CN101856515A - 以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法 - Google Patents

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Abstract

一种以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法。所述的壳聚糖为国内外市面销售的药用级别的壳聚糖，其脱乙酰度不低于85％。所述的贝壳粉末为背角无齿蚌贝壳去除角质层后所剩余部分，它包含了贝壳棱柱层和珍珠层。所制备的人工骨弯曲模量达250-900MPa，压缩模量达500-1300MPa，杨氏模量达160-280MPa。同时，其内部的蜂窝状结构能够满足细胞生长的需求。孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据壳聚糖及贝壳粉末的比例进行调节。适用于骨缺损部位的填充，其作用机理为骨传导作用(osteoconduction)，即通过促进宿主骨与人工骨表面的结合，引导骨形成。

Description

以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法
技术领域
本发明涉及生物组织工程及生物材料技术领域，特别是涉及一种人工骨的制备方法，具体说是一种以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法。
背景技术
骨缺损是矫形外科临床常见病例，通常采用自体骨移植、同种异体骨移植、带血供的游离骨移植等方法对其进行治疗。但这些方法普遍受材料来源的制约，为此，人们试图通过组织工程的方法来解决骨缺损的修复问题。人工骨替代材料是近年来人们研究的热点。
人工骨的作用原理包括3个方面。①骨生成作用(osteogenesis)：人工骨材料中包含了具有分化成骨潜能的活细胞，具有骨形成作用；②骨传导作用(osteoconduction)：人工骨材料通过促进宿主骨与人工骨表面的结合，引导骨形成；③骨诱导作用(osteoinduction)：人工骨材料通过提供一种生物刺激，诱导局部细胞或移植的细胞分化形成成熟的成骨细胞。
1)人工骨研制中的材料应用概况
材料的选择一直是生物可降解型人工骨研制工作的核心。许多种类的材料被应用于此项研究中。在这些材料中，天然生物材料主要包括脱钙骨基质(DBM)，胶原，明胶，纤维蛋白，硫酸软骨素，壳聚糖，海藻酸钠，丝素蛋白等。人工合成无机材料主要包括生物活性玻璃陶瓷(BGC)，羟基磷灰石(HA)，磷酸三钙(TCP)，磷酸钙骨水泥(CPC)和硫酸钙(CS)，半水硫酸钙(CSH)等。人工合成有机高分子材料主要包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚乳酸和聚乙醇酸共聚物(PLGA)等。
2)贝壳在人工骨研究中的应用正逐步引起重视
软体动物贝壳由三层结构构成，由内到外依次是珍珠层、棱柱层和角质层。贝壳由95％左右的无机物和5％左右的有机物构成。其无机组成相为碳酸钙，有机组成相主要为蛋白质和多糖。
贝壳具有优良的力学性质，来源丰富，价廉物美；贝壳的成分与骨器官相似，贝壳的发育与骨修复的过程和机理非常相似；贝壳中还可能含有具有促进生物矿化作用的信号分子。所以，人们希望用贝壳制备人工骨，以实现其他材料所不能达到的骨修复效果。
由于贝壳为弧形的片状形态，其形态和厚度基本不能达到骨器官的要求，这就注定了贝壳整体材料不适合于直接被加工成人工骨。将贝壳进行粉碎制备成粉末，采用一定的工艺按特定的骨形状将贝壳粉末成型，这就成为以贝壳为材料研制人工骨的必然选择。
3)壳聚糖
壳聚糖，英文名称Chitosan，是虾蟹等无脊椎动物的几丁质外骨骼经脱乙酰反应后的产品。壳聚糖由于具有良好的生物相容性，而在生物医学及制药等方面得到了极其广泛的应用。壳聚糖的规格主要是以其脱乙酰基程度(％)来标示的。壳聚糖难溶解于水相介质，但溶于稀酸。壳聚糖易与戊二醛发生交联作用而形成水不溶性物质，同时，其机械强度得到加强。
4)贝壳粉末与羟基磷灰石的比较
在人工骨的研究中，壳聚糖与羟基磷灰石复合是最普遍的材料组合方式。羟基磷灰石是天然珊瑚的主要成分，与贝壳中的碳酸钙晶体结构的力学性质相当。但是二者又有本质的差异。在人工骨的研究中所使用的羟基磷灰石是通过化学方法所合成的，化学反应条件的细微变化均会严重影响其力学性质。贝壳良好的力学性质主要取决于碳酸钙晶体与贝壳中有机物的纳米级相对空间几何结构，这种结构在贝壳粉末中仍然得到了保持。从这种意义上讲，作为制备人工骨的材料，贝壳粉末优于羟基磷灰石。同时，贝壳的成分与骨器官相似，贝壳的发育与骨修复的过程和机理非常相似；贝壳中还可能含有具有促进生物矿化作用的信号分子。这些优良性质也是羟基磷灰石所不能比拟的。
5)目前人工骨研究中所存在的问题
目前，在人工骨的研究中，人们普遍认为高的孔隙率和直径大于100um的孔径有利于细胞在人工骨中的生长。基于这样的观点，人们在人工骨的研究中片面地追求高的孔隙率和大的孔径，所制备的人工骨每立方厘米所含干物质的量不高于0.1克，这样的人工骨材料几乎没有机械强度可言。由于机械强度差，植入体内后形态不易保持。同时，也难以进行移植前的再整形。事实上，对于一种在体内可以降解的人工骨而言，高的孔隙率和直径大于100um的孔径并不是完全必要的。因为，在材料的逐步降解及细胞对材料的逐步侵袭过程之中，在材料中会自然形成一些满足细胞生长和迁移所需要的孔隙。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种以壳聚糖和贝壳粉末为材料制备人工骨的方法，该方法着眼于骨传导作用，在优先考虑人工骨力学性能的前提下，兼顾其孔隙率和孔径。
本发明依次通过下列步骤实现：
(1)壳聚糖溶液的准备：称取一定量的壳聚糖，加入质量比浓度为1～5％的乙酸溶液，壳聚糖与质量比浓度为1～5％的乙酸溶液的质量体积比为1∶10～20，密封40℃条件下待壳聚糖完全溶解，制得壳聚糖乙酸溶液；
(2)混合液的制备：称取一定量的贝壳粉末，贝壳粉末与步骤(1)壳聚糖的质量比为4～9∶1，加入步骤(1)制得的壳聚糖乙酸溶液中，机械搅拌直至贝壳粉末在壳聚糖乙酸溶液中分散均匀，得贝壳粉末乳液；
(3)成型：将步骤(2)所得贝壳粉末乳液倒入模具中，40℃条件下硬化后，去除模具，冷冻干燥；
(4)交联：将冷冻干燥后的材料浸没于戊二醛，密封静置24小时；
(5)漂洗、高压蒸汽灭菌：全部倒掉戊二醛，置于自来水龙头下，流水冲洗2小时，再用三蒸水漂洗3次，每次1小时，然后置于灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌；
(6)冷冻干燥：将材料冷冻干燥后密封保存。
漂洗前可进行整形，切割成长方体或其它形状。
上述方法中所用的壳聚糖为国内外市面销售的药用级别的壳聚糖，其脱乙酰度不低于85％，贝壳粉末为经机械粉碎后进行筛分(400目)所得粉末。
临床使用在移植前，根据患者骨缺损部位对移植物形态的要求，可以将本材料切割成弧形、板状、不规则形等任意形态。
在贝壳的三层结构中，角质层直接与水体接触，其粗糙的表面常粘附了大量杂质不易清除干净，故在本发明方法中所使用的贝壳材料是背角无齿蚌贝壳去除角质层后所剩余部分，它包含了贝壳棱柱层和珍珠层。
背角无齿蚌，学名：Anodonta woodiana(Lea l834)，属软体动物门，瓣鳃纲，蚌科，俗称“河蚌”，营淡水生，在重庆地区的资源贮量极其丰富。
本方法所得人工骨适用于骨缺损部位的填充，其作用机理为骨传导作用(osteoconduction)，即通过促进宿主骨与人工骨表面的结合，引导骨形成。
本发明的优点是：
本发明所制备的人工骨与报道的相关研究相比，具有不可比拟的优良力学性能，弯曲模量达250-900MPa，压缩模量达500-1300MPa，杨氏模量达160-280Mpa。同时，其内部的蜂窝状结构能够满足细胞生长的需求。所采用的高压蒸汽灭菌步骤，不但可以实现灭菌的目的，还可以实现温度对本人工骨内部分子结构的改善。所制备的人工骨的孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据壳聚糖及贝壳粉末的比例进行调节。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发明，而不构成对本发明的限定。
实施例1：
1)人工骨的制备
(1)壳聚糖溶液的准备
称取壳聚糖12.5克置于500毫升烧杯中，加入250毫升质量比浓度为1％乙酸溶液，用牛皮纸封住烧杯口，置入烘箱中(40℃，)，待壳聚糖完全溶解后取出。
(2)混合液的制备
称取112.5克贝壳粉末，加入壳聚糖溶液中，机械搅拌直至贝壳粉末在壳聚糖溶液中分散均匀。
(3)成型
将上述混合液倒入上述模具中，置入烘箱中(40℃，)，待硬化到一定程度后，破坏并去除模具，冷冻干燥。
(4)交联
将上述材料置于大烧杯中，加入500毫升戊二醛，用牛皮纸封住烧杯口，静置24小时。
(5)漂洗
全部倒掉烧杯中的戊二醛，置于自来水龙头下，流水冲洗2小时。
(6)整形
取出材料，切割成60mm(寛)×60mm(高)×100mm(长)的长方体。
(7)漂洗
将整形后的材料用三蒸水漂洗3次，每次1小时。
(8)高压蒸汽灭菌
将材料置于灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌。
(10)冷冻干燥
将材料冷冻干燥后密封保存。
2)性能检测
(1)采用扫描电镜观察其断面结构。
(2)孔隙率的测定
采用比重法，在室温条件下测定：选用一个比重瓶，加满蒸馏水并称质量(M1)；把质量为Ms的样品浸入蒸馏水中，抽真空，使样品中的气体完全被蒸馏水取代，待比重瓶补满蒸馏水后称质量(M2)；将浸透了蒸馏水的样品取出，称剩余的蒸馏水与比重瓶的质量(M3)。
计算公式ε＝(M2-M3-Ms)/(M1-M3)×100％
(3)力学性能检测
将样品在CMT6503型微机控制电子万能试验机上测试弯曲模量、压缩模量和拉伸强度，加载速度为1mm/min。
(4)生物安全性检测
①供试液准备
取样品1g，生理盐水中下浸提24h(37±1℃)，常温下8000rpm离心5min，取上清液作为供试液备用，并将生理盐水作为对照。
②过敏性试验
随机抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七组，分别用已配制好的7种供试液，对七组小白鼠进行腹腔注射，观察15min内小白鼠有无爪搔鼻、喷嚏、竖毛、干呕或咳嗽三声以上、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡等反应，并记录结果；第3天，进行第二次腹腔注射；第5天，进行第三次腹腔注射；第14天，进行第一次尾静脉攻击，观察15min内小白鼠的反应，并记录结果；第15天、第16天、第17天陆续完成静脉注射；第19天，进行第二次尾静脉攻击。如两次攻击小白鼠均未出现明显的上述过敏现象，即可认为受试品不会引起过敏反应。
③动物急性(单剂量)毒性
随机抽取32只小白鼠，雌雄各半，分成八组，分别用已配制好的7种供试液对七组小白鼠进行静脉注射，另外一组用生理盐水作阴性对照。观察小白鼠的生长情况，并记录小白鼠的体重。
④皮肤刺激试验
随机抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七组，分别用已配制好的7种供试液对七组小白鼠进行试验。在脊柱两侧各选3个2～3cm3面积的去毛区，将试验样品斑贴，左侧3点为供试液，右侧3点为生理盐水，用4层25mm×25mm纱布覆盖，包扎固定。4h后除去斑贴物，并标记斑贴部位，用温水或70％乙醇清洁后吸干，观察斑贴部位的反应。每12h重复一次，连续7天，后续观察7天，并记录结果。
⑤溶血试验
取2.0±0.2kg的白兔1只，自心脏取血20ml，用玻璃棒搅拌除去血块，加入生理盐水7ml，肝素1ml，混合后4℃下，2200rpm，离心10min，分离，弃去上清，用生理盐水反复离心清洗，直至上清不呈红色，然后按所得红细胞容积，用生理盐水配成2％的悬液，即用移液枪按0.2ml∶9.8ml(血细胞∶生理盐水)的比例配置。
添加顺序：供试液、生理盐水，37℃水浴10min，2％红细胞悬液，37℃水浴，观察15min，结果：无棕色絮状沉淀；然后1000rpm，5min离心，取上清液，用UV-2100分光光度计测定各吸收值，以生理盐水为对照。
检测结果显示：内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率20-35％；孔径15-50微米。弯曲模量250-800MPa，压缩模量500-1250MPa，杨氏模量为160-200Mpa。生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。
实施例2：
1)人工骨的制备
(1)壳聚糖溶液的准备
称取壳聚糖6克置于200毫升烧杯中，加入60毫升质量比浓度为3％的乙酸溶液，用牛皮纸封住烧杯口，置入烘箱中(40℃，)，待壳聚糖完全溶解后取出。
(3)混合液的制备
称取24克贝壳粉末，加入壳聚糖溶液中，机械搅拌直至贝壳粉末在壳聚糖溶液中分散均匀。
(4)成型(如实施例1)
(5)交联
将上述材料置于大烧杯中，加入100毫升戊二醛，用牛皮纸封住烧杯口，静置24小时。
(6)漂洗(如实施例1)
(7)整形
取出材料，切割成30mm(寛)×30mm(高)×60mm(长)的长方体。
(8)漂洗(如实施例1)
(9)高压蒸汽灭菌(如实施例1)
(10)冷冻干燥(如实施例1)
2)性能检测(如实施例1)
检测结果显示：内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率10-15％；孔径15-30微米。弯曲模量500-900MPa，压缩模量600-1350MPa，杨氏模量为200-280Mpa。生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。
实施例3：
1)人工骨的制备
(1)壳聚糖溶液的准备
称取壳聚糖8克置于200毫升烧杯中，加入100毫升质量比浓度为5％的乙酸溶液，用牛皮纸封住烧杯口，置入烘箱中(40℃，)，待壳聚糖完全溶解后取出。
(3)混合液的制备
称取42克贝壳粉末，加入壳聚糖溶液中，机械搅拌直至贝壳粉末在壳聚糖溶液中分散均匀。
(4)成型(如实施例1)
(5)交联
将上述材料置于大烧杯中，加入100毫升戊二醛，用牛皮纸封住烧杯口，静置24小时。
(6)漂洗(如实施例1)
(7)整形
取出材料，切割成40mm(寛)×40mm(高)×70mm(长)的长方体。
(8)漂洗(如实施例1)
(9)高压蒸汽灭菌(如实施例1)
(10)冷冻干燥(如实施例1)
2)性能检测(见实施例1)
检测结果显示：内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率18-32％；孔径15-45微米。弯曲模量350-750MPa，压缩模量550-1100MPa，杨氏模量为180-260Mpa。生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。

Claims (3)

1.一种以壳聚糖和贝壳粉末为原料制备人工骨的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现：
(1)壳聚糖溶液的准备：称取一定量的壳聚糖，加入质量比浓度为1～5％的乙酸溶液，壳聚糖与质量比浓度为1～5％的乙酸溶液的质量体积比为1∶10～20，密封40℃条件下待壳聚糖完全溶解，制得壳聚糖乙酸溶液；
(2)混合液的制备：称取一定量的贝壳粉末，贝壳粉末与步骤(1)壳聚糖的质量比为4～9∶1，加入步骤(1)制得的壳聚糖乙酸溶液中，机械搅拌直至贝壳粉末在壳聚糖乙酸溶液中分散均匀，得贝壳粉末乳液；
(3)成型：将步骤(2)所得贝壳粉末乳液倒入模具中，40℃条件下硬化后，去除模具，冷冻干燥；
(4)交联：将冷冻干燥后的材料浸没于戊二醛，密封静置24小时；
(5)漂洗、高压蒸汽灭菌：全部倒掉戊二醛，置于自来水龙头下，流水冲洗2小时，再用三蒸水漂洗3次，每次1小时，然后置于灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌；
(6)冷冻干燥：将材料冷冻干燥后密封保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的贝壳材料是背角无齿蚌贝壳去除角质层后所剩余部分，它包含了贝壳棱柱层和珍珠层。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用的壳聚糖为国内外市面销售的药用级别的壳聚糖，其脱乙酰度不低于85％，贝壳粉末为经机械粉碎后进行400目筛分所得粉末。
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