CN102727935A

CN102727935A - 硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置

Info

Publication number: CN102727935A
Application number: CN2012102511341A
Authority: CN
Inventors: 黄文涛
Original assignee: SHAANXI BOHONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shaanxi Bio Regenerative Medicine Co ltd
Priority date: 2012-07-19
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-07-19
Also published as: CN102727935B

Abstract

一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，本发明是将膜组织反复冻融、辗压破裂细胞、交联固定保护、脱细胞去抗原、致密面纤维化修饰及包装灭菌后获得；具有方法简单、原料来源广泛低廉、成本低的优点；所制备的膜替代物在保护膜组织天然结构和性能的同时彻底去除细胞成分和其他抗原成分，生物相容性好、无免疫排斥、安全可靠、力学性能好，易于临床手术操作，能满足缺损修复的需要，疏松面有利于组织液的吸附、活性因子的富集、血管和细胞的长入，有促进组织再生功能；并具有与宿主融合快、可降解吸收、修复效果好的优点；经动物试验表明，使缺损得到完全修复，未见脑/脊液渗漏，未与脑组织发生粘连，未发现明显的排斥反应。

Description

硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置。

背景技术

硬脑膜和硬脊膜分别是大脑与颅骨、脊柱与脊髓之间重要的功能膜组织，具有相同的生物学特征和功能。硬脑膜贴附颅腔内面，与颅盖连结疏松，与颅底结合紧密；硬脑膜在脑神经出颅处向外延伸，移行而与神经的被膜结合，在枕骨大孔周缘向下延为硬脊膜。开放性创伤、炎症、肿瘤或其他脑颅脊柱疾病等均会引起硬脑/脊膜的损伤。硬脑/脊膜的破损往往又会引起癫痫、脊液外漏、颅内感染、脑膜膨出、脑功能障碍等病症。硬脑/脊膜成形术是解决硬脑/脊膜损伤的临床方式，需要采用移植替代物植入缺损部分进行修复。因此，硬脑/脊膜移植替代材料的研发至关重要。本申请中所称硬脑/脊膜即指硬脑膜和硬脊膜(硬脑膜和硬脊膜的功能和结构都是一致，硬脑膜是保护脑组织，硬脊膜是保护脊髓组织，二者连接为一体)。

目前采用自体筋膜移植修复硬脑/脊膜仍是临床应用的标准，但存在有来源受限、术后早期脑脊液渗漏发生率高、易粘连、供区不愈合等缺点。尸体来源的硬脑膜材料也曾被用于硬脑/脊膜修复，但由于捐献者少，一个材料仅能用于4～5例患者移植修复，市场化困难；更重要的是，尸体来源的材料具有引起病毒传染的高风险，如克雅氏病(CJD)。1987年自美国发现第一例因为采用尸体来源的硬脑膜而患CJD致死的患者，后又在全世界范围内陆续出现62名类似患者，美国食品药品监督管理局(FDA)对此类产品进行了严厉处置。

高分子聚合物材料也被大量地研究用于硬脑/脊膜修复，根据降解性能分为可降解高分子聚合材料和不可降解聚合材料，例如不可降解的聚四氟乙烯(PTFE)，可降解的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)等及其共聚物。中国专利文献101878048A公开了一种丙交酯/ε-己内酯共聚物人工硬脑膜的制造方法；美国专利20070233275公开了一种聚乳酸(PLA)/乙醇酸(GA)/己内酯(CL)三元共聚物硬脑膜修复材料的制备方法。无论是可降解或是不可降解的高分子聚合材料，均存在有以下缺陷：可降解聚合材料降解后往往会产生酸性微环境，引起严重的炎症反应，影响修复效果；不可降解的聚合材料对于受体来说永远是异物，易导致炎症反应、结缔组织增生包裹、感染、出血等。

Protasoni M.等(J Neurosurg 114：1723-1730，2011)研究了人体硬脑膜的胶原架构特征，发现人体硬脑膜具有五层结构：1)与颅骨接触的骨表面层(Bone surface layer)；2)外中间层(External Median Layer)；3)血管层(Vascular Layer)；4)内中间层(Internal Median Layer)；5)蛛网膜层(Arachnoid Layer)。每个结构层的胶原纤维具有特殊的取向和不同的搭配编制模式，具有不同的功能。这一发现对人工硬脑膜材料的研发具有重要的启发意义。因为动物膜组织同样具有类似的多层功能结构和胶原架构，以此开发硬脑/脊膜移植替代物是可行的。

大量的研究被用于开发异种脱细胞基质硬脑/脊膜修复材料。这类材料来源广泛，例如哺乳动物的皮肤组织、筋膜、心包膜、腹膜、隔膜、小肠粘膜等。现有的脱细胞基质材料的制备方法主要是通过脱细胞去抗原、或封闭抗原和交联固定等工艺完成。

美国专利5413798公开了一种硬脑膜替代材料的制备方法及其应用。该材料是以牛心包膜为原料，经过湿化学处理、漂白、轻洗、脱脂、冻干和灭菌等工艺制备。经动物试验显示该材料具有良好的生物相容性和硬脑膜修复效果，但是临床实验发现该材料仍有粘连现象发生。

中国专利申请200510120796.5公开了一种动物组织经过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂封闭抗原处理获得的可用于修复的生物型硬脑膜。尽管该专利宣称动物组织经过碱处理、脱脂、交联固定和封闭抗原处理，可以达到去抗原目的；但是，其对动物组织中的细胞如何处理没有说明，若只通过封闭抗原处理，则细胞成分引起免疫反应的风险是很大的；尽管通过交联固定可以改变材料的降解性能，达到“被动式”降解，但人体硬脑膜和动物膜组织都具有独特的多层结构，这样整体交联后势必造成不同结构层的趋同化，会引起一些功能的消退；此外，随着材料的降解，被封闭的抗原会再次裸露，有引起免疫排斥的危险。一些实验研究发现，这种经过交联固定处理的材料在动物体内长时间不降解，与组织再生并不匹配，生物相容性差。

总之，现有方法都需要采用各种化学试剂、交联剂、酶等脱细胞处理，在处理过程中会破坏材料的天然结构，降低使用性能，如材料的降解性能、力学性能等；或者脱细胞去抗原不彻底，或者材料植入体内后由于降解致使被封闭的抗原重新裸露，引起严重的免疫反应。大量临床实验发现，这类材料会与脑组织发生粘连，长期效果有待进一步验证。因此，现有的脱细胞去抗原技术还未达到理想要求。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法及其装置，使所制备的硬脑/脊膜移植替代物具有致密面和疏松面以及膜组织的天然结构，并有效去除细胞及抗原成分，其生物相容性好、无免疫排斥、使用安全可靠、柔韧力学性能好。

本发明所提出硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将膜组织在-20～-80℃温度下冷冻2～24小时，初步破碎膜组织中的细胞，在室温下解冻，如此反复冻融1～3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种；

步骤二、将冻融后的膜组织采用辗压进一步破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介，可以在常压、或是真空、或是压力的环境中进行；辗压的压力为5MPa～50Mpa，优化值为10MPa～20Mpa；所述液体媒介可以选择纯化水、生理盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)或是Tris缓冲液的任一种。

由于天然动物膜组织的表面结构一面疏松一面致密，具有不同的生理功能，在脱细胞去抗原处理时，保持其固有的结构特点至关重要；因此在去抗原处理前需通过交联固定对膜组织表面进行保护；

步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护：对膜组织的疏松面不交联，或是以＜2小时的紫外光照射交联；而对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合的方式；其中：

物理交联为2～12小时的紫外光照射，优化选择为4～6小时；物理交联也可以是有机溶剂脱水交联，所述的有机溶剂为乙醇、或丙酮、或异丙醇；

化学交联可以采用异氰酸盐类(HDI)、或酰基叠氮类(DPPA)、或醌类(NDGA)、或碳化二亚胺(EDC)、或环氧化合物(EC)及其低聚物、或聚乙二醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂；

交联剂的优化选择为EDC或D-核糖。采用EDC交联的方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与磷酸盐缓冲液(PBS)的混合溶液为溶媒，其中有机试剂占溶媒总体积的30～50％；再以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为稳定剂，EDC的浓度为5mM～20mM，NHS的用量是EDC的1/4～1/3，交联温度为2～10℃，交联时间16～36h；采用D-核糖交联的方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与水的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的60～80％，D-核糖浓度为0.3mM～3mM，交联温度为20～40℃，交联时间3～15天。

在交联固定处理时，对疏松面进行低强度的交联或不交联，对致密面的高强度交联，是通过交联方式、交联剂种类和浓度及时间的调整来完成。通过不同的交联方式及强度分别对膜组织的两个表面进行处理，以缓冲后续处理对膜结构的破坏。

步骤四、脱细胞去抗原：对交联后膜组织的两个表面采用不同方式脱细胞去抗原处理，疏松面的处理强度相对致密面要温和；

对膜组织的致密面，采用酸溶液、或碱溶液、或盐溶液、或酶溶液、或双氧水溶液，或是丙酮、异丙醇、乙醇的任一种溶剂进行脱细胞去抗原处理；其中，酸溶液为盐酸或硫酸，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；碱溶液为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；盐溶液为氯化钠或氯化钾，浓度为1～3M，处理时间0.5～2h；酶溶液为活力≥250U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥50KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥15KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；双氧水溶液的体积浓度为2％～30％，处理时间1～6h；丙酮、异丙醇、乙醇均为纯试剂。在处理中对于试剂和条件的具体选择，则视处理材料与处理效果的情况确定，而且该处理可以是单次处理，也可以是多次处理，并允许是多种试剂的联合处理或交替处理；混合处理如碱与盐、酸与盐、碱与双氧水等；交替处理如双氧水处理后采用高渗盐溶液处理，再进行碱处理等。

对膜组织的疏松面，采用低渗溶液，或弱酸溶液、或弱碱溶液、或酶溶液、或十二烷基硫酸钠(SDS)、或曲拉通(Triton)、或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)进行脱细胞去抗原处理；其中，低渗溶液为10～100mM浓度的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、或是浓度低于9g/L的盐溶液，处理时间2～24h；弱酸溶液为醋酸、或柠檬酸、或乳酸，浓度为0.1～0.5M，处理时间1～12h；弱碱溶液为碳酸钠、或碳酸氢钠、或碳酸钾、或碳酸氢钾，质量浓度为0.25～1％，处理时间1～12h；酶溶液为活力≥25U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥5KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥1.5KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；SDS溶液的浓度为5g/L～20g/L，处理时间12～48h；Triton溶液的浓度为1g/L～10g/L，处理时间12～24h；EDTA溶液的浓度为1g/L～10g/L，处理时间0.5～6h。在处理中对于试剂和条件的具体选择，则视处理材料与处理效果的情况确定，而且该处理可以是单次处理，也可以是多次处理，并允许是多种试剂混合处理或交替处理。

在本发明交联固定和脱细胞去抗原过程中，可辅以超声或震荡的方式处理；超声频率为20～100KHz，间隔1～2h处理一次，每次5～10min；震荡可以采用水浴或气浴摇床，转速80～200rpm，或间隔震荡、或连续震荡。

步骤五、致密面的纤维化修饰：采用磷酸盐与碱的混合溶液对膜组织致密面进行纤维化修饰处理；所述的磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸钾，浓度为0.1～0.5M，所述的碱为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙、或是氨水，浓度为0.01～0.1M；所述的混合溶液pH≥11，处理温度2～25℃，优化温度4～10℃，处理时间6～48小时，优化时间12～24小时；在混合溶液处理后，还可以再采用丙酮、乙醇、异丙醇等有机试剂进行处理，加强致密化效果。

尽管经过交联固定保护，但在脱细胞去抗原过程仍可能引起致密面胶原结构的变化，比如胶原纤维的松散和解构等。采用磷酸盐与碱的混合液对致密面进行纤维化修饰处理，改变材料中胶原纤维的微观构象和结构，使该面的胶原纤维化程度更高、纤维排列更密、取向程度更高。

步骤六、包装及灭菌：将所得产品经干燥、裁切、包装、灭菌后储存。为了在使用中更容易区分产品的两面，方便临床使用，可以在包装前对产品疏松表面进行碾压标记，从而区分产品的致密面和疏松面。

本发明制备方法中对膜组织两个表面分别处理所采用的装置，是由相同的两个容器对扣组成，容器的口径与膜组织的材料尺寸相匹配，两个容器之间通过对扣能固定膜组织材料，以插槽、或螺栓、或卡扣方式密封固定，在两侧分别注入不同液体时，使容器两侧的液体不会互通和渗漏；在两个容器上分别设有进出液导管，可以注入或排除溶液；封闭导管口后，采用震荡、超声等方式进行处理，处理完毕后再排出溶液。容器可以选择耐酸、碱及盐腐蚀的材料制作，如有机玻璃、聚丙烯、或聚四氟乙烯。

其特征还在于，在两个容器上分别设置进液导管和出液导管；进液导管和出液导管分别通过管路连接于循环泵，使两个容器内液体分别实现循环流动，流速控制在5～50mL/min，有利于交联固定和脱细胞去抗原处理。

与现有技术相比，本发明具有以下效果：1)制备方法简单、原料来源广泛且低廉，规模化生产可降低医疗成本；2)所采用的辗压方法操作简单，可以降低后续脱细胞去抗原处理的强度，有利于保护膜组织的天然结构；3)所采用先交联后脱细胞的处理方式，可以在保护膜组织天然结构和性能的同时彻底去除引起免疫反应的细胞成分和其他抗原成分，避免采用单一封闭抗原或直接去抗原方法潜在的抗原再次裸露或影响材料结构的弊端；也避免了先脱细胞再交联方法的材料毒性高、力学性能和降解性能难以兼顾的缺点；4)对膜组织两个表面采用分面处理方式，使所制备的膜替代物具有独特的表面功能结构，能够满足硬脑/脊膜缺损修复的需要；致密面能防止粘连以及脑/脊液渗漏，疏松面有利于组织液的吸附、活性因子的富集、血管和细胞的长入，具有促进组织再生功能；5)所制备的膜替代物生物相容性好、无免疫排斥、使用安全可靠、材料柔韧力学性能好，易于临床手术操作，与周围组织贴合好，易于缝合，不撕裂，或直接覆盖使用不用缝合；并具有与宿主融合快、可降解吸收、修复效果好的优点。

经动物试验表明，本发明制备的膜替代物植入2～3周后可与缺损周围组织完全融合，6～10周完全降解吸收，缺损得到完全修复，未见脑/脊液渗漏，未与脑组织发生粘连，未发现明显的排斥反应。

附图说明

附图1为本发明所设计膜组织分面处理装置的结构示意图；图中1和2分别为腔体I和腔体II，3为进液导管，4为出液导管，5为膜组织材料；

附图2为本发明方法所制备硬脑/脊膜替代物截面的电镜(SEM)照片，可见明显的双面结构，其中6为疏松面，7为致密面；

附图3为采用本发明实施例1所制备硬脑/脊膜替代物修复兔硬脑膜缺损术后2周取材的大体照片，可以看出硬脑膜上的两处缺损已经没有明显的缺损痕迹，材料已开始与周围组织融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生；图中圆圈标注位置为缺损修复区；

附图4为采用本发明实施例2所制备硬脑/脊膜替代物修复兔硬脑膜缺损术后4周取材的大体照片，可以看出硬脑膜上的两处缺损已无明显的缺损痕迹，材料已与周围组织融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生；图中圆圈标注位置为缺损修复区；

附图5为采用本发明实施例1所制备硬脑/脊膜替代物修复兔硬脑膜缺损术后2周取材的组织学(HE)染色结果照片，方框标注的是缺损边缘，显示有大量结缔组织生成，可见材料已与周围组织融合，与附图3结果一致。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。

实例中所采用的哺乳动物膜组织购于屠宰场，分离附带的脂肪等杂质后，采用PBS缓冲液或生理盐水清洗除去血色，再用超纯水清洗。

实例中使用的分面处理装置采用聚丙烯材料制备，单个腔体容积为0.8L，开口大小为12cm×12cm，开口处设有密封胶条，两个腔体相嵌，腔体两边设有卡扣或是螺栓，可以进一步密封固定膜材料；两种规格：①在两个容器上分别设有进出液导管；②分别设置有进液导管和出液导管，分别通过管路连接循环泵，使两容器内液体分别实现循环流动。

实例中的辗压装置为广州旭众食品机械公司生产的SZ-150型手动压面机，可以将其置入容器中，保证辗压辊浸入液体；也可以在辗压时采用喷淋液体的方式。当然，辗压也可采用其他挤压设备、或高压水枪冲击处理。

实施例1、

以牛心包膜、腹膜为原料，按以下步骤制备硬脑/脊膜移植替代物。

步骤一、冻融：经过预处理的膜组织，于-80℃下冷冻3h，取出在室温条件下解冻；再重复操作2遍，然后用PBS缓冲液或生理盐水清洗；

步骤二、辗压：采用辗压装置，控制辗压压力9±1MPa，转速2±1rpm，将经过冻融的膜组织在生理盐水中反复辗压5遍后，用超纯水冲洗；

步骤三、交联固定保护：将辗压后的膜组织分割成约12.5cm×12.5cm大小，置于分面处理装置的一侧容器开口处，把另一侧容器开口相对膜组织，开口处的密封胶条固定住膜组织，两个容器相嵌，扣上两侧的卡扣，保证密封效果。在疏松面一侧的容器腔体内注入生理盐水，在致密面一侧的容器腔体内注入交联混合溶液，4℃下以90rpm速度震荡交联16小时，然后注入PBS缓冲液冲洗膜组织表面，洗去残留的交联剂；在疏松面一侧采用紫外光照射交联2h；其中交联混合溶液为30％的乙醇与70％的磷酸盐缓冲液的混合，内含交联剂EDC 20mM，稳定剂NHS 5mM。

步骤四、脱细胞去抗原：将交联后的膜组织再次固定于分面处理装置，向疏松面一侧的容器腔体内注入含有6g/mL的氯化钠和1.5g/L的EDTA的Tris-HCl缓冲溶液，pH＝8.0；并向致密面一侧的容器腔体内注入1M的NaOH与3％的H₂O₂的混合溶液；室温下溶液循环处理16h，液体流速为10ml/min；辅以超声处理，每小时1次，每次5min，整个体系每4小时换液一次；然后分别用PBS液和超纯水冲洗膜组织。

步骤五、致密面纤维化修饰：向致密面一侧的容器腔体内注入含有0.1M的Na₂HPO₄和0.05M的NaOH的混合溶液，于4℃下处理14小时；拆开分面处理装置，分别用PBS缓冲液和超纯水清洗膜组织，漂洗去除残留盐分；

步骤六、包装及灭菌：将得到的膜组织经过冷冻干燥、对疏松面表面进行压花标记，然后裁切、封装后辐照灭菌，得到硬脑/脊膜移植替代物产品。

所制备膜产品的厚度为0.5～2mm(膜组织的厚度是不均匀的)，渗水率为零，缝线撕裂力不低于7N，复水时间小于10min，脂肪含量低于1％，羟脯氨酸含量大于10％，细菌内毒素低于2.15EU/件，无热原、无毒性；缝合不易撕裂、脱边，操作方便；用于兔硬脑膜缺损修复动物实验结果显示缺损修复良好，无粘连，无脑脊液渗漏(见附图3)。

实施例2、

以猪硬脑膜为原料，按以下步骤制备硬脑/脊膜移植替代物。

步骤一、冻融：经过预处理的膜组织，于-20℃下冷冻12h，取出在室温条件下解冻，再重复操作1遍，然后分别用PBS缓冲液和生理盐水清洗；

步骤二、辗压：采用辗压装置，控制辗压压力17±1MPa，转速7±1rpm，将经过冻融的膜组织在空气中反复辗压6遍后，用超纯水冲洗；

步骤三、交联固化保护：将辗压后的膜组织裁切成约12.5cm×12.5cm大小，置于分面处理装置的一侧容器开口处，把另一侧容器开口相对膜组织，两个容器相嵌，开口处的密封胶条固定住膜组织，扣上两侧的螺栓，通过旋紧保证密封效果。在疏松面一侧的容器腔体内泵入生理盐水，在致密面一侧的容器腔体内泵入浓度为3mM的D-核糖交联溶液(内含丙酮80％)，于37℃下以80rpm速度震荡交联3天；然后分别用PBS缓冲液和超纯水冲洗；

步骤四、脱细胞去抗原：向疏松面一侧的容器腔体内泵入浓度为0.1M的醋酸溶液，并向致密面一侧的容器腔体内泵入含有0.5M的NaOH和1.5％的H₂O₂的混合溶液，于室温下辅以震荡处理8h，震荡速度为90rpm，隔4h换液一次；最后分别用PBS液和超纯水冲洗膜组织；

步骤五、致密面纤维化修饰：向致密面一侧的容器腔体内泵入含有0.5M的K₃PO₄和0.1M的氨水的混合溶液，于4℃下处理8小时；用超纯水冲洗后，再注入丙酮溶剂，4℃下脱水处理16小时，隔8小时换液一次；最后采用抽真空方法去除残留丙酮；拆开分面处理装置，取出膜组织产品；

步骤六、包装及灭菌：将得到的膜材料产品经过冷冻干燥、裁切、封装后辐照灭菌，得到硬脑/脊膜移植替代物产品。

所制备的替代物产品厚度为0.1～0.5mm之间，渗水率为零，缝线撕裂力不低于5N，复水时间小于10min，脂肪含量低于1％，羟脯氨酸含量大于10％，细菌内毒素低于2.15EU/件，无热原，无毒性；缝合不易撕裂、脱边，也可以不缝合使用，操作方便；用于兔硬脑膜缺损修复动物实验结果显示缺损修复良好，无粘连，无脑脊液渗漏(见附图4)。

Claims

1.一种硬脑/脊膜移植替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将膜组织在-20～-80℃温度下冷冻2～24小时后，于室温下解冻，如此反复冻融1～3次；所述的膜组织为哺乳动物的心包膜、腹膜、隔膜、硬脑膜和小肠黏膜的任一种；

步骤二、将冻融后的膜组织采用辗压破裂细胞，辗压是以空气或是液体为环境媒介进行；辗压压力为5MPa～50Mpa；

步骤三、将辗压后的膜组织进行交联固定保护：对膜组织的疏松面不交联，或是以＜2小时的紫外光照射交联；对膜组织的致密面，采用物理交联或化学交联、或是二者复合方式；其中：物理交联为2～12小时的紫外光照射，或是采用乙醇、或丙酮、或异丙醇的脱水交联；化学交联是采用HDI、或DPPA、或NDGA、或EDC、或EC及其低聚物、或聚乙二醇为化学交联剂，或是采用葡萄糖、或核糖为生物交联剂，进行交联反应；

步骤四、脱细胞去抗原：对交联后膜组织的两个表面采用不同方式脱细胞去抗原处理，对疏松面的处理强度相对致密面要温和；

步骤五、致密面的纤维化修饰：采用磷酸盐与碱的混合溶液对膜组织致密面进行纤维化修饰处理；所述的磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸钾，浓度为0.1～0.5M，所述的碱为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙、或是氨水，浓度为0.01～0.1M；所述的混合溶液pH≥11，处理温度2～25℃，处理时间6～48小时；得到硬脑/脊膜移植替代物产品；在混合溶液处理后，允许再采用丙酮、乙醇、异丙醇有机试剂进行致密化处理；

步骤六、包装及灭菌：将所得产品经干燥、裁切、包装、灭菌后储存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，辗压压力为10MPa～20Mpa；所述液体媒介为纯化水、生理盐水、PBS缓冲液或是Tris缓冲液的任一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，物理交联的紫外光照射为4～6小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，化学交联剂为EDC或D-核糖；采用EDC的交联方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与磷酸盐缓冲液的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的30～50％；以NHS为稳定剂，EDC的浓度为5mM～20mM，NHS的用量是EDC的1/4～1/3，交联温度为2～10℃，交联时间16～36h；采用D-核糖的交联方法为，以乙醇、或异丙醇、或丙酮与水的混合溶液为溶媒，有机试剂占溶媒总体积的60～80％，交联剂浓度为0.3mM～3mM，交联温度20～40℃，交联时间3～15天。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中脱细胞去抗原的处理为：

对于膜组织的致密面，采用酸溶液、或碱溶液、或盐溶液、或酶溶液、或双氧水溶液，或是丙酮、异丙醇、乙醇的任一种溶剂进行脱细胞去抗原处理；其中，酸溶液为盐酸或硫酸，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；碱溶液为氢氧化钠、或氢氧化钾、或氢氧化锂、或氢氧化钙，浓度为0.5～2M，处理时间1～12h；盐溶液为氯化钠或氯化钾，浓度为1～3M，处理时间0.5～2h；酶溶液为活力≥250U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥50KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥15KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；双氧水溶液的体积浓度为2％～30％，处理时间1～6h；丙酮、异丙醇、乙醇均采用纯试剂；

对于膜组织的疏松面，采用低渗溶液，或弱酸溶液、或弱碱溶液、或酶溶液、或是SDS、或Triton、或EDTA进行脱细胞去抗原处理；其中，低渗溶液为10～100mM的Tris缓冲液、或是浓度低于9g/l的盐溶液，处理时间2～24h；弱酸溶液为醋酸、或柠檬酸、或乳酸，浓度0.1～0.5M，处理时间1～12h；弱碱溶液为碳酸钠、或碳酸氢钠、或碳酸钾、或碳酸氢钾，质量浓度为0.25～1％，处理时间1～12h；酶溶液为活力≥25U/mL的胰蛋白酶溶液、或活力≥5KU/mL的RNA酶溶液、或活力≥1.5KU/mL的DNA酶溶液，处理时间8～24h；SDS溶液的浓度为5g/L～20g/L，处理时间12～48h；Triton溶液的浓度为1g/L～10g/L，处理时间12～24h；EDTA溶液的浓度为1g/L10g/L，处理时间0.5～6h。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述对于致密面和疏松面处理为单次或是多次处理，允许多种试剂的联合处理或交替处理。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤三交联固定的化学交联和步骤四的脱细胞去抗原的过程中，辅以超声或震荡的处理；超声频率为20～100KHz，间隔1～2h处理一次，每次5～10min；震荡采用水浴或气浴摇床，转速80～200rpm，或间隔处理、或连续处理。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤六的包装前对产品疏松表面进行碾压标记。

9.一种实现权利要求1所述制备方法中对膜组织两个表面分别处理的装置，其特征在于，是由相同的两个容器对扣组成，容器的口径与膜组织的材料尺寸相匹配，两个容器之间通过对扣固定膜组织材料，密封固定后使容器两侧的液体不会互通和渗漏；在两个容器上分别设有进出液导管。

10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，在两个容器上分别设置进液导管和出液导管；进液导管和出液导管分别通过管路连接于循环泵。