CN101890185B - 含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物及其制备方法和应用。它是胶原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子点载体/DNA复合物制备而成。角膜替代物与ZnO量子点载体/DNA复合物重量比约425∶1,ZnO量子点载体与DNA的重量比25∶1。本发明具有良好的生物相容性,可诱导和促进角膜再生,并随角膜再生而生物降解;并且具有与人角膜相似的力学性能、光学性能,MPDSAH聚合物网络的引入明显提高了角膜替代物在胶原酶中的稳定性及力学强度;氧化锌量子点能够有效复合压缩DNA,成功将DNA导入细胞并使其成功表达,在转基因过程中能够通过荧光作用随时跟踪DNA/载体的位置并确定其胞内分布;本发明将基因转染、组织工程、荧光示踪有效结合,制作方法简单,易于加工处理和长期保存及运输。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物及其制备方法和应用。它是负载生物成像功能转基因载体的胶原基复合角膜替代物及其制备方法,将组织工程与基因转染用于治疗眼科相关疾病。
背景技术
角膜病作为一种高发病率的致盲性眼病,已经越来越受到人们的重视。由于角膜的内皮细胞不能自动修复或替代,同种异体角膜移植术便成为了治疗角膜疾病的最有效方法,但是同种异体角膜移植导致了对供体角膜的极大需求,而且存在着不健康的供体角膜传播疾病的隐患,此外,术后免疫排斥反应的发病率仍较高,鉴于此,开发替代同种异体角膜移植的方法显得刻不容缓。
1859年,Heusser首次将一片玻璃植入病人眼内,开辟了人工角膜移植的先河。此后,Boston Keratoprostheses、AlphaCorTM Keratoprostheses、Seoul type Keratoprostheses和Stanford Keratoprostheses等各种人工角膜成功被应用于临床试验,但早期的这些材料均为合成材料,较差的生物相容性不利于细胞的粘附、增殖,并不能完全替代角膜组织。伴随着组织工程角膜的兴起,具有良好生物相容性、可降解性的生物材料备受国内外研究者的青睐。Ⅰ型胶原占角膜干重的75%,作为天然细胞外基质(ECM)的成分被广泛用于组织工程领域,胶原支架所提供的细胞生长代谢环境接近于生理状态,被加工成多孔海绵或能包覆细胞的水凝胶,是非常理想的组织工程角膜支架材料。然而,非交联的胶原存在力学强度差、易降解的缺点,严重制约了其应用。1999年加拿大渥太华大学的Griffith等用戊二醛交联胶原与硫酸软骨素复合构建了形态、组织学结构和透明度与正常角膜相似的角膜替代物。又用胶原与糖胺聚糖制成凝胶,体外重建可缝合的全层人工角膜,获得了较为理想的机械强度,植入兔眼未引起炎症及免疫反应。近几年,Griffith研究组成功用交联剂碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)制备了多种胶原基角膜替代物。碳二亚胺作为零长度的交联剂,最后可被脱除,故产物无任何毒性异物。目前已成功用于兔、猪的深板层移植,术后一年显示上皮细胞的重建,伴随基质细胞的长入,且观察到角膜神经的再生。但对于圆锥形角膜、酸碱烧伤角膜、糖尿病性角膜等金属基质蛋白酶或胶原酶分泌过高的情况,单纯EDC和NHS交联的胶原角膜替代物降解会更快,无法完成最终的修复目的。在此基础上,Liu等[Liu W,Deng C,McLaughlin CR,et al.Collagen-phosphorylcholineinterpenetrating network hydrogels as corneal substitutes.Biomaterials.2009,30(8):1551-1559]将EDC和NHS交联的胶原与聚乙二醇双甲基丙烯酸酯(PEGDA)交联的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)形成互穿聚合物网络(IPN)凝胶,MPC网络的引入明显提高了IPN凝胶在胶原酶中的稳定性。一年以上的小型猪角膜移植同样显示满意的修复效果。但由于MPC极易吸潮,且容易水解,我们研究组使用磺酸型两性电解质3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)替代MPC,构建了胶原和MPDSAH互穿聚合物网络角膜替代物,以改进MPC易吸潮水解的不足,其生物相容性良好,与MPC相同都具有抑制非特异性蛋白吸附的性能,但结构和性质较MPC稳定。
对于角膜替代物,移植后原位跟踪其降解程度是十分必要,由此可指导设计适宜降解时间的替代物以满足角膜细胞、神经再生。但上述的角膜替代物均缺少原位跟踪降解功能,而标记有机荧光染料难以获得稳定的荧光。
量子点(Quantum Dot)又称半导体纳米微晶体,是近年来研究越来越多的新兴纳米材料,优良的随尺寸变化的性质,使其无论在基础研究还是实际应用方面都表现出了重要的价值,特别是独特的光学性能和光化学稳定性,使其作为理想的荧光探针材料,广泛被应用于生命科学等领域。目前应用范围最广、制备最为成熟的是CdX(X=S、Se、Te)量子点,但极大的生物毒性严重制约了其在基因治疗领域的应用。作为替代物,安全无毒、生物友好的氧化锌量子点越来越受到人们的重视。量子点/聚合物复合材料作为兼顾量子点和聚合物各自优势的一种材料,表现出了广泛的应用前景,目前制备方法主要有原位生成法、原位聚合法、溶胶-凝胶法等。基于以上原因,我们成功制备了聚N,N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹的氧化锌量子点,提供了一种具有荧光示踪能力,并能够有效复合DNA进行基因转染载体的制备方法,随后采用凝胶后包裹技术,通过将氧化锌量子点与质粒DNA的复合物负载到角膜替代物中,此复合角膜替代物不仅具有基因递送功能,而且通过光学方法实现对于DNA运输过程的跟踪。此方法可拓展为ZnO量子点复合内皮抑制素基因达到原位示踪降解和基因释放抑制角膜移植的新生血管目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物及其制备方法和应用。该角膜替代物具备良好的力学性能、光学性能,在胶原酶中降解缓慢,且与人眼组织有良好的生物相容性。通过负载量子点载体与质粒DNA的复合物,可将组织工程与基因转染用于眼科,并示踪DNA的运输过程,制备方法简单,可以长期保存和运输。
本发明提供的一种含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物是胶原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子点载体/DNA复合物制备而成,所述角膜替代物与ZnO量子点载体/DNA复合物重量比约425∶1,ZnO量子点载体与DNA的重量比25∶1。
所述的胶原/MPDSAH IPN角膜替代物主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)为原料,以水为溶剂,以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联,聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)(平均分子量为575)为交联剂,对MPDSAH进行交联,以2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)为光引发剂进行反应,反应产物经过浇注成膜制备成互穿聚合物网络角膜替代物。
其组成和配比:
EDC与胶原(以胶原分子上氨基数目计,表示为Coll-NH2)的摩尔比为1∶1;EDC与NHS的摩尔比为1∶1;MPDSAH与PEGDA的质量比为2∶1;光引发剂Irgacure2959与MPDSAH的摩尔比为0.02∶1。
所用胶原是猪Ⅰ型胶原,量子点是聚N,N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸盐包裹的氧化锌量子点,结构如下:聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸盐:
单体N,N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯与甲基丙烯酸锌两单体的共聚摩尔比为1-30∶1。
本发明提供的含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物是胶原/MPDSAH IPN角膜替代物的制备方法包括以下步骤:
1)将胶原溶于水配成质量分数为13.7%的溶液,于4℃5000r/min离心去除气泡,按计量在冰水浴中与MPDSAH水溶液、EDC和NHS等物质的量混合的水溶液与引发剂Irgacure 2959的无水乙醇溶液均匀混合反应,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5.5;
2)将混合反应溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后保持湿度100%的条件下,室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h;
3)去除夹具,打开模具取出角膜样品放入pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的pH=7.4的PBS中,于4℃下保存备用;
4)将上述复合角膜替代物-50℃冷冻干燥48h,后浸入在ZnO量子点载体/DNA复合物溶液中,吸附24h,保证角膜完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附;
5)将制品再次进行冷冻干燥48h,可使角膜替代物达到长期保存和运输的目的。
本发明所述的胶原是猪Ⅰ型胶原,ZnO量子点的粒径约3.6nm,ZnO量子点的浓度5mg/ml,DNA的浓度0.5mg/ml,角膜替代物与ZnO量子点载体/DNA复合物重量比约425∶1,ZnO量子点载体与DNA的重量比25∶1;角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm。
本发明的复合角膜替代物用于制造治疗眼科相关疾病的药物,并可示踪替代物的降解和特定基因的原位释放。
本发明的复合角膜替代物与现有的产品和技术相比具有如下的优点:
胶原基角膜替代物具有良好的生物相容性,可诱导和促进角膜再生,并随角膜再生而生物降解;该角膜替代物具有与人角膜相似的力学性能、光学性能,MPDSAH聚合物网络的引入明显提高了角膜替代物在胶原酶中的稳定性及力学强度;所用的氧化锌量子点能够有效复合压缩DNA,成功将DNA导入细胞并使其成功表达,在转基因过程中能够通过荧光作用随时跟踪DNA/载体的位置并确定其胞内分布;该角膜替代物将基因转染、组织工程、荧光示踪有效结合,制作方法简单,易于加工处理和长期保存及运输。
附图说明
图1为角膜替代物在可见光下的光学显微照片。
图2为未吸附量子点的角膜替代物在紫外灯下的光学显微照片。
图3为collagen角膜替代物吸附量子点后在紫外灯下的光学显微照片。
图4为IPN1-0.3角膜替代物吸附量子点后在紫外灯下的光学显微照片。
图5为IPN1-1角膜替代物吸附量子点后在紫外灯下的光学显微照片。
图6为IPN1-2角膜替代物吸附量子点后在紫外灯下的光学显微照片。
具体实施方式
ZnO量子点的制备方法参照文献[Zhang P,Liu WG.ZnO QDPMAA-co-PDMAEMAnonviral vector for plasmid DNA delivery and bioimaging.Biomaterials.2010,31(11):3087-3094],通过在甲基丙烯酸锌(Zn(MAA)2)与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)的无规共聚过程中加入氢氧化锂水解的方法制得了具有优良水溶性,在紫外激发下具有较强黄绿色荧光的ZnO量子点。
实施例1:
胶原角膜替代物各组分比例如下:
猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶0
Coll-NH2∶EDC∶NHS (摩尔比) 1∶1∶1
(1)交联胶原角膜替代物的制备:取0.5g 13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内,并通过T型容器连接另一注射器密封,反复推拉混均,然后用微量注射器按计量注入交联剂EDC和NHS,其中Coll-NH2∶EDC∶NHS=1∶1∶1(摩尔比),反复推拉混均,然后用微量注射器加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,100%湿度,室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具,打开模具取出角膜样品,放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中,于4℃下保存备用。制得的角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm,与人角膜具有相同曲率。
(2)负载ZnO量子点载体的角膜替代物的制备及体外转染:按以上步骤制备片状角膜替代物样品,并切割成48孔板大小圆片,冷冻干燥48h后使其暴露在紫外灯下光照24h灭菌。将所用ZnO量子点载体配成浓度为5mg/ml的溶液,并用0.22μm滤器滤菌,与0.5mg/ml pGL3质粒DNA溶液等体积复合30min,复合比25∶1(w/w)。将灭菌充分的冻干样品浸入到每孔500μL复合物溶液的48孔板中静置24h,待样品完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附后将生长至指数生长期的RCFBF细胞悬液加入到凝胶中,转染24h后换掖,继续培养24小时。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:18861.01RLU/mgprotein。
取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能测试,此角膜替代物样品命名为Collagen,其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm,厚为500μm。
实施例2:
胶原/MPDSAH复合角膜替代物各组分比例如下:
猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶0.3
Coll-NH2∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
Irgacure2959∶MPDSAH(摩尔比) 0.02∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下:
(1)复合角膜替代物的制备:取0.5g 13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内,并通过T型容器连接另一注射器密封,反复推拉混均;按计量为猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH=1∶0.3(质量比)的MPDSAH溶于水中,用微量注射器通过密封垫移入T型容器内,反复推拉混合均匀,然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959,其中Coll-NH2∶EDC∶NHS=1∶1∶1(摩尔比),引发剂Irgacure 2959∶MPDSAH=0.02∶1(摩尔比),反复推拉混合均匀,然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具,打开模具取出角膜样品,放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中,于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm,与人角膜具有相同曲率。
(2)负载ZnO量子点载体的角膜替代物的制备及体外转染:按以上步骤制备片状角膜替代物样品,并切割成48孔板大小圆片,冷冻干燥48h后使其暴露在紫外灯下光照24h灭菌。将所用ZnO量子点载体配成浓度为5mg/ml的溶液,并用0.22μm滤器滤菌,与0.5mg/ml pGL3质粒DNA溶液等体积复合30min,复合比25∶1(w/w)。将灭菌充分的冻干样品浸入到每孔500μL复合物溶液的48孔板中静置24h,待样品完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附后将生长至指数生长期的RCFBF细胞悬液加入到凝胶中,转染24h后换掖,继续培养24小时。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:25957.29RLU/mgprotein。
取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能测试,此角膜替代物样品命名为IPN1-0.3,其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm,厚为500μm。
实施例3:
胶原/MPDSAH复合角膜替代物各组分比例如下:
猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶1
Coll-NH2∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
Irgacure2959∶MPDSAH(摩尔比) 0.02∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下:
(1)复合角膜替代物的制备:取0.5g 13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内,并通过T型容器连接另一注射器密封,反复推拉混均;按计量为猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH=1∶1(质量比)的MPDSAH溶于水中,用微量注射器通过密封垫移入T型容器内,反复推拉混合均匀,然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959,其中Coll-NH2∶EDC∶NHS=1∶1∶1(摩尔比),引发剂Irgacure 2959∶MPDSAH=0.02∶1(摩尔比),反复推拉混合均匀,然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具,打开模具取出角膜样品,放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中,于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm,与人角膜具有相同曲率。
(2)负载ZnO量子点载体的角膜替代物的制备及体外转染:按以上步骤制备片状角膜替代物样品,并切割成48孔板大小圆片,冷冻干燥48h后使其暴露在紫外灯下光照24h灭菌。将所用ZnO量子点载体配成浓度为5mg/ml的溶液,并用0.22μm滤器滤菌,与0.5mg/ml pGL3质粒DNA溶液等体积复合30min,复合比25∶1(w/w)。将灭菌充分的冻干样品浸入到每孔500μL复合物溶液的48孔板中静置24h,待样品完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附后将生长至指数生长期的RCFBF细胞悬液加入到凝胶中,转染24h后换掖,继续培养24小时。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:27981.23RLU/mgprotein。
取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能测试,此角膜替代物样品命名为IPN1-1,其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm,厚为500μm。
实施例4:
胶原/MPDSAH复合角膜替代物各组分比例如下:
猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH(质量比) 1∶2
Coll-NH2∶EDC∶NHS(摩尔比) 1∶1∶1
MPDSAH∶PEGDA(质量比) 2∶1
Irgacure2959∶MPDSAH(摩尔比) 0.02∶1
用上述各组分制备本生物活性复合角膜替代物的步骤如下:
(1)复合角膜替代物的制备:取0.5g 13.7%的猪皮Ⅰ型胶原溶液到注射器内,并通过T型容器连接另一注射器密封,反复推拉混均;按计量为猪皮Ⅰ型胶原∶MPDSAH=1∶2(质量比)的MPDSAH溶于水中,用微量注射器通过密封垫移入T型容器内,反复推拉混合均匀,然后用微量注射器依次注入交联剂EDC、NHS和光引发剂Irgacure 2959,其中Coll-NH2∶EDC∶NHS=1∶1∶1(摩尔比),引发剂Irgacure 2959∶MPDSAH=0.02∶1(摩尔比),反复推拉混合均匀,然后加入适量2mol/L的NaOH溶液调节pH在5.5左右。混合均匀后将溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h。去除夹具,打开模具取出角膜样品,放入20ml磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的PBS溶液中,于4℃下保存备用。制得的复合角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm,与人角膜具有相同曲率。
(2)负载ZnO量子点载体的角膜替代物的制备及体外转染:按以上步骤制备片状角膜替代物样品,并切割成48孔板大小圆片,冷冻干燥48h后使其暴露在紫外灯下光照24h灭菌。将所用ZnO量子点载体配成浓度为5mg/ml的溶液,并用0.22μm滤器滤菌,与0.5mg/ml pGL3质粒DNA溶液等体积复合30min,复合比25∶1(w/w)。将灭菌充分的冻干样品浸入到每孔500μL复合物溶液的48孔板中静置24h,待样品完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附后将生长至指数生长期的RCFBF细胞悬液加入到凝胶中,转染24h后换掖,继续培养24小时。裂解细胞,测定其中的荧光素酶活性为:22128RLU/mg protein。
取片状角膜替代物样品进行力学性能、光学性能测试,此角膜替代物样品命名为IPN1-2,其中进行力学性能测试的角膜替代物样品的尺寸为20mm×3mm,厚为500μm。
实施例1至实施例4制备的角膜替代物性能指标参数如表1、表2所示:
表1 角膜替代物光学性能参数
表2 角膜替代物力学性能参数
Claims (9)
1.一种含有ZnO量子点载体/DNA复合物的胶原基复合角膜替代物,其特征在于它是胶原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子点载体/DNA复合物制备而成;包括以下步骤:
1)将胶原溶于水配成质量分数为13.7%的溶液,于4℃5000r/min离心去除气泡,按计量在冰水浴中与MPDSAH水溶液、EDC和NHS等物质的量混合的水溶液与引发剂Irgacure 2959的无水乙醇溶液均匀混合反应,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5.5;
2)将混合反应溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后保持湿度100%的条件下,室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h;
3)去除夹具,打开模具取出角膜样品放入pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的pH=7.4的PBS中,于4℃下保存备用;
4)将上述步骤制备的复合角膜替代物-50℃冷冻干燥48h,后浸入在ZnO量子点载体/DNA复合物溶液中,吸附24h,保证角膜完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附;
5)将制品再次进行冷冻干燥48h,可使上述步骤制备的角膜替代物达到长期保存和运输的目的。
2.根据权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物,其特征在于所述胶原/MPDSAH IPN角膜替代物与ZnO量子点载体/DNA复合物重量比为425∶1,ZnO量子点载体与DNA的重量比为25∶1。
3.根据权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物,其特征在于所述胶原/MPDSAH IPN角膜替代物厚500-600μm,直径11.5-12mm。
4.根据权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物,其特征在于所述的胶原/MPDSAHIPN角膜替代物主要是以胶原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)为原料,以水为溶剂,以碳二亚胺(EDC)为交联剂对胶原进行交联,平均分子量为575的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为交联剂,对MPDSAH进行交联,以2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)为光引发剂进行反应,反应产物经过浇注成膜制备成互穿聚合物网络角膜替代物;
其组成和配比:
EDC与胶原的摩尔比为1∶1,以胶原分子上氨基数目计,表示为Coll-NH2;EDC与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1∶1;MPDSAH与PEGDA的质量比为2∶1;光引发剂Irgacure 2959与MPDSAH的摩尔比为0.02∶1。
6.一种权利要求1所述的胶原基复合角膜替代物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)将胶原溶于水配成质量分数为13.7%的溶液,于4℃5000r/min离心去除气泡,按计量在冰水浴中与MPDSAH水溶液、EDC和NHS等物质的量混合的水溶液与引发剂Irgacure 2959的无水乙醇溶液均匀混合反应,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5.5;
2)将混合反应溶液浇注到模具内,再放入夹具中夹紧固定,于紫外固化箱中固化40min,取出后保持湿度100%的条件下,室温反应16h,再移入37℃的烘箱内熟化5h;
3)去除夹具,打开模具取出角膜样品放入pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡,每隔12h更换新鲜的PBS,清洗7天后,将样品放入含有1%氯仿的pH=7.4的PBS中,于4℃下保存备用;
4)将上述步骤制备的复合角膜替代物-50℃冷冻干燥48h,后浸入在ZnO量子点载体/DNA复合物溶液中,吸附24h,保证角膜完全恢复形变并对复合物达到了平衡吸附;
5)将制品再次进行冷冻干燥48h,可使上述步骤制备的角膜替代物达到长期保存和运输的目的。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于所述的胶原是猪I型胶原,ZnO量子点的粒径3.6nm;ZnO量子点的浓度5mg/ml。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于所述的DNA的浓度0.5mg/ml,角膜替代物与ZnO量子点载体/DNA复合物重量比为425∶1,ZnO量子点载体与DNA的重量比为25∶1。
9.权利要求1所述的复合角膜替代物用于制造治疗眼科相关疾病的药物。
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