CN109400698A - 低内毒素胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭露一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。所述制备方法包含以下步骤：提供动物皮肤；去除动物皮肤的残余脂肪组织及肌肉组织；以碱性溶液膨胀动物皮肤；刨除动物皮肤的上下表面；以含有水解酶的溶液水解动物皮肤；以盐类溶液析出低内毒素胶原蛋白；以及以醇类溶液清洗低内毒素胶原蛋白。

Description

低内毒素胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明有关于一种胶原蛋白的制备方法，特别是有关于一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。

背景技术

内毒素为格兰阴氏菌细胞壁表面的一种成分，其被称为脂多糖(lipopolysaccharide)，只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才会被释放出来。脂多糖分子由特异性多糖、核心多糖和脂质A三部分构成。脂质A是内毒素的主要毒性组分。不同的革兰氏阴性细菌的脂质A结构基本相似。因此，凡是由革兰氏阴性菌引起的感染，虽菌种不一，各菌的内毒素性效应大致相同。其主要会在人体内引起发热、白细胞增多、微循环障碍、休克等临床症状。

在医疗级胶原蛋白的产业中，内毒素的含量即决定了胶原蛋白的质量及应用层次，也即决定了医疗级胶原蛋白是否可做为植入医疗器械的使用范围。

一般而言，在胶原蛋白材料上的内毒素，主要来自于动物组织上残留的微生物、吸附于动物皮肤组织表面的内毒素、以及制程中微生物污染所产生的内毒素等。内毒素在与蛋白质或其它成份吸附后，其脱附的条件相当不容易。传统上常用干热灭菌法(dry heatsterilization)来去除耐热性材料的内毒素，其主要是将要去除内毒素的物品曝露于250℃的环境2小时，来进行内毒素的去除；但遇高温会产生热分解反应的热稳定性不佳的材料，无法以上述方法来进行内毒素的去除。因此，如胶原蛋白等生物高分子常用透析法来移除胶原蛋白溶液内的内毒素。透析法的最大困难在于透析的过程中，胶原蛋白溶液的黏度不能过高，因此在透析前，必需要将被透析溶液进行高倍率的稀释，而在完成透析后再做浓缩程序，以提高溶液的浓度。此透析程序不但非常耗时、耗能又耗料，也大大降低了低内毒素胶原蛋白的产能，因而使得生产的成本倍数的增加。

发明内容

鉴于上述公知技术的问题，本发明的目的就是在提供一种利用物理与化学手段来生产低内毒素胶原蛋白的方法。

根据本发明的一个目的，提出一种低内毒素胶原蛋白的制备方法，其包含以下步骤：提供动物皮肤、将动物皮肤的残余脂肪组织及肌肉组织去除、以碱性溶液或缓冲溶液膨胀动物皮肤、刨除动物皮肤的上下表面、以含有水解酶的溶液水解动物皮肤、以盐类溶液析出低内毒素胶原蛋白、以及以醇类溶液清洗低内毒素胶原蛋白。

优选地，刨除动物皮肤的步骤刨除动物皮肤的上下表面约0.2mm至约0.5mm。

优选地，水解酶可选自于胃蛋白酶(pepsin)、胶原蛋白水解酶(collagenase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胜肽酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)、木瓜蛋白酵素(papain)及其任意组合。

优选地，盐类溶液可选自于碱金属磷酸盐溶液、碱金属卤化物溶液及其任意组合。

优选地，醇类溶液可包含乙醇、异丙醇或其组合。

优选地，在去除步骤、水解步骤、盐析步骤及醇洗步骤中使用微生物生长抑制溶液。

优选地，微生物生长抑制溶液可选自于醇类溶液、酸性溶液、碱性溶液、高渗透压溶液及其任意组合。

优选地，刨除动物皮肤的步骤在常温下进行。

优选地，膨胀动物皮肤的步骤将该动物皮肤膨胀至1.2倍至2.1倍的范围内。

优选地，碱液或缓冲溶液的pH值在11～13.5的范围内。

综上所述，根据本发明的低内毒素胶原蛋白的制备方法，可具有下述优点中的一个或多个：

(1)本发明的制备方法不需经高温加热，可在不破坏胶原蛋白高分子下制备低内毒素胶原蛋白。

(2)本发明的制备方法不需经过透析程序即可制备低内毒素胶原蛋白，因此可以缩短制程时间并节省原料及能源消耗，以降低生产成本，增加生产效率。

附图说明

图1是为根据本发明实施例的低内毒素胶原蛋白的制备方法的流程图。

具体实施方式

参照图1，其为根据本发明实施例的低内毒素胶原蛋白的制备方法的流程图。如图1所示，本发明的低内毒素胶原蛋白的制备方法包含以下步骤：提供动物皮肤(步骤S101)；去除残余脂肪组织与肌肉组织(步骤S103)；膨胀动物皮肤(步骤S105)；刨除部分动物皮肤(步骤S107)；水解动物皮肤(步骤S109)；盐析(步骤S111)；以及醇洗(步骤S113)。

在步骤S101中，所提供的动物皮肤可利用相关领域的技术人员所习知的技术，取自于其外皮系统包括皮肤及皮肤衍生物的脊椎动物，其包含但不限于牛、猪、马、羊、鸡、鸭、火鸡、鹅、鲸鱼或者鲨鱼等畜类或鱼类。

在实施例中，所提供的动物皮肤可为其表皮组织已利用人工或机械方式移除的皮下组织。

在步骤S103中，在移除动物皮肤的表皮组织后，可以机械(例如去肉机)或人工的方式去除皮下组织上残余的脂肪组织及肌肉组织。在去除残余脂肪组织及肌肉组织的过程期间，可使用微生物生长抑制溶液，以将皮下组织保持在无内毒素及微生物的状态。其中微生物生长抑制溶液可选自相关领域的技术人员所习知的各种微生物生长抑制溶液，包含但不限于：醇类溶液、酸性溶液、碱性溶液、高渗透压溶液及其任意组合。

在步骤S105中，利用碱性溶液将动物皮肤膨胀至原本的1.2倍至2.1倍的范围内。此步骤可同时借由碱性溶液再次洗去胶原蛋白以外的其它杂质。所述的碱性溶液的pH值在11～13.5的范围内。当pH值在11以下时，无法在此步骤中同时有效地洗去胶原蛋白以外的其它杂质，且无法有效地膨胀动物皮肤。当pH值在13.5以上时，则可能会使蛋白质降解，从而使产率下降。碱性溶液的实例可包含但不限于碳酸钠、氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化镁及其任意组合。优选地，碱性溶液可为氢氧化钙。在一个实施例中，用来膨胀动物皮肤的碱性溶液是以与动物皮肤等重的水及以动物皮肤的重量为基础14wt％至16wt％的氢氧化钙所组成。

在另一个实施例中，可使用pH值在11～13.5的范围内的缓冲液代替碱性溶液。与使用碱性溶液的实施例不同之处在于，缓冲溶液的pH值稳定，且在膨胀动物皮肤的过程中不会进一步产生沉淀，不须进行习知的脱灰步骤，从而可进一步简化制造过程并减少制造成本。在一个实施例中，缓冲液包含磷酸。

在步骤S107中，利用片皮机、刨皮机或任何可移除大约0.2mm～0.5mm的动物皮肤的设备，在常温下刨除膨胀的动物皮肤的一部分。为了彻底清除残留在组织表面的微生物及吸附于动物皮肤组织表面的内毒素，需刨除动物皮肤暴露于外界环境的部分，例如，动物皮肤的上下表面，且刨除大约0.2mm～0.5mm，若刨除小于约0.2mm，则可能无法彻底清除残留于组织表面的微生物及吸附于动物皮肤组织表面的内毒素。考虑微生物及内毒素的清除效果及收产成本，优选地为刨除约0.2mm至约0.5mm。

在步骤S109中，将已去除残余脂肪组织及肌肉组织及刨除表皮上下表面的动物皮肤以水解酶水解(digestion)处理，借此制造无端肽胶原蛋白(atelopeptide collagen)。水解酶包含但不限于，胃蛋白酶(pepsin)、胶原蛋白水解酶(collagenase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、胜肽酶(peptidase)、蛋白酶A(proteinase A)、蛋白酶K(proteinase K)、胰蛋白酶(trypsin)、微生物蛋白酶(microbial proteases)、木瓜蛋白酵素(papain)及其任意组合。水解反应的条件视所使用的水解酶而定。例如，当使用胃蛋白酶时，水解反应可在pH值约1.0至约4.0、酶浓度在约0.5g/L至约5.5.0g/L、反应温度在0℃至20℃的条件下搅拌12～72小时进行。

在步骤S111中，将盐类溶液加入步骤S109所得的产物中，以进行盐析，获得低内毒素胶原蛋白，并以盐类溶液对所得的低内毒素胶原蛋白进行清洗，以除去未反应完全的蛋白水解酶、不想要的多醣体、多酞及步骤S109所用的溶液的残留。其中，所用的盐类溶液可选自于碱金属磷酸盐溶液、碱金属卤化物溶液及其任意组合。

在步骤S113中，以醇类溶液对所得的低内毒素胶原蛋白进行清洗并真空冷冻，以获得高纯度、高产量且低内毒素的胶原蛋白。所用的醇类可选自于乙醇、异丙醇及其任意组合。

下文中，通过以下提供的实例，进一步详细说明本发明。

实例1

将已移除表皮组织的4000～6000g的牛皮肤去除动物皮肤上残余的脂肪组织及肌肉后的组织后，以重量百分率约为13％的氢氧化钙溶液(水与氢氧化钙为100:14至约100:16的范围内)膨胀为原本的1.2倍，接着在室温下以MOSCONI公司，型号为3000mm的片皮机，自该皮肤的上下表面刨除0.5mm的厚度。

将自上述步骤获得的皮肤置于1000至3000ml的10％～20％异丙醇溶液中，以绞肉机绞粹成小块。加入12～20g的胃蛋白酶，接着加入480～720ml的冰乙酸将溶液之PH值调整为1.5～3.5后，在1℃至12℃下搅拌24～48小时以获得混合物。

将向上述混合物加入3600～5700ml的氯化钠溶液进行盐析，经过12～72小时静置后收集沉淀物，分别以3200～4800ml的异丙醇清洗所得沉淀物。清洗过的沉淀物在-15～-5℃下真空冷冻24～48小时后，干燥获得800～1600g的胶原蛋白1。

实例2

除了差异是将皮肤膨胀为原本的2.1倍及自皮肤的上表面刨除0.2mm的厚度以外，其它以与实例1相同的制备方法获得800～1600g的胶原蛋白2。

实例3

除了差异是将皮肤膨胀为原本的2.1倍以外，其它以与实例1相同的制备方法获得800～1600g的胶原蛋白3。

实例4

除了差异是自皮肤的上下表面刨除0.2mm的厚度以外，其它以与实例1相同的制备方法获得800～1600g的胶原蛋白4。

比较例1

除了差异是使用未移除表皮组织的4000～6000g的牛皮肤以外，其它以与实例1相同的制备方法获得650～780g的胶原蛋白5。

比较例2

除了差异是不刨除皮肤的上下表面以外，以与实例1相同的制备方法获得202～443g的胶原蛋白6。

比较例3

除了差异是不膨胀皮肤以外，其它以与实例1相同的制备方法获得512～810g的胶原蛋白7。

测试实例1至4以及比较例1至3所得之胶原蛋白之内毒素浓度，其结果示于以下表1。

表1

由以上表1可以看出，相较于比较例1及2，实例1～4具有较低的内毒素浓度，且相较于比较例1～3，实例1～4具有较高的产率。因此可证实如同本发明的实施例般移除表皮组织后，在碱性溶液中进行动物皮肤的表面进一步地刨除，可有效降低胶原蛋白浓度并维持胶原蛋白产率。本发明利用碱性溶液膨胀动物皮肤后刨除动物皮肤表面，在此情况下，由于碱性溶液为微生物生长抑制溶液的一种，因此可以在刨除过程之外进一步以碱性溶液降低动物皮肤表面上的内毒素，并抑止期间内毒素的生成。而膨胀动物皮肤的步骤可以在维持低内毒素的同时，提高胶原蛋白的产率，以避免不必要的成本耗损。

综上所述，本发明不需经高温加热及透析程序即可制备低内毒素胶原蛋白，因此，可在不破坏胶原蛋白高分子、缩短制程时间、节省原料及能源消耗、降低生产成本及增加生产效率的情况下制备低内毒素胶原蛋白。

虽然本发明已参考例示性实施例具体地示出及描述，但本发明所属技术领域的技术人员将理解，在不背离本发明权利要求的范围及其等效范围所定义的精神及范畴的情况下，可对本发明的实施例做出形式及细节的各种改变。

Claims (10)

1.一种低内毒素胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

提供动物皮肤；

去除所述动物皮肤的残余脂肪组织及肌肉组织；

以碱液或缓冲溶液膨胀所述动物皮肤；

刨除所述动物皮肤的上下表面；

以含有水解酶的溶液水解所述动物皮肤；

以盐类溶液盐析出低内毒素胶原蛋白；以及

以醇类溶液清洗所述低内毒素胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，刨除所述动物皮肤的步骤为刨除所述动物皮肤的上下表面约0.2mm至约0.5mm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水解酶选自于胃蛋白酶、胶原蛋白水解酶、胰凝乳蛋白酶、胜肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、微生物蛋白酶、木瓜蛋白酵素及其任意组合。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述盐类溶液选自于碱金属磷酸盐溶液、碱金属卤化物溶液及其任意组合。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇类溶液包含乙醇、异丙醇及其组合。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述去除步骤、所述水解步骤、所述盐析步骤及所述醇洗步骤中，使用微生物生长抑制溶液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述微生物生长抑制溶液选自于醇类溶液、酸性溶液、碱性溶液、高渗透压溶液及其任意组合。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，刨除所述动物皮肤的步骤在常温下进行。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，膨胀所述动物皮肤的步骤将该动物皮肤膨胀至1.2倍至2.1倍的范围内。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱液或所述缓冲溶液的pH值在11～13.5的范围内。