的氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络的医用复合型均相支架，具有以下三个特点：(1)复合支架材料能加工成三维结构，且具有可调控的机械强度；(2)复合支架材料的微孔结构可为组织细胞提供足够的外再生空间，利于组织细胞的渗透生长； (3)通过调控互穿网络组分比例可以实现复合支架的降解速率与组织细胞再生速度相匹配。因此能够应用于软骨组织和肌肉组织的修复中。
作为优选，步骤(1)具体过程是：海藻酸钠(SA)用适量水溶解后与无水乙醇、高碘酸钠混合，避光充分搅拌，得到反应液，反应液中海藻酸钠浓度是0.5～2.5％；向反应液中加适量乙二醇避光磁力搅拌以终止反应；用氯化钠和无水乙醇沉淀终止反应后的溶液；
将所得沉淀溶解在蒸馏水中，以氯化钠和无水乙醇沉淀该溶液；如此重复沉淀3次后，将最终所得溶液装入截留分子量为3500的透析袋中透析，经冷冻干燥得到部分氧化海藻酸衍生物(OSA)；
所述氯化钠和无水乙醇的比例为1g：150～200mL。
作为优选，所述SA的质均分子量Mw≥150000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5。
作为优选，步骤(2)中所述海藻酸盐的内源交联体系包含HAP/GDL、Ca3(PO4)2/GDL和CaSO4/GDL体系，各内源交联体系中两组分的摩尔比分别为1:10、1:3和1:2，内源交联体系中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.09～0.36。
作为优选，步骤(2)中所述交联反应过程是先在4～10℃条件下交联反应3～5小时，后放置于恒温箱中在60～80℃条件下交联反应4～8小时。
作为优选，步骤(2)中的生长因子选自TGF-β、BMP或VEGF；负载生长因子的 OSA溶液中，OSA的质量分数为1.0％～3.0％，生长因子的质量分数为0.01％～0.1％。
作为优选，步骤(3)中A型明胶(GT)溶液的质量浓度为0.5％～2.0％。
作为优选，所述丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺在溶液A中的质量分数分别为0.5％～4.0％、0.005％～0.04％、0.0035％～0.028和 0.006％～0.05％。
作为优选，步骤(3)所述共价交联剂选自EDC/NHS混合交联剂、京尼平或戊二醛。一般情况下，EDC/NHS混合交联剂中两者构成为10mmol/L/10mmol/L，采用2wt％浓度的京尼平溶液，或是2.5wt％浓度的戊二醛。
一种所述的制备方法得到的氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络的医用复合型均相支架材料。
本发明以天然海藻酸盐作为主要研究对象，复合聚丙烯酰胺、羟基磷灰石和明胶等生物活性物质，采用互穿网络、均相交联、部分氧化、表面修饰和生物活性生长因子控释相结合的方法解决海藻酸盐在组织工程应用上存在的力学性能差、在人体内难以降解、缺乏细胞特异性结合位点等缺陷问题。本发明的有益效果是：
(1)通过高碘酸钠部分氧化海藻酸盐，既保留了海藻酸盐的凝胶性又改善了其在生理盐水中的降解性能，可以通过调控海藻酸盐的氧化度实现支架材料降解速率与组织细胞再生速率的匹配；
(2)采用内源交联体系制备氧化海藻酸盐均相凝胶，通过交联密度的调控可以实现对支架材料微观孔结构的控制。使氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔径大小在150～300μm之间，孔隙率不低于75％；
(3)结合互穿网络中氧化海藻酸盐的离子交联和聚丙烯酰胺的共价交联构建的氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架材料，通过改变两种交联网络的比例可以实现对支架材料机械性能的调控，可以满足不同组织(软骨组织和肌肉组织)修复的应力要求；
(4)在互穿网络结构的基础上，通过静电作用和席夫碱键合作用将带有RGD多肽序列的明胶分子覆积于支架材料表面，能够提高细胞对支架材料的亲和力，增强细胞的粘附和增殖活力。细胞在氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架材料表面的粘附密度不小于1000个/cm2，存活率不低于90％。
此外，本发明的制备工艺操作简单、成本低廉，所制备的氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架材料可应用于软骨组织和肌肉组织的临床研究。
附图说明
图1为氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络医用复合型均相支架材料的工艺流程示意图；
图2为氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架材料的实物图和剖切面扫描电镜图；
图3为不同离子交联和共价交联网络比例条件下氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架的抗压强度比较图，图中a至f表示OSA/PAAM的比值分别为 0.25、1.0、2.0、3.0、4.5和6.0；
图4为MG63细胞在OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架上培养2天后的扫描电镜图；
图5为MG63细胞在海藻酸盐凝胶支架上分别培养2天和5天后的细胞增殖情况。 *代表P<0.05，表示有显著性差异，图中control为空白对照组，a至f表示OSA/PAAM 的比值分别为0.25、1.0、2.0、3.0、4.5和6.0条件下氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架的增殖情况；
图6为MG63细胞在海藻酸盐凝胶支架上培养7天后的细胞分化情况。*代表P<0.05，表示有显著性差异，图中control为空白对照组，a至f表示OSA/PAAM的比值分别为0.25、1.0、2.0、3.0、4.5和6.0条件下氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架的分化情况。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
显微结构分析
所述的OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料经刀片切割和喷金处理后，即可在扫描电镜(SEM)下观察复合凝胶支架的孔隙结构形貌。实物图和剖切面扫描电镜图结果见图2，从图2中可以看出，该凝胶材料棱角清晰，结构规整，具有较好的3D 形态架构和孔隙结构。
孔隙率测试
采用液体置换的方法对OSA/PAAM互穿网络的医用复合型均相支架材料的孔隙率进行测试。首先将支架材料浸入无水乙醇中，待其吸附饱和后取出，用滤纸轻轻擦拭材料表面溢出的无水乙醇。然后分别称量支架材料在浸入无水乙醇前后的重量，记为 W1和W2。最后依据下列公式计算支架材料的孔隙率(P)。
式中ρ0为无水乙醇密度，V为凝胶支架在浸入无水乙醇前的体积。每组样品做3组平行测试，取其平均值。
抗压强度测试
通过微机控制电子万能材料试验机(CTM8050，协强仪器制造(上海)有限公司)测试复合凝胶支架材料的抗压强度。测试时，垂直于样品表面纵向压缩，压缩速率为5 mm/min，当材料压碎或其应变大于60％时停止。图中a至f表示OSA/PAAM的比值分别为0.25、1.0、2.0、3.0、4.5和6.0，结果见图3。
由图3可知，随着聚丙烯酰胺(PAAM)共价交联网络含量逐步升高(由a至f)， OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架的抗压强度展现出指数增长的趋势。这主要归因于IPN凝胶的形成，以及SA与PAAM之间的相互作用力。同时，PAAM的填充作用使OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架的孔隙减小、孔壁增厚，导致其应力支撑和应力转移能力的增强，使OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架的机械性能增强。
生物降解率测试
所述的OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料，以磷酸缓冲液(PBS)包含10000U/mL的溶菌酶来模拟生理环境，在2周的时间内考查其在模拟生理环境下的生物降解率。
生物相容性试验
采用人骨瘤细胞(MG63)作为模型细胞，来评价OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的生物相容性。其细胞培养液为90％DMEM，另外各自补加10％胎牛血清、 100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。应用于细胞培养的OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料，使用钴60射线灭菌，照射强度为8kGy。OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料在接种细胞前先在细胞培养基中浸泡12小时以上。将复苏的细胞在聚苯乙烯细胞培养皿中传2代后采用胰蛋白酶消化并收集。细胞经计数后以每孔 5×104的密度接种到24孔组织培养板的支架材料上，同时将同样的细胞接种到无支架材料的组织培养板上作为空白对照。补充细胞培养液，使每孔的培养基总量达到500μL。随后将组织培养板放入含5％CO2的培养箱内，于37℃条件下培养，培养液每2天更换一次。分别通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)和碱性磷酸酶试剂盒(ALP Assay) 考察细胞在该支架材料上的粘附、增殖和分化情况。
MG63细胞在OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架上培养2天后的扫描电镜图见图4，从图4中可以看出，所有的支架材料的孔壁上都粘附了类似球形的细胞颗粒，说明不同离子交联和共价交联网络比例条件下OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架都能够支撑细胞的生长。这主要归因于复合支架材料中明胶分子链上含有的精氨酸- 甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)多肽序列和生物活性生长因子(如TGF-β、BMP和 VEGF)的诱导作用，提高了OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的细胞黏附性。
图5为MG63细胞在海藻酸盐凝胶支架上分别培养2天和5天后的细胞增殖情况。图中control为空白对照组，a至f表示OSA/PAAM的比值分别为0.25、1.0、2.0、3.0、 4.5和6.0条件下氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架的增殖情况。从图5中可以看出，MG63细胞分别经过2天和5天培养后均表现出了一定的增殖活力，在OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架上的增殖活力都高于空白对照组，说明 OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架能够为细胞的生长提供更加广阔的3D空间，促进细胞的3D生长。
图6为MG63细胞在海藻酸盐凝胶支架上培养7天后的细胞分化情况。图中control为空白对照组，a至f表示OSA/PAAM的比值分别为0.25、1.0、2.0、3.0、4.5和6.0 条件下氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺互穿网络医用复合型均相支架的分化情况。从图6中可以看出，细胞在OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架上的相对ALP活性均高于空白对照组，说明该复合支架材料都能促进细胞分化，这主要得益于支架材料外包覆的 GT和生物活性生长因子，以及OSA/PAAM复合物良好的生物相容性。但是当PAAM 的含量过高时，细胞的ALP活性不再升高，反而下降，这主要是由于复合支架孔径和孔隙率的迅速减小，影响了细胞在支架材料上的增殖，造成其分化能力的降低。
实施例1
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法具体过程如下：
以HAP/GDL复合物为交联剂，TGF-β为生长调节因子，EDC/NHS混合交联剂为交联GT的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.18。
将5g SA溶解在200mL蒸馏水中，再加入50mL无水乙醇混合均匀。然后在上述混合液中加入1.72g(30％海藻酸钠糖醛酸单体摩尔量)高碘酸钠后，在室温下避光电动搅拌24h。向上述反应液中加入10mL乙二醇，避光磁力搅拌2h以终止反应。用5g 氯化钠和800mL无水乙醇沉淀终止反应后的溶液。之后再将所得沉淀重新溶解在 100mL的蒸馏水中，再以3g氯化钠和600mL无水乙醇沉淀该溶液。如此重复沉淀3 次后，将最终所得溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，透析5天，后经冷冻干燥就得到了氧化度约为27％的氧化海藻酸衍生物(OSA)。
准确称取2.0g OSA和50mg TGF-β溶于100mL去离子水中，于电力搅拌作用下制得负载0.05％TGF-β质量分数约为2％的OSA透明溶液。然后向该OSA透明溶液中依次加入丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺充分混合均匀，使得到的混合溶液中含有2％的丙烯酰胺、0.02％的过硫酸铵、0.014％的四甲基乙二胺和0.024％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺。随后再加入182.6mg HAP纳米粉，在超声搅拌的作用下使其混合均匀。然后移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入97.2mgGDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中，用保鲜膜密封，先在4℃下交联反应4小时，后放置于恒温箱中在60℃下交联反应5小时。形成的凝胶经去离子水反复清洗后转入冷干机中进行冷冻干燥(样品先在冰箱中于-18℃下预冻30min，后转入冷阱中于-50～60℃下冷冻5～6小时)。再将干燥的复合凝胶浸入质量分数为2％的GT溶液中，孵化60min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入分别含有10mmol/L的EDC和10 mmol/L的NHS混合交联剂中，孵育过夜。然后取出，用超纯水反复清洗，之后产物经冷冻干燥即得到OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为79.4％，孔径大小在170～290μm之间，平均抗压强度为0.79MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为14.5％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达92.5％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。
实施例2
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法，具体过程同实施例1，不同之处是：
以HAP/GDL复合物为交联剂，BMP为生长调节因子，京尼平(2wt％)为交联GT 的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定HAP与GDL的摩尔比为1:10，HAP中Ca 元素与SA中–COOH的摩尔比为0.27。
按照实施例1步骤制备氧化度约为27％的OSA，进而制备OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
OSA和GT质量分数均为2.0％；BMP质量分数为0.1％；得到的混合溶液中含有丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺分别为4％、0.04％、 0.028％和0.048％。
所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为75.3％，孔径大小在150～250μm之间，平均抗压强度为1.36MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为12.7％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达90.9％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。
实施例3
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法具体过程如下：
以CaSO4/GDL复合物为交联剂，VEGF为生长调节因子，戊二醛为交联GT的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定CaSO4与GDL的摩尔比为1:2，CaSO4中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.36。
将5g SA溶解在200mL蒸馏水中，再加入50mL无水乙醇混合均匀。然后在上述混合液中加入1.15g(20％海藻酸钠糖醛酸单体摩尔量)高碘酸钠后，在室温下避光电动搅拌24h。向上述反应液中加入10mL乙二醇，避光磁力搅拌2h以终止反应。用5g氯化钠和800mL无水乙醇沉淀终止反应后的溶液。之后再将所得沉淀重新溶解在100mL 的蒸馏水中，再以3g氯化钠和600mL无水乙醇沉淀该溶液。如此重复沉淀3次后，将最终所得溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，透析5天，后经冷冻干燥就得到了氧化度约为18％的氧化海藻酸衍生物(OSA)。
准确称取1.5g OSA和80mg VEGF溶于100mL去离子水中，于电力搅拌作用下制得负载0.08％VEGF质量分数约为1.5％的OSA透明溶液。然后向该OSA透明溶液中依次加入丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺充分混合均匀，使得到的混合溶液中含有3％丙烯酰胺、0.03％过硫酸铵、0.021％四甲基乙二胺和 0.036％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺。随后再加入370.8mg CaSO4纳米粉，在超声搅拌的作用下使其混合均匀。然后移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入 72.8mg GDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中，用保鲜膜密封，先在4℃下交联反应4小时，后放置于恒温箱中在60℃下交联反应5 小时。形成的凝胶经去离子水反复清洗后转入冷干机中进行冷冻干燥。再将干燥的复合凝胶浸入质量分数为1％的GT溶液中，孵化30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入2.5wt％戊二醛溶液中，孵育过夜。然后取出，用超纯水反复清洗，之后产物经冷冻干燥即得到OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为76.6％，孔径大小在160～250μm之间，平均抗压强度为0.93MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为11.1％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达91.2％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。
实施例4
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法，具体过程同实施例3，不同之处是：
以CaSO4/GDL复合物为交联剂，BMP为生长调节因子,EDC/NHS(10mmol/L/10 mmol/L)混合交联剂为交联GT的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定CaSO4与 GDL的摩尔比为1:2，CaSO4中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.27。
按照实施例3步骤制备氧化度约为18％的OSA，进而制备OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
OSA和GT质量分数分别为1.0％和1.5％；BMP质量分数为0.05％；得到的混合溶液中含有丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺分别为0.5％、0.005％、0.0035％和0.006％。
所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为92.6％，孔径大小在190～300μm之间，平均抗压强度为0.31MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为13.3％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达95.7％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。
实施例5
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法具体过程如下：
以Ca3(PO4)2/GDL复合物为交联剂，TGF-β为生长调节因子，京尼平为交联GT的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定Ca3(PO4)2与GDL的摩尔比为1:3，Ca3(PO4)2中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.18。
将5g SA溶解在200mL蒸馏水中，再加入50mL无水乙醇混合均匀。然后在上述混合液中加入0.86g(15％海藻酸钠糖醛酸单体摩尔量)高碘酸钠后，在室温下避光电动搅拌24h。向上述反应液中加入10mL乙二醇，避光磁力搅拌2h以终止反应。用5g氯化钠和800mL无水乙醇沉淀终止反应后的溶液。之后再将所得沉淀重新溶解在100mL 的蒸馏水中，再以3g氯化钠和600mL无水乙醇沉淀该溶液。如此重复沉淀3次后，将最终所得溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，透析5天，后经冷冻干燥就得到了氧化度约为13％的氧化海藻酸衍生物(OSA)。
准确称取1.5g OSA和60mg TGF-β溶于100mL去离子水中，于电力搅拌作用下制得负载0.06％TGF-β质量分数约为1.5％的OSA透明溶液。然后向该OSA透明溶液中依次加入丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺充分混合均匀，使得到的混合溶液中含有1％丙烯酰胺、0.01％过硫酸铵、0.007％四甲基乙二胺和0.012％N，N′-亚甲基双丙烯酰胺。随后再加入141.0mg Ca3(PO4)2纳米粉，在超声搅拌的作用下使其混合均匀。然后移取15mL混合液于50mL烧杯中。在磁力搅拌下，加入36.4mg GDL引发离子交联。高速搅拌3min后将混合液迅速转入12孔组织培养板中，用保鲜膜密封，先在4℃下交联反应4小时，后放置于恒温箱中在60℃下交联反应5小时。形成的凝胶经去离子水反复清洗后转入冷干机中进行冷冻干燥。再将干燥的复合凝胶浸入质量分数为2％的GT溶液中，孵化30min后取出，在去离子水中浸泡并反复冲洗。最后将清洗干净的复合凝胶投入2wt％京尼平溶液中，孵育过夜。然后取出，用超纯水反复清洗，之后产物经冷冻干燥即得到OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为88.5％，孔径大小在170～250μm之间，平均抗压强度为0.47MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为7.8％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达93.8％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。
实施例6
OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料的制备方法，具体过程同实施例5，不同之处是：
以Ca3(PO4)2/GDL复合物为交联剂，BMP为生长调节因子,戊二醛(2.5wt％)溶液为交联GT的共价交联剂。在材料的制备中，分别固定Ca3(PO4)2与GDL的摩尔比为1:3， Ca3(PO4)2中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.27。
按照实施例5步骤制备氧化度约为13％的OSA，进而制备OSA/PAAM互穿网络医用复合型均相支架材料。
OSA和GT质量分数分别为2.0％和1.0％；BMP质量分数为0.1％；使得到的混合溶液中含有丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺分别为1.5％、0.015％、0.0105％和0.018％。所得复合凝胶支架材料呈现棱角清晰和结构规整的3D形貌，其孔隙率为83.8％，孔径大小在160～260μm之间，平均抗压强度为0.60MPa。在模拟生理环境下，2周的生物降解率约为9.1％。经过7天培养，MG63细胞在该复合凝胶支架材料上的存活率高达94.3％，且能够表现出良好的细胞粘附、增殖和分化效果。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种医用复合型均相支架材料的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)通过控制氧化剂的化学计量比，以高碘酸钠将海藻酸钠(SA)部分单体上的连二羟基结构氧化为连二醛基，其反应式为：
制备氧化度为10％～35％的部分氧化海藻酸衍生物(OSA)；
(2)制备负载生长因子的OSA溶液，向该OSA溶液中加入丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺混合均匀，作为溶液A，再加入内源交联剂组分，超声搅拌下混合均匀，最后加入葡萄糖酸内酯(GDL)引发离子交联，搅拌后将混合液迅速转入多孔组织培养板中，密封，使交联反应充分；
内源交联剂组分选自羟基磷灰石(HAP)、Ca3(PO4)2、CaSO4中的一种；内源交联剂组分和GDL构成海藻酸盐的内源交联体系；
(3)上一步形成的复合凝胶清洗后进行冷冻干燥，将干燥后的复合凝胶浸入A型明胶(GT)溶液中，孵化30～60min后取出，去离子水中浸泡并反复冲洗，最后将清洗干净的复合凝胶投入共价交联剂溶液中，孵育过夜，取出，超纯水反复清洗，之后的产物经冷冻干燥得到氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络的医用复合型均相支架材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体过程是：海藻酸钠(SA)用适量水溶解后与无水乙醇、高碘酸钠混合，避光充分搅拌，得到反应液，反应液中海藻酸钠浓度是0.5～2.5％；向反应液中加适量乙二醇避光磁力搅拌以终止反应；用氯化钠和无水乙醇沉淀终止反应后的溶液；
将所得沉淀溶解在蒸馏水中，以氯化钠和无水乙醇沉淀该溶液；如此重复沉淀3次后，将最终所得溶液装入截留分子量为3500的透析袋中透析，经冷冻干燥得到部分氧化海藻酸衍生物(OSA)；
所述氯化钠和无水乙醇的比例为1g：150～200mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述SA的质均分子量Mw≥150000，其单体古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的摩尔比G/M≥1.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述海藻酸盐的内源交联体系包含HAP/GDL、Ca3(PO4)2/GDL和CaSO4/GDL体系，各内源交联体系中两组分的摩尔比分别为1:10、1:3和1:2，内源交联体系中Ca元素与OSA中–COOH的摩尔比为0.09～0.36。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述交联反应过程是先在4～10℃条件下交联反应3～5小时，后放置于恒温箱中在60～80℃条件下交联反应4～8小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的生长因子选自TGF-β、BMP或VEGF；负载生长因子的OSA溶液中，OSA的质量分数为1.0％～3.0％，生长因子的质量分数为0.01％～0.1％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中A型明胶(GT)溶液的质量浓度为0.5％～2.0％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺在溶液A中的质量分数分别为0.5％～4.0％、0.005％～0.04％、0.0035％～0.028和0.006％～0.05％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述共价交联剂选自EDC/NHS混合交联剂、京尼平或戊二醛。
10.一种权利要求1所述的制备方法得到的氧化海藻酸盐/聚丙烯酰胺(OSA/PAAM)互穿网络的医用复合型均相支架材料。
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