CN112778412A - 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。本发明通过在胶原蛋白原料处理环节中增加低温碱溶液处理步骤，在保证胶原蛋白活性不被破坏的前提下，制备获得低内毒素的胶原蛋白，该方法对内毒素去除效率高，制备的胶原蛋白内毒素含量显著低于医药行业标准(YY 0954‑2015)规定的0.5Eu/mL；并且本发明提供的方法操作简单方便，成本低，无需特殊的设备，即可除去内毒素，得到低内毒素的胶原蛋白。

Description

一种低内毒素胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于胶原蛋白制备领域，具体涉及一种低内毒素胶原蛋白的制备方法。

背景技术

胶原蛋白是人体含量最高的蛋白质。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成材料无可比拟的生物活性、生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等优点，在组织工程和药物输送等领域广为应用。但是在天然胶原蛋白提取制备过程中，若对内毒素的去除不彻底，会降低胶原蛋白材料的品质，限制胶原蛋白材料在生物医学领域的应用。

目前，研究人员通常采用酸溶酶解法制备胶原蛋白，常用的酸为冰醋酸，酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶等。为了使提取获得的胶原蛋白符合医药应用标准，必须将提取获得的胶原蛋白中的内毒素含量降低到0.5Eu/mL以下。而常用于去除内毒素的方法主要包括阴离子交换色谱法、亲和色谱法、分子筛法、液相分离法、吸附法、蒸馏法等。但是，上述方法均存在很多的缺陷，例如：阴离子交换色谱法对于溶液中存在其它带负电荷物质时的去除效果较差；亲和色谱法相对成本较高；液相分离法在去除内毒素后容易残留去污剂；吸附法对处理量有一定的限制，不利于大规模处理，且操作相对繁琐；蒸馏法的去除效果不佳。

也有一些专利和文献中报道了采用氢氧化钠去除反应容器或样品中内毒素的技术方案，例如，中国发明专利CN201611037916.X提供了一种去除生物制剂原料液以及反应金属杯上内毒素的方法，发明人通过联合高温处理(110-130℃，40-50min)和复合溶液(0.2-0.5M氯化钠溶液中逐滴加入0.1M氢氧化钠溶液，至pH7-8)处理方式，去除生物医药制剂原料液中的内毒素，并且，为了提高去除内毒素的效率，还需高温处理(80-100℃)；虽然这种方法可以较好地去除所述发明中生物制剂原料液中的内毒素，但是这种方法需要对原料液进行高温处理，然后再用含氢氧化钠的复合液处理上述原料液，由此导致原料液中残留大量的钠离子、氯离子。因此，该方法明显不适宜用于去除胶原蛋白中的内毒素，原因如下：①高温导致胶原蛋白变性、分解或失活；②研究人员通常采用碱水解法提取动物组织中的胶原肽，碱性处理条件会使胶原蛋白水解为胶原肽，由此可见，碱处理法普遍不能被用于胶原蛋白的提取过程中；③复合液会使原料液的盐浓度大幅增加，进而影响胶原蛋白质量和稳定性，即使采用额外的脱盐步骤也会使胶原蛋白收率大幅下降。

在中国发明专利CN201110220654.1中，发明人采用氢氧化钠(1.5g/L)处理羟乙基淀粉酸水解液，处理时间0.25-20h，该方法对羟乙基淀粉酸水解液中的内毒素的降低效果达到15％-80％，其中最优处理条件为1.5g/L终浓度氢氧化钠，处理时间2h，处理温度40℃；该技术方案中需要用盐酸溶液调整处理液pH值。该方法也不适宜用于去除胶原蛋白中的内毒素，原因如下：①连续两步碱处理(真空高浓度(29.5g/L)氢氧化钠水解处理-超滤-低浓度(1.5g/L)氢氧化钠处理)的技术方案，增加了操作难度，并且高浓度碱溶液容易导致胶原蛋白变性、分解或失活；②研究人员通常采用碱水解法提取动物组织中的胶原肽，而碱性处理条件会使胶原蛋白水解为胶原肽，由此可见，碱处理法普遍不能被用于胶原蛋白的提取过程中；③对胶原蛋白酶解液和胶原蛋白产品直接进行碱处理，会影响胶原蛋白质量和稳定性，使胶原蛋白收率大幅下降；④由该专利说明书记载可知，所述技术方案对内毒素的降低效率最高为80％，也就是说，即使采用该方法，也无法将胶原蛋白中的内毒素降低至医药行业标准规定的0.5Eu/mL以下。

因此，即使背负很高的处理成本，本领域的研究人员目前仍然选择采用阴离子交换色谱法、亲和色谱法、液相分离法等去除内毒素，以保证胶原蛋白中的内毒素含量符合医药行业标准。

针对上述技术问题，本发明提供了一种低内毒素胶原蛋白的制备方法，在胶原蛋白原料处理环节中增加低温氢氧化钠处理步骤，在保证胶原蛋白活性不被破坏的前提下，即使采用传统提取胶原蛋白的策略仍然可以得到低内毒素的胶原蛋白产品，该产品符合医药领域原料要求，可以被用于制备创面损伤修复产品，医学美容产品或化妆品等；并且，本发明技术方案具有内毒素去除效率高、操作简单方便，成本低，无需特殊的设备等优点。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种低内毒素胶原蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将原料预处理后经表面活性剂处理，和/或氧化剂处理，和/或消毒处理后，得原料粉末；

(2)在步骤(1)所述的原料粉末中加入碱溶液搅拌处理，除去碱溶液，水洗至中性，得低内毒素的原料粉末；

(3)采用酸溶酶解法处理步骤(2)所述的低内毒素原料粉末，得酶解液；

(4)灭活处理步骤(3)所述的酶解液后，盐析、透析、冷冻干燥，制得低内毒素胶原蛋白。

优选地，所述的原料为动物骨或筋腱时，所述步骤(1)中原料预处理后还包括脱脂和/或脱钙处理。

优选地，所述步骤(2)中的碱溶液为氢氧化钠溶液。

优选地，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.01-2.0M。

优选地，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1-0.5M。

优选地，所述步骤(2)中碱溶液处理的温度为4-30℃，时间为2-24h。

优选地，所述的温度为10-25℃，时间为4-20h。

本发明的另一目的在于提供一种低内毒素胶原蛋白，所述低内毒素胶原蛋白通过上述方法制备获得的。

本发明的另一目的在于提供一种低内毒素胶原蛋白在制备创面损伤修复产品，和/或医学美容产品，和/或化妆品中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种去除胶原蛋白提取原料中内毒素的方法，所述方法为：用碱溶液处理胶原蛋白的提取原料。

优选地，所述碱溶液为氢氧化钠溶液。

优选地，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.01-2.0M。

优选地，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1-0.5M。

优选地，所述的处理温度为4-30℃，处理时间为2-24h。

优选地，所述的处理温度为10-25℃，处理时间为4-20h。

本发明的有益效果是：①本发明通过在胶原蛋白原料处理环节中增加低温氢氧化钠处理步骤，在保证胶原蛋白活性不被破坏的前提下，最终得到低内毒素的胶原蛋白；②以本发明的技术方案提取获得的胶原蛋白中内毒素的含量显著低于医药行业规定的标准(0.5Eu/mL)，去除内毒素的效率较高；③本发明技术方案具有内毒素去除效率高、操作简单方便，成本低，无需特殊的设备等优点。

附图说明

图1内毒素含量的标准曲线

图2本发明实施例制备的低内毒素胶原蛋白SDS-PAGE图；

图3本发明实施例制备的低内毒素胶原蛋白圆二色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

以下实施例中所述的内毒素是革兰氏阴性菌的菌体中存在的毒性物质的总称，是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”，单位Eu/mL。其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质A。

以下实施例中所述的胶原蛋白是由三条具有左手螺旋结构的多肽链相互缠绕形成右手螺旋结构，属于生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白。

以下实施例中所述的圆二色谱是用于表征蛋白的二级结构和三级结构的常用方法，其中，胶原在225nm处具有正峰，在205nm处具有负峰，且吸收值与X轴的交点处于215nm。

以下实施例中所述的解旋温度是指胶原分子三股螺旋解旋一半时的温度，其中天然胶原蛋白的解旋温度一般为37℃左右。

实施例1低内毒素胶原蛋白的制备工艺1

将牦牛筋腱进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用10％正丁醇将粉碎后的小块进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的沉淀用0.5M盐酸进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的组织沉淀浸泡于0.1M的氢氧化钠溶液中，25℃搅拌处理4h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋进行透析，透析结束后，冷冻干燥，最终得到低内毒素含量的胶原蛋白。

实施例2低内毒素胶原蛋白的制备工艺2

将牦牛筋腱进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用10％正丁醇将粉碎后的小块进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的沉淀用0.5M盐酸进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的组织沉淀浸泡于0.5M的氢氧化钠溶液中，10℃搅拌处理2h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋进行透析，透析结束后，冷冻干燥，最终得到低内毒素含量的胶原蛋白。

实施例3低内毒素胶原蛋白的制备工艺3

将牦牛筋腱进行清洗，去除异物，粉碎成小块；用10％正丁醇将粉碎后的小块进行脱脂，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的沉淀用0.5M盐酸进行脱钙，脱钙结束，取沉淀，水洗至中性；将前步中得到的组织沉淀浸泡于0.01M的氢氧化钠溶液中，20℃搅拌处理10h，取沉淀，水洗至中性；用含1g/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取胶原蛋白，得到粗的胶原蛋白提取液；调pH至中性，进行酶灭活；8-14kDa透析袋进行透析，透析结束后，冷冻干燥，最终得到低内毒素含量的胶原蛋白。

实施例4内毒素含量测定

采用ToxinSensor^TM显色法LAL内毒素检测试剂盒，并按试剂盒说明书所述的方法，得到内毒素含量的标准曲线为：y＝0.5038x+0.3387(R²＝0.9483)，结果如图1所示；对实施例1-3中胶原蛋白提取过程中各操作步骤后的内毒素含量进行测定，该测定方法灵敏可靠，测定结果见下表1-3(已知医疗器械中内毒素含量要求为<0.5Eu/mL)。

表1实施例1中各步骤内毒素含量检测结果

表2.实施例2中各步骤内毒素含量检测结果

表3.实施例3中各步骤内毒素含量检测结果

从表1-3可以看出：对胶原蛋白的提取原料进行低温碱处理后，能够显著降低原料中内毒素的含量，使原料中内毒素的含量低于检测限(0.5Eu/mL)；并且，以本发明所述的方法提取制备的胶原蛋白，能够显著降低胶原蛋白产品中内毒素的含量，使胶原蛋白产品中内毒素的含量低于检测限(0.5Eu/mL)，获得一种安全低毒的胶原蛋白。

实施例5胶原蛋白结构鉴定

5.1凝胶电泳实验

采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对上述实施例制备的低内毒素胶原蛋白的结构进行分析。

依照本发明上述实施例所述方法制备的胶原蛋白的凝胶电泳图如图2所示，在分子量为100kDa附近有两条α带，分别为α1和α2，在分子量为200kDa附近有两条β带，分别为β11和β12，其中β11和β12为两条α链形成的二聚体肽链，而且在低分子量处没有多余的条带，本发明制备的低内毒素胶原蛋白是由三条具有左手螺旋结构的多肽链相互缠绕形成右手螺旋结构，属于典型的I型胶原蛋白结构，没有发生降解。

5.2圆二色谱实验

圆二色谱是用于表征蛋白的二级结构和三级结构的常用方法，其中在225nm处具有正峰，在205nm处具有负峰，且吸收值与X轴的交点处于215nm表示胶原蛋白的三级结构。对本发明制备的胶原蛋白胶原进行圆二色谱鉴定，结果如图3a所示，本发明制备的胶原蛋白在225nm左右处具有正峰，在205nm左右处具有负峰，且吸收值与X轴的交点处于215nm左右，符合胶原的特征性三股螺旋结构；同时，对胶原蛋白的解旋温度进行了测定，由图3b可知胶原的解旋温度为37℃，符合天然胶原蛋白的特点。

综上所述，本发明通过在胶原蛋白原料处理环节中增加低温碱溶液处理步骤，在保证胶原蛋白活性不被破坏的前提下，从源头上降低组织内的内毒素，去除效率高，能够使胶原蛋白产品中的内毒素含量降低到0.01Eu/mL以下，最终制备获得低内毒素的胶原蛋白；并且该方法具有操作简单方便、成本低，无需特殊的设备等优点。

需要说明的是，尽管，本发明的实施例以牛筋腱为原料提取制备低内毒素的胶原蛋白，但是，本方法同样适用于以其他动物组织为原料来制备低内毒素胶原蛋白。

Claims (10)

1.一种低内毒素胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将原料预处理后经表面活性剂处理，和/或氧化剂处理，和/或消毒处理后，得原料粉末；

(2)在步骤(1)所述的原料粉末中加入碱溶液搅拌处理，除去碱溶液，水洗至中性，得低内毒素的原料粉末；

(3)采用酸溶酶解法处理步骤(2)所述的低内毒素原料粉末，得酶解液；

(4)灭活处理步骤(3)所述的酶解液后，盐析、透析、冷冻干燥，制得低内毒素胶原蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原料为动物骨或筋腱时，所述步骤(1)中原料预处理后还包括脱脂和/或脱钙处理。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的碱溶液为氢氧化钠溶液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.01-2.0M。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1-0.5M。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中碱溶液处理的温度为4-30℃，时间为2-24h。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的温度为10-25℃，时间为4-20h。

8.一种如权利要求1-7任一所述的方法制备获得的低内毒素胶原蛋白。

9.如权利要求8所述的低内毒素胶原蛋白在制备创面损伤修复产品，和/或医学美容产品，和/或化妆品中的应用。

10.一种去除胶原蛋白提取原料中内毒素的方法，其特征在于，所述方法为：用碱溶液处理胶原蛋白的提取原料。

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