CN108324990A - 一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织修复及其再生的生物领域，具体涉及一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。依次经过Tris‑Hcl溶液孵化、胰蛋白酶溶液作用、含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液孵化、含有乙二胺四乙酸及蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液清洗、含有十二烷基硫酸钠的Tris‑Hcl溶液孵化、酶解、PBS缓冲液清洗。通过本发明的脱细胞方法对骨材料进行脱细胞处理后，DNA几乎没有残留，而胶原纤维可以获得保留，这样的脱细胞骨材料保留了天然材料的细胞外基质，具有良好的细胞外微环境，生物相容性好。猪骨在解剖、生理、代谢和生物活性分子上都和人有极大的相似处，更适合作为骨组织工程材料。

Description

一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法
技术领域
本发明属于组织修复及其再生的生物领域，具体涉及一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。
背景技术
骨修复一直是临床上的难题，目前治疗骨缺损的方法以自体和异体骨组织为主。临床上自体骨移植存在取材难度大、创伤大等困难。异体骨修复存在抗原性强、免疫反应强、供体来源不足、操作复杂、周期长等问题。以脱细胞骨粉与生物可降解高分子材料为原料，可制备复合材料支架用于骨修复。细胞外基质含有正常组织所需的生长因子，从而实现组织的再生。现有方法制备的脱细胞骨粉存在免疫反应的风险。因此，需要提供一种新的方案来解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种骨材料脱细胞的方法及制备脱细胞骨粉的方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种骨材料脱细胞的方法，具体包括以下步骤：
（1）将骨粉放入Tris-Hcl溶液中孵化20-30h， 40-50℃；
（2）在浓度为0.2-0.3%的胰蛋白酶溶液中，恒温35-40℃，作用20-30小时；
（3）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；
（4）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；
（5）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；
（6）在浓度为30-70mM的Tris-Hcl ph7.3-7.7溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，恒温35-40℃，作用2-4小时；
（7）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；
（8）用含有过氧乙酸的PBS缓冲液中，室温清洗2-4小时；
（9）PBS缓冲液清洗。
步骤（1）、（3）、（5）中，所用的Tris-Hcl溶液为9-11mM PH7.8-8.2。
步骤（3）、（4）、（5）、（7）、（8）中，十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、过氧乙酸的浓度为0.08-0.12%。
步骤（4）、（7）中，在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次25-35分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml±10% aprotinin、1ug/mL±10%leupeptin、1mM±10% PMSF。通过蛋白酶抑制剂的优化选择配合，更有利于骨中蛋白质的留存。
步骤（6）中，所述氯化镁浓度为10mM±10%，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml±10%，DNA酶浓度为50U/ml±10%，RNA酶浓度为1 U/ml±10%。
步骤（9）中，PBS缓冲液清洗2次，每次30分钟，最后用PBS缓冲液40-50℃清洗24小时。
一种制备脱细胞骨粉的方法，包括以下步骤：
一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗；
二、冻干、冷冻研磨成骨粉；
三、采用上述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；
四、后处理为成品。
步骤二中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。通过这样设置的冻干研磨更有利于骨中蛋白质的留存。
另一种制备脱细胞骨粉的方法，包括以下步骤：
一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗，处理为0-1.5cm*0-1.5cm*0-1.5cm的块状骨；
二、采用上述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；
三、冻干、冷冻研磨成骨粉；
四、后处理为成品。
步骤三中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。通过这样设置的冻干研磨更有利于骨中蛋白质的留存。
本发明的有益效果如下：
1. 通过本发明的脱细胞方法对骨材料进行脱细胞处理后，DNA几乎没有残留，而胶原纤维可以获得保留，这样的脱细胞骨材料保留了天然材料的细胞外基质，具有良好的细胞外微环境，生物相容性好。
2. 猪骨在解剖、生理、代谢和生物活性分子上都和人有极大的相似处，更适合作为骨组织工程材料。
附图说明
图1是本发明脱细胞骨粉的SEM图；
图2是未脱细胞猪肋骨（a）和脱细胞猪肋骨（b）横切面的HE染色图；
图3是未脱细胞猪肋骨（a）和脱细胞猪肋骨（b）纵切面的HE染色图；
图4是本发明脱细胞骨粉DNA定量检测图；
图5是未脱细胞猪肋骨和脱细胞猪肋骨Masson三色染图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本发明。
实施例一：
1．制备骨粉：
取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗。将块状猪肋骨放入冷冻干燥机冻干5小时，再用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为25转每秒，时间为20分钟。
2．制备脱细胞骨粉：
脱细胞步骤如下：
步骤一：骨粉在浓度为10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中孵化24h，恒温45℃；
步骤二：在浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液中，恒温37℃，作用24小时；
步骤三：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mM PH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；
步骤四：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin、1ug/mL leupeptin、1mM PMSF；
步骤五：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mM PH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；
步骤六：在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶。所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1 U/ml，恒温37℃，作用3小时；
步骤七：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin、1ug/mL leupeptin、1mM PMSF；
步骤八：用含有0.1%过氧乙酸的PBS室温清洗3小时；
步骤九：PBS清洗2次，每次30分钟，最后PBS45℃清洗24小时。
骨粉与脱细胞溶液的体积比为1:8；步骤一、二、三、四、五、六、七中，应置于四维旋转混合仪中脱细胞。
采用冷冻干燥的方式进行后处理，得到脱细胞骨粉。
3．脱细胞骨粉的抗原成分定量检测
对脱细胞骨粉进行DNA定量检测，检测结果如图4所示，脱细胞骨粉DNA定量检测几乎不含有DNA成分，去除率超过97%。
4．采用冷冻干燥的方式进行后处理，得到脱细胞骨粉，封装备用。
实施例二：
1．制备脱细胞骨：
取材：取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗，制备1*0.5*0.5cm的块状骨；
脱细胞步骤如下：
步骤一：在浓度为10mM的Tris-Hcl ph8.0溶液中孵化24h，恒温45℃；
步骤二：在浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液中，恒温37℃，作用24小时；
步骤三：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mM PH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；
步骤四：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin、1ug/mL leupeptin、1mM PMSF；
步骤五：在浓度为0.1%十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液（10mM PH8.0）中，恒温45℃，孵化24小时；
步骤六：在浓度为50mM的Tris-Hcl ph7.5溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶。所述氯化镁浓度为10mM，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml，DNA酶浓度为50U/ml，RNA酶浓度为1 U/ml，恒温37℃，作用3小时；
步骤七：在浓度为0.1%乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次30分钟。所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml aprotinin、1ug/mL leupeptin、1mM PMSF；
步骤八：用含有0.1%过氧乙酸的PBS室温清洗3小时；
步骤九：PBS清洗2次，每次30分钟，最后PBS45℃清洗24小时。
块状骨与脱细胞溶液的体积比为1:4；步骤步骤一、二、三、四、五、六、七中，应置于四维旋转混合仪中脱细胞。
2．脱细胞骨的组织学评价：
将脱细胞猪肋骨横、纵切面的HE染色放大20倍观察细胞及细胞核残留情况，已无细胞核及细胞存在。
对脱细胞猪肋骨进行Masson三色染，脱细胞骨中无细胞核存在，仍存留胶原纤维。
3．制备脱细胞骨粉：
将块状猪骨放入冷冻干燥机冻干5小时，再用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为25转每秒，时间为20分钟。
4．骨粉封装备用。
以上所述仅为本发明的实施例，并非用来限制本发明的保护范围；本发明的保护范围由权利要求书中的权利要求限定，并且凡是依发明所作的等效变化与修改，都在本发明专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种骨材料脱细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）将骨粉放入Tris-Hcl溶液中孵化20-30h， 40-50℃；
（2）在浓度为0.2-0.3%的胰蛋白酶溶液中，恒温35-40℃，作用20-30小时；
（3）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；
（4）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；
（5）在含有十二烷基硫酸钠的Tris-Hcl溶液中，恒温40-50℃，孵化20-30小时；
（6）在浓度为30-70mM的Tris-Hcl ph7.3-7.7溶液中，加入氯化镁、牛血清白蛋白、DNA酶和RNA酶，恒温35-40℃，作用2-4小时；
（7）在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗；
（8）用含有过氧乙酸的PBS缓冲液中，室温清洗2-4小时；
（9）PBS缓冲液清洗。
2.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（1）、（3）、（5）中，所用的Tris-Hcl溶液为9-11mM PH7.8-8.2。
3.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）、（5）、（7）、（8）中，十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、过氧乙酸的浓度为0.08-0.12%。
4.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（4）、（7）中，在含有乙二胺四乙酸的PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂清洗2次，每次25-35分钟，所述蛋白酶抑制剂为10KIU/ml±10% aprotinin、1ug/mL±10% leupeptin、1mM±10% PMSF。
5.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述氯化镁浓度为10mM±10%，牛血清白蛋白浓度为50ug/ml±10%，DNA酶浓度为50U/ml±10%，RNA酶浓度为1 U/ml±10%。
6.根据权利要求1所述的骨材料脱细胞的方法，其特征在于：步骤（9）中，PBS缓冲液清洗2次，每次30分钟，最后用PBS缓冲液40-50℃清洗24小时。
7.一种制备脱细胞骨粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗；
二、冻干、冷冻研磨成骨粉；
三、采用权利要求1-6任一项所述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；
四、后处理为成品。
8.根据权利要求7所述的制备脱细胞骨粉的方法，其特征在于：步骤二中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。
9.一种制备脱细胞骨粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、取新鲜猪骨去除软组织及骨膜，冲洗，处理为0-1.5cm*0-1.5cm*0-1.5cm的块状骨；
二、采用权利要求1-6任一项所述的骨材料脱细胞的方法进行脱细胞；
三、冻干、冷冻研磨成骨粉；
四、后处理为成品。
10.根据权利要求9所述的制备脱细胞骨粉的方法，其特征在于：步骤三中，冻干、冷冻研磨成骨粉的具体过程为：将骨放入冷冻干燥机冻干至少5小时，用超低温冷冻研磨机研磨，研磨频率为18-28转每秒，时间为15-40分钟。
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