CN101543643B - 具有生物活性的胶原基复合角膜替代物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有生物活性的胶原基复合角膜替代物及其制备方法。它主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)为原料，以水为溶剂。以零长度交联剂碳二亚胺(EDC)对胶原进行交联；以Irgacure 2959为光引发剂，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为交联剂对MPDSAH进行引发聚合并交联。混合均匀后，注入模具内固化成型。上述复合角膜替代物冷冻干燥后，具有三维多孔结构，可以吸附大量角膜细胞生长因子，而且冻干角膜替代物可以长期存放，吸水膨胀后可以恢复冻干前的形状和性能。本发明制备的复合角膜替代物组织相容性好，可诱导和促进角膜再生，可随角膜再生而生物降解，生长因子的引入可以促进自体生长因子的富集，减少术后并发症的出现。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性的复合角膜替代物及其制备方法，属于组织工程领域中的角膜移植材料技术。
背景技术
角膜病是一种发病率高、治疗困难的致盲性眼病。目前，角膜病的治疗方法主要以角膜移植为主，但是角膜供体来源的匮乏及术后的高排斥率限制了角膜移植的临床应用。所以，研究者们就开始尝试用角膜替代物来帮助角膜患者恢复视力。从1859年，Heusser首次实施对人的人工角膜植入术至今，人工角膜的发展已经有一百多年的历史，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅橡胶、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)以及氟碳多聚体均被成功地用做角膜替代物的材料。早期的人工角膜材料均为合成材料，其生物相容性差，不利于细胞粘附和增殖。因此，这些合成材料不能完全地替代角膜组织。
近年来，许多研究者开始在体外重建组织工程人工角膜。组织工程角膜是利用生物材料作为活细胞培养的支架，构建组织以替代供体角膜。通过组织工程重建组织的必需要素是支架材料和种子细胞。目前制约组织工程化角膜替代物发展的瓶颈是载体的构建，理想的组织工程支架材料应具备以下性能：①良好的生物相容性，具有适合细胞生长和黏附的微环境；②可制备成三维立体结构，具有多孔性和高孔隙率，有利于细胞的贴附和长入；③生物可降解性，材料在组织形成过程中逐渐降解，而不影响新生组织的结构和功能；④便于加工成所需的形状，并有一定的机械强度。
从查阅文献来看，胶原基角膜替代物在上述性能中显示出其优势。I型胶原占角膜干重的75％，是天然细胞外基质(ECM)的成分，具有特异分子识别信号，可调控细胞行为，介导种子细胞的黏附和增长。1999年加拿大Griffith等以0.02～0.04％戊二醛交联I型胶原和硫酸软骨素复合材料，进行角膜细胞的三维培养，得到形态、透明性与正常人角膜相似的替代物。最近几年，Griffith研究组[Liu Y，Gan L，Carlsson DJ.，Watsky M A.，Munger R，Hodge WG.，Priest D，Griffith M.A Simple，Cross-linked Collagen Tissue Substitute for Corneal Implantation.Investigative Ophthalmology & Visual Science.2006，47(5)：1869-75.]又成功制备了EDC和NHS交联的胶原基角膜替代物。目前已成功用于兔、猪的深板层移植，术后一年显示上皮细胞的重建，且观察到角膜神经的再生。但是，对于圆锥形角膜、酸碱烧伤角膜、糖尿病性角膜等金属基质蛋白酶或胶原酶分泌过高的情况，单纯EDC和NHS交联的胶原角膜替代物降解会更快，无法完成最终的修复目的。在后续工作中，Liu等[Liu W，Deng C，McLaughlin CR，et al.Collagen-phosphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes.Biomaterials.2009，30(8)：1551-1559]将EDC和NHS交联的胶原与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)交联的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)形成互穿聚合物网络(IPN)凝胶，MPC聚合物网络的引入明显提高了IPN凝胶在胶原酶中的稳定性。一年以上的小型猪角膜移植同样显示满意的修复效果。但是所用的MPC极易吸潮，且容易水解。研究表明，甜菜碱型两性电解质除了上述的磷酸型之外，还有羧酸型和磺酸型两种，我们研究组使用的3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)属于磺酸型两性电解质，其生物相容性良好，它与MPC都具有抑制非特异性蛋白吸附的性能，但MPDSAH结构和性质较MPC稳定，因此我们将构建胶原和MPDSAH互穿聚合物网络角膜替代物，以改进MPC易吸潮水解的不足，同时包覆一定浓度的生长因子，构建具有生物活性的复合角膜替代物，以促进角膜的愈合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生物活性的复合角膜替代物及其制备方法，该角膜替代物与人眼组织具有良好的生物相容性，性能良好，在胶原酶中降解缓慢，可以促进角膜上皮细胞和基质胶原生成，且可以长期保存和运输，制备方法简单。
本发明的另一个目的在于提供一种负载生长因子的具有生物活性的复合角膜替代物，可以克服以前角膜替代物难于保存的缺点，提供了一种长期保存角膜替代物的简单方法。
本发明提供的一种具有生物活性的复合角膜替代物主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)(平均分子量为575)为交联剂，室温下对MPDSAH进行交联，以Irgacure 2959为光引发剂进行反应，反应产物再经过浇注成膜加工工艺制备而成，其组成和配比：
EDC与胶原(以胶原分子上氨基数目计)的摩尔比为0.3-3.0∶1；EDC与NHS的摩尔比为1∶1；PEGDA与MPDSAH的质量比为0.2-0.5∶1；光引发剂Irgacure2959与MPDSAH的摩尔比为0.01-0.10∶1。
所述的胶原为：猪皮I型胶原、重组人I型胶原或重组人III型胶原。
本发明提供的一种包覆生长因子的具有生物活性的复合角膜替代物是上述的复合角膜替代物包覆生长因子组成，每毫克冻干复合角膜替代物包覆0.1～0.9μg的生长因子。
本发明提供的具有生物活性的复合角膜替代物的制备方法包括以下步骤：
1)按计量将13.7％的胶原水溶液、80％-90％的MPDSAH水溶液、20％-30％的EDC和NHS等物质的量水溶液与引发剂Irgacure 2959的无水乙醇溶液均匀混合反应，用氢氧化钠溶液调节pH为5.5；
2)将混合反应溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h；
3)去除夹具，打开模具取出角膜样品放入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的pH＝7.4的PBS中，于4℃下保存备用。
所述的负载生长因子的具有生物活性的复合角膜替代物的制备方法包括以下步骤：
1)按计量将权利要求1或2所述的复合角膜替代物冷冻干燥后浸入在500μl-10μg/ml生长因子溶液中，4℃下放置3～4天，以保证角膜完全恢复形变；
2)取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的pH＝7.4PBS中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS，收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
所述的生长因子是：神经生长因子、表皮细胞生长因子、转化生长因子和成纤维细胞生长因子。
本发明的复合角膜替代物与现有的产品和技术相比具有如下的优点：
(1)本发明构建的复合角膜替代物具有良好的生物安全性，能够促进角膜细胞在其上生长繁殖，并随角膜的再生而做顺应性降解；
(2)MPDSAH聚合物网络的引入明显提高了IPN凝胶在胶原酶中的稳定性及其角膜替代物的力学强度；
(3)本发明制备的角膜替代物具有与人角膜相似的力学性能、光学性能，制作方法简单，易于加工处理；
(4)本发明制备的角膜替代物，冻干后为白色海绵状，具有三维多孔结构，易于吸附各种生长因子，可以长期保存，使用时吸水膨胀即可恢复角膜形状；
(5)本发明制备的角膜替代物通过复合生长因子，促进角膜上皮细胞再生及基质胶原的生成，加快神经生长速度，最终可形成与正常角膜相似的结构。
本发明制备的复合角膜替代物具有与人眼角膜相似的特征，组织相容性好，可诱导和促进角膜再生，可随角膜再生而生物降解，角膜细胞生长因子的引入可以促进自体生长因子的富集，维持角膜的健康，减少术后并发症的出现，同时本发明为我们提供了角膜替代物长期保存的方法。
附图说明
图1为本发明制备的角膜替代物外观照片。
图2为本发明制备的冻干角膜替代物外观照片。
图3为本发明制备的冻干角膜替代物吸水恢复形变后的照片。
图4为本发明制备的角膜替代物力学性能：(A)拉伸强度，(B)杨氏模量，(C)断裂伸长率。
图5为本发明实施例1-5制备的角膜替代物在胶原酶中的降解曲线。
具体实施方式
实施例1：
本生物活性复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH(质量比) 3∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
胶原∶EDC∶NHS (摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下：
(1)复合角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封；取与胶原质量比为1∶3的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959∶MPDSAH＝1∶25(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为IPN3-1。
(2)负载生长因子的复合角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述复合角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的复合角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的pH＝7.4的PBS中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例2：
本生物活性的复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH(质量比) 2∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下：
(1)复合角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封；取与胶原质量比为1∶2的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959∶MPDSAH＝1∶25(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为IPN2-1。
(2)负载生长因子的复合角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述复合角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的复合角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例3：
本生物活性的复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下：
(1)复合角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封；取与胶原质量比为1∶1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959∶MPDSAH＝1∶25(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为IPN1-1。
(2)负载生长因子的复合角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述复合角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的复合角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例4：
本生物活性的复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶2
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下：
(1)复合角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封；取与胶原质量比为2∶1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959∶MPDSAH＝1∶25(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为IPN1-2。
(2)负载生长因子的复合角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述复合角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的复合角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例5：
本生物活性的复合角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH 1∶3
MPDSAH∶PEGDA 2∶1
胶原∶EDC∶NHS 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下：
(1)复合角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封；取与胶原质量比为3∶1的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通过密封垫移入T型容器内，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，引发剂Irgacure2959∶MPDSAH＝1∶25(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为IPN1-3。
(2)负载生长因子的复合角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述复合角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的复合角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例6：
本生物活性的角膜替代物各组分比例如下：
猪皮I型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶0
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性角膜替代物的步骤如下：
(1)交联胶原角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的猪皮I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器按计量注入交联剂EDC和NHS，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。此角膜替代物样品命名为Collagen。
(2)负载生长因子的角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述胶原角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的神经生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的角膜样品。取负载生长因子的角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例7：
本生物活性的角膜替代物各组分比例如下：
重组人I型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶0
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性角膜替代物的步骤如下：
(1)交联胶原角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的重组人I型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器按计量注入交联剂EDC和NHS，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。
(2)负载生长因子的角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述胶原角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的表皮细胞生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的角膜样品。取负载生长因子的角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。
实施例8：
本生物活性的角膜替代物各组分比例如下：
重组人III型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶0
胶原∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
用上述各组分制备本生物活性角膜替代物的步骤如下：
(1)交联胶原角膜替代物的制备：取0.5g 13.7％的重组人III型胶原溶液到注射器内，并通过T型容器连接另一注射器密封，反复推拉混合均匀，然后用微量注射器按计量注入交联剂EDC、NHS，其中EDC∶NHS∶胶原＝1∶1∶1(摩尔比)，反复推拉混合均匀，然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具，打开模具去除角膜样品，放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)中浸泡，每隔12h更换新鲜的PBS，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的PBS溶液中，于4℃下保存备用。制得的角膜替代物厚500μm，直径12mm。
按相同步骤制备片状角膜替代物样品，进行力学性能、光学性能、酶降解性能的测试。
(2)负载生长因子的角膜替代物的制备及其生长因子的缓释：将上述胶原角膜冷冻干燥，然后取完整的一片浸入到500μl-10μg/ml的表皮细胞生长因子溶液中，4℃下保存3-4天，以保证角膜完全恢复形变。改变生长因子溶液的浓度制得生长因子含量不同的角膜样品。取负载生长因子的复合角膜替代物，放入37℃的PBS(pH＝7.4)中，每24h将释放液取出，同时补充新鲜的PBS。收集的释放液在冰箱冻存，以备后期测定释放的生长因子浓度。实施例1至实施例6制备的活性复合角膜替代物性能指标参数如表1所示：
表1活性复合角膜替代物的性能
Claims (2)
1.一种具有生物活性的复合角膜替代物的制备方法，它主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺为原料，以水为溶剂，以碳二亚胺为交联剂对胶原进行交联，聚乙二醇二丙烯酸酯为交联剂，室温下对3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺进行交联，以2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)为光引发剂进行反应，反应产物再经过浇注成膜加工工艺制备而成，其原料的组成和配比：
碳二亚胺与胶原的摩尔比为0.3-3.0∶1；碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1；聚乙二醇二丙烯酸酯与3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺的质量比为0.2-0.5∶1；光引发剂Irgacure 2959与3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺的摩尔比为0.01-0.10∶1；其特征在于它包括以下步骤：
1)按计量将13.7％的胶原水溶液、80％-90％的3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺水溶液、20％-30％的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与引发剂Irgacure 2959的无水乙醇溶液均匀混合，用氢氧化钠溶液调节pH为5.5；
2)将溶液浇注到模具内，再放入夹具中夹紧固定，于紫外固化箱中固化40min，取出后室温反应16h，再移入37℃的烘箱内熟化5h；
3)去除夹具，打开模具取出角膜样品放入pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡，每隔12h更换新鲜的磷酸盐缓冲液，清洗7天后，将样品放入含有1％氯仿的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，于4℃下保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的胶原为：猪皮I型胶原、重组人I型胶原或重组人III型胶原。
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