CN111087447B - 一种鳄鱼抗氧化肽复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种鳄鱼抗氧化肽复合物，所述鳄鱼抗氧化肽复合物包括：鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5；其中，按照所述鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别为0.1％‑2％、0.5％‑3％、0.1％‑2％、0.1％‑2％和0.5％‑5％，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量在800Da‑1500Da的范围内。所述鳄鱼抗氧化肽复合物能够有效清除DPPH·自由基、ABTS+·自由基及羟基(OH‑)自由基；所述鳄鱼抗氧化肽复合物对Lo2、HaCat细胞没有毒害作用，且对过氧化氢诱导的氧化损伤的HaCat细胞有修复功能。
Description
技术领域
本申请涉及生物制品领域，具体地，涉及一种鳄鱼抗氧化肽复合物及其制备方法和应用。
背景技术
鳄鱼(Crocodile)属脊椎类两栖爬行动物，有2亿多年的生命史，是迄今发现的最古老和最原始的动物之一，具有“活化石”之称。鳄鱼浑身是宝，具备很高的药用价值、食用价值和经济价值等。例如，鳄鱼肉含有丰富的蛋白质，且能化痰止咳、滋心养肺；鳄鱼骨可用于防治风湿骨痛、老年骨质疏松和小儿软骨症等；鳄鱼胆具有解热、平热、促进新陈代谢的功能，对治疗脂肪肝和肝硬化也有显著疗效；食用鳄鱼肝能解毒明目、养血益肝；鳄鱼皮可制作高级皮革等。如今，随着人工养殖技术的快速发展和日趋成熟，鳄鱼产业的可持续发展已经成为大趋势，如何更有效地开发利用鳄鱼副产物，提高鳄鱼产品的附加值，减少鳄鱼副产物带来的环境污染，已成为亟待解决的问题。
自英国科学家Harman提出自由基理论以来，人类就在不断寻找抗自由基、抗衰老药物或活性物质。目前，生产量最大的是化学抗氧化剂，但因其具备明显的毒副作用，导致其使用受到限制。而来源于食物蛋白的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，且分子量小、易吸收、活性强、安全性高，因而越来越受到人们的青睐，在医药、食品、保健品和化妆品等方面有广阔的应用前景。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
本申请的第一目的是鳄鱼产业废物的再利用方法。
本申请的第二目的是以鳄鱼产业副产物制备的鳄鱼抗氧化肽复合物，该鳄鱼抗氧化肽复合物可以应用到保健品、化妆品等领域。
所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量小(800Da-1500Da)，能够有效清除DPPH〃自由基、ABTS+〃自由基及羟基(OH-)自由基，且抗氧化稳定性强。
所述鳄鱼抗氧化肽复合物对Lo2、HaCat细胞没有毒害作用，且对过氧化氢诱导的氧化损伤的HaCat细胞有修复功能。
在本申请中，提及的鳄鱼为暹罗鳄人工饲养子二代，鳄鱼繁育饲养许可证：(国渔)水野驯繁字2012-5019号。
具体地，本申请提供一种鳄鱼抗氧化肽复合物，所述鳄鱼抗氧化肽复合物包括：鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5，
其中，鳄鱼抗氧化肽1的氨基酸序列SEQ ID NO.1：IDTSDHST
鳄鱼抗氧化肽2的氨基酸序列SEQ ID NO.2：SAFNPHEK
鳄鱼抗氧化肽3的氨基酸序列SEQ ID NO.3：LASFGEAVEH
鳄鱼抗氧化肽4的氨基酸序列SEQ ID NO.4：GDISNAQAIIHNEK
鳄鱼抗氧化肽5的氨基酸序列SEQ ID NO.5：DLSHGSAQIR。
在本申请中，按照所述鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别可以为0.1％-2％、0.5％-3％、0.1％-2％、0.1％-2％和0.5％-5％。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量可以在800Da-1500 Da的范围内。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物可以由所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5组成，
其中，鳄鱼抗氧化肽1的氨基酸序列SEQ ID NO.1：IDTSDHST
鳄鱼抗氧化肽2的氨基酸序列SEQ ID NO.2：SAFNPHEK
鳄鱼抗氧化肽3的氨基酸序列SEQ ID NO.3：LASFGEAVEH
鳄鱼抗氧化肽4的氨基酸序列SEQ ID NO.4：GDISNAQAIIHNEK
鳄鱼抗氧化肽5的氨基酸序列SEQ ID NO.5：DLSHGSAQIR。
在本申请中，按照鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别可以为0.1％-2％、0.5％-3％、0.1％-2％、0.1％-2％和0.5％-5％。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量可以在800Da-1500 Da的范围内。
本申请还提供所述鳄鱼抗氧化肽复合物的制备方法，所述制备方法包括：
(1)预处理：将去除皮和大块食用肉之后的鳄鱼躯干部分用超纯水洗净、滤纸吸干后，再用超纯水蒸煮；
(2)酶解：采用蛋白酶酶解步骤(1)蒸煮后的鳄鱼躯干部分，过滤，得鳄鱼抗氧化肽复合物酶解液；
(3)分离：将步骤(2)获得的鳄鱼抗氧化肽复合物酶解液离心分离，取上清液干燥，得到鳄鱼抗氧化肽复合物粉。
在本申请中，在步骤(1)中，可以按照去除皮和大块食用肉之后的鳄鱼躯干部分与水比例为1:15g/mL-20g/mL进行蒸煮。
在本申请中，在步骤(1)中，可以在60℃-100℃蒸煮。
在本申请中，在步骤(1)中，可以蒸煮0.5h-2h。
在本申请中，在步骤(1)中，可以按照去除皮和大块食用肉之后的鳄鱼躯干部分与水比例为1:15g/mL-20g/mL进行蒸煮；
任选地，可以在60℃-100℃蒸煮；
任选地，可以蒸煮0.5h-2h。
在本申请中，在步骤(2)中，所述蛋白酶可以选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、角蛋白酶和碱性蛋白酶中的任一种或更多种。
在本申请中，在步骤(2)中，所述蛋白酶酶与去除皮和大块食用肉之后的鳄鱼躯干部分的质量比可以为0.5-9:100。
在本申请中，在步骤(2)中，所述酶解的时间可以为1h-7h。
在本申请中，在步骤(2)中，所述酶解的温度可以为20℃-80℃。
在本申请中，在步骤(2)中，所述蛋白酶的灭活可以在50℃-120℃进行0h-3h。
在本申请中，在步骤(2)中，所述酶解的条件可以为：
所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、角蛋白酶和碱性蛋白酶中的任一种或更多种；
所述蛋白酶酶与去除皮和大块食用肉之后的鳄鱼躯干部分的质量比可以为0.5-9:100；
所述酶解的时间为1h-7h；
所述酶解的温度为20℃-80℃；
所述蛋白酶的灭活在50℃-120℃进行0h-3h。
在本申请中，在步骤(3)中，所述离心的条件可以为：室温环境下，任选地，5000rpm-15000rpm，任选地，离心5min-60min；
所述干燥可以为冷冻干燥。
在本申请中，所述制备方法还可以包括：将所述鳄鱼抗氧化肽复合物粉通过超滤、离子交换层析、凝胶柱层析和反向高效液相色谱进行纯化，得到所述鳄鱼抗氧化肽复合物。
在本申请中，所述超滤可以包括：将所述鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水，截留在2kDa-100kDa的范围内的分子量，冷冻干燥。
在本申请中，所述离子交换层析可以以10mM-30mM Tris-HCl(pH 6-11，含0.5M-2MNaCl)为洗脱液，流速1mL/min-10mL/min，紫外检测波长为220nm。
在本申请中，所述凝胶柱层析可以以超纯水为洗脱液，流速0.1mL/min-2mL/min，紫外检测波长为220nm。
在本申请中，所述反向高效液相色谱条件可以为：色谱柱为C18色谱柱，进样量为2μL-20μL，以体积比0-100:100乙腈:超纯水流动相线性洗脱，洗脱速度为0.2mL/min-2mL/min，紫外检测波长为220nm。
在本申请中，所述超滤可以包括：将所述鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水，截留在2kDa-100kDa的范围内的分子量，冷冻干燥；
任选地，所述离子交换层析可以以10mM-30mM Tris-HCl(pH 6-11，含0.5M-2MNaCl)为洗脱液，流速1mL/min-10mL/min，紫外检测波长为220nm；
任选地，所述凝胶柱层析可以以超纯水为洗脱液，流速0.1mL/min-2mL/min，紫外检测波长为220nm；
任选地，所述反向高效液相色谱条件可以为：色谱柱为C18色谱柱，进样量为2μL-20μL，以体积比0-100:100乙腈:超纯水流动相线性洗脱，洗脱速度为0.2mL/min-2mL/min，紫外检测波长为220nm。
在本申请中，在步骤(2)中，酶解条件可以为：蛋白酶为木瓜蛋白酶、酶添加量为3.0％(w/w)、底物浓度为6.5％(w/v)、酶解时间为4h、酶解温度为55℃、沸水浴灭活时间为15min。
在本申请中，在步骤(3)中，所述超滤可以包括：将鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水，依次经过截留分子量为100kDa、5kDa、2kDa的超滤膜进行分级，收集抗氧化性最强的组分，冷冻干燥。
在本申请中，所述离子交换层析可以为CaptoTM Q阴离子交换层析，以20mM Tris-HCl(pH9.0，含1M NaCl)为洗脱液，流速3.0mL/min，紫外检测波长为220nm，收集抗氧化性最强的洗脱组分，冷冻干燥。
在本申请中，所述凝胶柱层析可以为SuperdexTM Peptide 10/300GL柱层析，以超纯水为洗脱液，流速0.5mL/min，紫外检测波长为220nm，收集抗氧化性最强的洗脱组分，冷冻干燥。
在本申请中，所述反向高效液相色谱条件可以为：色谱柱为C18色谱柱，进样量为10μL，流动相为乙腈和超纯水，洗脱速度为0.8mL/min，紫外检测波长为220nm。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的制备方法包括如下步骤：
超纯水洗净、滤纸吸干后的鳄鱼躯干骨肉，加入15-20倍体积超纯水，高温蒸煮25-35min。采用木瓜蛋白酶，在酶解条件下(55℃，酶添加量3.00％(w/w)、底物浓度6.5％(w/v))酶解4h后，沸水浴灭活15min，再用4层纱布过滤，即得酶解液。将上述酶解液在常温环境下，经12000rpm离心30min，收集上清液，冷冻干燥，得到鳄鱼抗氧化肽复合物粉；
超滤：将鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水，依次经过截留分子量为100kDa、5kDa、2kDa的超滤膜进行分级，分别测定＜2kD的水解物、2kDa-5kDa的水解物、5kDa-100kDa的水解物和＞100kDa的水解物四个组分的ABTS+·自由基清除率，收集抗氧化性最强的洗脱组分，冷冻干燥；
阴离子交换层析：CaptoTM Q柱(HiTrapTM，5mL)提前用浓度为20mM的Tris-HCl(pH9.0)缓冲液充分平衡；将超滤后获得的冻干粉用超纯水复溶，配制成100mg/mL溶液，用0.45μm孔径微滤膜过滤除杂后，用2mL注射器上样，上样体积为2.0mL；上样完成后，再用20mMTris-HCl(pH 9.0，含0.05M NaCl)和20mM Tris-HCl(pH 9.0，含0.20mM NaCl)缓冲液分步洗脱；
葡聚糖凝胶层析：SuperdexTM Peptide 10/300GL柱提前用超纯水充分平衡；将阴离子交换层析分离后的冻干粉用超纯水复溶，配制成10mg/mL溶液，用0.45μm孔径微滤膜过滤除杂后，用2mL注射器上样，上样体积为0.5mL；上样完成后，再用超纯水进行洗脱；
反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化：色谱柱采用C18反相柱，进样量为10μL，含量约为10μg。流动相为超纯水和乙腈，洗脱条件为：0-5min：0体积％乙腈，5-12min：20体积％乙腈，12-17min：50体积％乙腈，17-22min：70体积％乙腈，22-30min：70-0体积％乙腈。洗脱速度为0.8mL/min，紫外检测波长为220nm。
本申请还提供一种鳄鱼抗氧化肽复合物，所述鳄鱼抗氧化肽复合物通过本申请的制备方法得到。
在本申请中，通过本申请的制备方法得到的鳄鱼抗氧化肽复合物可以包括：鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5，
其中，鳄鱼抗氧化肽1的氨基酸序列SEQ ID NO.1：IDTSDHST
鳄鱼抗氧化肽2的氨基酸序列SEQ ID NO.2：SAFNPHEK
鳄鱼抗氧化肽3的氨基酸序列SEQ ID NO.3：LASFGEAVEH
鳄鱼抗氧化肽4的氨基酸序列SEQ ID NO.4：GDISNAQAIIHNEK
鳄鱼抗氧化肽5的氨基酸序列SEQ ID NO.5：DLSHGSAQIR。
在本申请中，按照所述鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别可以为0.1％-2％、0.5％-3％、0.1％-2％、0.1％-2％和0.5％-5％。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量可以在800Da-1500 Da的范围内。
在本申请中，通过本申请的制备方法得到的鳄鱼抗氧化肽可以由所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5组成。
其中，鳄鱼抗氧化肽1的氨基酸序列SEQ ID NO.1：IDTSDHST
鳄鱼抗氧化肽2的氨基酸序列SEQ ID NO.2：SAFNPHEK
鳄鱼抗氧化肽3的氨基酸序列SEQ ID NO.3：LASFGEAVEH
鳄鱼抗氧化肽4的氨基酸序列SEQ ID NO.4：GDISNAQAIIHNEK
鳄鱼抗氧化肽5的氨基酸序列SEQ ID NO.5：DLSHGSAQIR。
在本申请中，按照鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别可以为0.1％-2％、0.5％-3％、0.1％-2％、0.1％-2％和0.5％-5％。
在本申请中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量可以在800Da-1500 Da的范围内。
本申请的制备方法是针对鳄鱼躯干骨肉这一特殊材料而进行的，首先目前做鱼类和大豆等多肽的工艺比较成熟，而用鳄鱼进行多肽生产的并不多。现有的鳄鱼肽制备工艺是根据鳄鱼的肉、血等具体组织进行设计，而这些鳄鱼产品本身附加值就比较高，本申请的制备方法是基于将一些高附加值的鳄鱼产品完成获取后，残余的鳄鱼躯干，主要为骨和肉的部分，进行多肽产品开发的技术。
通过本申请制备、分离纯化得到的鳄鱼抗氧化肽复合物，具备如下优点：
1.目前，随着鳄鱼人工养殖业的快速发展且日趋成熟，鳄鱼副产物的有效利用成为亟待解决的问题。本申请通过酶解法制备、分离纯化得到的鳄鱼抗氧化肽复合物，可以提高鳄鱼产品的附加值，减少环境污染；
2.本申请分离纯化的鳄鱼抗氧化肽复合物能够有效清除DPPH〃自由基、ABTS+〃自由基及羟基(OH-)自由基。表明其在抗氧化的开发应用方面有很高的价值，可作为功能性成分应用于保健品、化妆品等领域；
3.本发明分离纯化的抗氧化肽复合物对Lo2细胞和HaCat细胞均无细胞毒性，对过氧化氢诱导的氧化损伤的HaCat细胞有显著的修复功能；
4.本发明制备的鳄鱼抗氧化肽复合物，分子量小于2kDa，可以被人体直接吸收；且具备较好的热稳定性，经反复冻融、紫外照射、体外模拟胃肠消化后，该肽复合物的抗氧化活性基本不变，作为功能性成分应用于化妆品、保健品等领域使，可较好地保持抗氧化活性；
5.当pH值为2.0-7.0时，鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化能力随pH增大而增强；当pH值为7.0-9.0时，其抗氧化能力随pH的变化而基本保持不变。说明酸性环境对鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化能力有显著影响，而弱碱环境基本不影响它的抗氧化能力。
6.不同金属离子的不同浓度对鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化性有不同程度的影响。其中，当金属离子浓度为0.1-5.0mM时，K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+几乎不影响鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性；而随着Al3+、Cu2+和Fe3+浓度的增加，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性随之下降。当Al3+、Cu2+和Fe3+浓度分别达到5.0mM时，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性保持率分别为50.42％、35.92％及23.30％。因此，在鳄鱼抗氧化肽复合物加工及存储过程中，应尽量避免与Al3+、Cu2+和Fe3+接触。
7.在加工过程中，添加NaCl和蔗糖几乎不影响鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性；添加麦芽糖和葡萄糖时，随着浓度升高，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性保持率也随之下降，但变化不显著。
本申请的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本申请而了解。本申请的目的和其他优点可通过在说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，并不构成对本申请技术方案的限制。
图1为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物的清除自由基的能力。其中，A为DPPH·自由基清除能力，横坐标为不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(肽复合物的浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL)，纵坐标为DPPH·自由基清除率；B为ABTS·自由基清除能力，横坐标为不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(肽复合物的浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL)，纵坐标为ABTS·+自由基清除率；C为OH-自由基清除能力，横坐标为不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(肽复合物的浓度分别为4.0mg/mL、8.0mg/mL、12.0mg/mL、16.0mg/mL、20.0mg/mL)，纵坐标为OH-自由基清除率。
图2为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物对H2O2诱导的氧化损伤的人永生化表皮细胞HaCat的修复作用。其中，A为不同浓度过氧化氢H2O2对HaCat的损伤造模，横坐标为不同浓度的H2O2对鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(H202浓度分别为0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、1000μM)，纵坐标为细胞相对存活率；B为鳄鱼抗氧化肽复合物对HaCat细胞的氧化损伤的修复作用，横坐标为HaCat细胞经H202损伤后，不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(肽复合物的浓度分别为0、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL)。
图3为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物对人正常肝细胞Lo2增殖活性的影响。横坐标为不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(肽复合物的浓度分别为0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL)，纵坐标为细胞相对存活率。
图4为不同因素对本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化活性的影响。其中，A为温度对抗氧化性的影响。横坐标为不同温度的鳄鱼抗氧化肽复合物处理组(处理温度分别为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；B为pH值对抗氧化性的影响，横坐标为不同pH的鳄鱼抗氧化肽复合物的处理组(处理pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；C为不同金属离子对抗氧化性的影响，横坐标为不同浓度金属离子对鳄鱼抗氧化肽复合物的处理组(金属离子的浓度分别为0、0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；D为不同食品配料对抗氧化性的影响,横坐标为不同浓度食品配料对鳄鱼抗氧化肽复合物的处理组(食品配料的浓度分别为0、0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；E为紫外照射时间对抗氧化性的影响,横坐标为鳄鱼抗氧化肽复合物的紫外照射时间(照射时间分别为0min、20min、40min、60min、80min、100min、120min)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；F为冻融次数对抗氧化性的影响，横坐标为鳄鱼抗氧化肽复合物的冻融次数(次数分别为1次、2次、3次、4次、5次、6次)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率；G为体外模拟胃肠消化对抗氧化性的影响,横坐标为不同模拟方式(分别为对照、模拟胃消化和模拟胃肠消化)，纵坐标为清除ABTS·+自由基的活性保持率。
图5为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物经不同超滤膜分离纯化后各组分的抗氧化活性测定图。横坐标分别代表：鳄鱼抗氧化肽-1：＜2kDa；鳄鱼抗氧化肽-2：2-5kDa；鳄鱼抗氧化肽-3：5-100kDa；鳄鱼抗氧化肽-4：＞100kDa；纵坐标为各组分对ABTS·+自由基的清除率。
图6为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物经离子交换层析分离纯化的洗脱曲线及各组分的抗氧化活性测定图。图A：鳄鱼抗氧化肽-1经CaptoTM Q阴离子交换层析分离纯化图，横坐标为洗脱组分的体积，纵坐标为紫外检测波长为220nm的吸光值。图B：横坐标为图A对应的4个组分，纵坐标为各组分对ABTS·+自由基的清除率。
图7为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物经葡聚糖凝胶层析分离纯化的洗脱曲线及各组分的抗氧化活性测定图。图A：鳄鱼抗氧化肽-1D经葡聚糖凝胶层析色谱柱SuperdexTMPeptide 10/300GL分离纯化图，横坐标为洗脱组分的体积，纵坐标为紫外检测波长为220nm的吸光值。图B：横坐标为图A对应的3个组分，纵坐标为各组分对ABTS·+自由基的清除率。
图8为本申请的鳄鱼抗氧化肽复合物经RP-HPLC分离纯化的洗脱曲线。横坐标为洗脱组分的体积，纵坐标为紫外检测波长为220nm的吸光值。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本申请的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例中使用的仪器设备包括：IKA C-MAG HS7恒温磁力搅拌仪、Waters-e2695高效液相色谱、AKTAStart快速蛋白纯化分离系统、Newstyle NU1000制备型搞笑液相色谱。
实施例
实施例1
鳄鱼抗氧化肽复合物的制备，步骤如下：
100g超纯水洗净、滤纸吸干后的鳄鱼躯干骨肉，加入15-20倍体积超纯水(1500mL-2000mL)，高温蒸煮25min-35min。采用木瓜蛋白酶，在其最佳酶解条件下(55℃，酶添加量3.00％(w/w)、底物浓度6.5％(w/v))酶解4h后，沸水浴灭活15min，再用4层纱布过滤，即得鳄鱼抗氧化肽复合物酶解液。将上述酶解液在常温环境下，经12000rpm离心30min，收集上清液，冷冻干燥，得到鳄鱼抗氧化肽复合物粉。
实施例2
实施例1中得到的鳄鱼抗氧化肽复合物的分离、纯化
超滤：将鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水，依次经过截留分子量为100kDa、5kDa、2kDa的超滤膜进行分级，分别测定＜2kDa的水解物、2kDa-5kDa的水解物、5kDa-100kDa的水解物和＞100kDa的水解物四个组分的ABTS+·自由基清除率。结果如图5所示，可知组分鳄鱼抗氧化肽-1具有最高清除率，因此收集该组分，冷冻干燥，进行下一步的阴离子交换层析分离纯化。
阴离子交换层析：CaptoTM Q柱(HiTrapTM，5mL)提前用浓度为20mM的Tris-HCl(pH9.0)缓冲液充分平衡；将上述冻干粉用超纯水复溶，配制成100mg/mL溶液，用0.45μm孔径微滤膜过滤除杂后，用2mL注射器上样，上样体积为2.0mL；上样完成后，再用20mM Tris-HCl(pH 9.0，含0.05M NaCl)和20mM Tris-HCl(pH 9.0，含0.20mM NaCl)缓冲液分步洗脱。洗脱曲线如图6A所示分别收集留穿峰鳄鱼抗氧化肽-1A、鳄鱼抗氧化肽-1B和洗脱峰鳄鱼抗氧化肽-1C、鳄鱼抗氧化肽-1D四个组分，冷冻干燥，经HiPrepTM 26/10Desalting脱盐柱后测定各组分的ABTS+·自由基清除率。结果如图6B所示，可知组分鳄鱼抗氧化肽-1D具有最高清除率，因此收集该组分，冷冻干燥，进行下一步的葡聚糖凝胶层析分离纯化。在此过程中，紫外检测波长为220nm，上样和洗脱过程流速均为3.0mL/min。
葡聚糖凝胶层析：SuperdexTM Peptide 10/300GL柱提前用超纯水充分平衡；将上述冻干粉用超纯水复溶，配制成10mg/mL溶液，用0.45μm孔径微滤膜过滤除杂后，用2mL注射器上样，上样体积为0.5mL；上样完成后，再用超纯水进行洗脱。洗脱曲线如图7A所示，分别测定洗脱峰鳄鱼抗氧化肽-1DI、鳄鱼抗氧化肽-1DII和鳄鱼抗氧化肽-1DIII三个组分的ABTS+·自由基清除率。结果如图7B所示，可知组分鳄鱼抗氧化肽-1DI具有最高清除率，因此收集该组分，浓缩，进行下一步的反向高效液相色谱HPLC分离纯化。在此过程中，紫外检测波长为220nm，上样和洗脱过程流速均为0.5mL/min。
反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化：色谱柱采用C18反相柱，进样量为10μL，含量约为10μg。流动相为超纯水和乙腈，洗脱条件为：0min-5min：0％乙腈，5min-12min：20％乙腈，12min-17min：50％乙腈，17min-22min：70％乙腈，22min-30min：70％-0％乙腈。洗脱速度为0.8mL/min，紫外检测波长为220nm。
氨基酸序列测定：将收集得到的抗氧化组分通过浓缩离心系统浓缩后，用液相色谱与质谱连用(LC-MS/MS)方法测定其氨基酸序列，得到此抗氧化肽复合物含有如下肽段：IDTSDHST、SAFNPHEK、LASFGEAVEH、GDISNAQAIIHNEK及DLSHGSAQIR。
利用SDS凝胶电泳检测，鳄鱼抗氧化肽1-鳄鱼抗氧化肽5的含量分别为1.7％，4.5％，4.5％，1.3％，0.8％。
表1肽段1-肽段5的测序
| 序列名称 | 氨基酸顺序 | 蛋白来源 | 物种名 | 分子量/Da |
| SEQ ID NO.1 | IDTSDHST | 肌联蛋白 | 暹罗鳄 | 851 |
| SEQ ID NO.2 | SAFNPHEK | 血红蛋白α亚基 | 暹罗鳄 | 1064 |
| SEQ ID NO.3 | LASFGEAVEH | 血红蛋白β亚基 | 暹罗鳄 | 1030 |
| SEQ ID NO.4 | GDISNAQAIIHNEK | 纤维连接蛋白 | 暹罗鳄 | 1489 |
| SEQ ID NO.5 | DLSHGSAQIR | 层黏连蛋白 | 暹罗鳄 | 910 |
实施例3
实施例1中得到的鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化活性研究。
3.1.对DPPH·自由基的清除能力
利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率测定的方法研究体外抗氧化能力。取0.1ml不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物(0mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL)，加入0.1ml 0.2mM DPPH·溶液，混匀，避光静置30min后测定517nm紫外波长处的吸光值。结果如下表2所示：
DPPH·自由基清除率计算公式：
其中，Ac为0.1mL超纯水+0.1mL DPPH溶液的吸光值；Ai为0.1mL样品+0.1mL DPPH溶液的吸光值；Aj为0.1mL超纯水+0.1mL无水乙醇的吸光值。
表2 DPPH·自由基清除率
| 浓度(mg·mL<sup>-1</sup>) | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
| 清除率/％ | 0 | 36.30 | 49.52 | 60.72 | 70.14 | 77.43 | 81.89 |
3.2.对ABTS+·自由基的清除能力
利用2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)自由基清除率测定的方法研究体外抗氧化能力，方法如下所述：
配制ABTS+·储备液：将2.45mM过硫酸钾与7mM ABTS+混合，在室温、避光条件下静置12-16h。
配制ABTS+·工作液：将上述ABTS+·储备液用超纯水稀释，使其在30℃，734nm波长下的吸光值为0.70±0.02，即得到ABTS+·工作液。
取0.1ml不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物(0mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL)，加入0.1ml 0.2mM ABTS+·工作液，混匀，避光静置6min后测定734nm紫外波长处的吸光值。
结果如下表3所示：
ABTS+·自由基清除率计算公式：
其中，Ac为0.1mL超纯水+0.1mL ABTS溶液的吸光值；Ai为0.1mL样品+0.1mL ABTS溶液的吸光值；Aj为0.1mL超纯水+0.1mL超纯水的吸光值。
表3 ABTS+·自由基清除率
| 浓度(mg·mL<sup>-1</sup>) | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 3.0 |
| 清除率/％ | 0 | 45.44 | 77.64 | 86.33 | 97.88 | 99.64 | 99.84 |
3.3.对OH-自由基的清除能力
采用Fenton反应进行羟基自由基OH-清除能力的测定，研究体外抗氧化能力。
在反应体系中加入1.0mL 9mM硫酸亚铁溶液和1.0mL 9mM的水杨酸-乙醇溶液，然后加入不同浓度的鳄鱼抗氧化肽复合物(0mg/mL、4.0mg/mL、8.0mg/mL、12.0mg/mL、16.0mg/mL、20.0mg/mL)，最后加入1.0mL 8.8mM H202启动反应。混匀，37℃条件下孵育30min后，测定510nm紫外波长处的吸光值。结果如表4所示：
清除率计算公式：
其中，Ac为1.0mL硫酸亚铁+1.0mL水杨酸+1.0mL超纯水+1.0mL过氧化氢；Ai为1.0mL硫酸亚铁+1.0mL水杨酸+1.0mL样品+1.0mL过氧化氢；Aj为1.0mL硫酸亚铁+1.0mL水杨酸+1.0mL超纯水+1.0mL样品
表4羟基自由基清除率
| 浓度(mg·mL<sup>-1</sup>) | 0 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| 清除率/％ | 0 | 21.06 | 45.00 | 60.05 | 74.95 | 86.89 |
实施例4
实施例1中得到的鳄鱼抗氧化肽复合物对H2O2诱导的HaCat细胞的氧化损伤修复功
能
4.1.H2O2氧化损伤模型的建立
取处于对数生长期的人永生化表皮HaCat细胞，按每孔100μL细胞悬液接种于96孔板中，设置空白对照组和不同浓度H2O2(0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、500μM、1000μM)组，每组设置5个复孔。在37℃、5％CO2(v/v)细胞培养箱中培养12h，使细胞贴壁。用H2O2处理12h，每孔加入20μL 0.5mg/mL MTT(噻唑蓝)，相同条件培养箱中孵育4h后，再每孔加入150μL DMSO(二甲亚砜)，室温避光条件下震荡10-15min，测定490nm紫外波长处的吸光值。
细胞存活率计算公式：
结果如图2A所示，可知不同浓度H2O2(0μM、50、100μM、200μM、300μM、500μM、1000μM)对HaCat细胞的存活产生一定影响。HaCat细胞存活率随H2O2浓度升高而降低，呈现氧化损伤趋势。当H2O2浓度达到200μM时，细胞存活率为空白对照组的51.25％。因此，选择200μM H2O2作用于HaCat细胞12h，建立氧化损伤模型。
4.2.实施例1制备的鳄鱼抗氧化肽复合物对H2O2诱导的HaCat细胞存活率的影响
按上述方法建立HaCat细胞氧化损伤模型后，每孔加入200μL含不同浓度(0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL)鳄鱼抗氧化肽复合物的DMEM高糖培养基，在37℃、5％CO2(v/v)细胞培养箱中孵育12h。然后每孔加入20μL 0.5mg/mL MTT(噻唑蓝)，相同条件培养箱中孵育4h后，再每孔加入150μL DMSO(二甲亚砜)，室温避光条件下震荡10-15min，测定490nm紫外波长处的吸光值。
细胞存活率计算公式：
结果如图2B所示，可知不同浓度(0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL)鳄鱼抗氧化肽复合物(鳄鱼抗氧化肽复合物)对损伤的HaCat细胞呈现出一定的氧化损伤修复效果，且随着浓度的升高，细胞存活率上升，修复作用越明显。
实施例5
实施例1中得到的鳄鱼抗氧化肽复合物对人正常肝细胞Lo2的影响
取处于对数生长期的人正常肝细胞Lo2，按每孔200μL细胞悬液接种于96孔板中，设置不同浓度(0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL)鳄鱼抗氧化肽复合物处理组，每组设置5个复孔。在37℃、5％CO2(v/v)细胞培养箱中培养24h，使细胞贴壁。然后每孔加入20μL 0.5mg/mL MTT(噻唑蓝)，相同条件培养箱中孵育4h后，再每孔加入150μL DMSO(二甲亚砜)，室温避光条件下震荡10-15min，测定490nm紫外波长处的吸光值。
细胞存活率计算公式：
结果如图3所示，可知不同浓度(0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL)鳄鱼抗氧化肽复合物对Lo2细胞的存活率没有影响，说明鳄鱼抗氧化肽对人正常肝细胞Lo2没有毒害作用。
实施例6
不同因素对实施例1中得到的鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
6.1.温度对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
将鳄鱼抗氧化肽复合物(2mg/mL)分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃恒温孵育2h后，快速冷却至室温，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4A所示，可知在20℃-100℃环境下，鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化能力变化不显著，其ABTS+·自由基清除活性都保持在95％以上，说明鳄鱼抗氧化肽具有较好的热稳定性。
6.2.pH对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
分别用1M盐酸和1M氢氧化钠溶液将鳄鱼抗氧化肽复合物(2mg/mL)pH调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0后，室温静置1h，然后将pH调至7.0，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4B所示，可知当pH值为2.0-7.0时，鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化能力随pH增大而增强；当pH值为7.0-9.0时，其抗氧化能力随pH的变化而基本保持不变。说明酸性环境对鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化能力有显著影响，而弱碱环境基本不影响它的抗氧化能力。
6.3.金属离子对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
分别在鳄鱼抗氧化肽复合物溶液(2mg/mL)中添加0.1mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM的K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+金属离子，混匀，室温静置2h后，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
不同金属离子的不同浓度对鳄鱼抗氧化肽复合物的抗氧化性有不同程度的影响。其中，当金属离子浓度为0.1mM-5.0mM时，K+、Ca2+、Mg2+和Zn2+几乎不影响鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性；而随着Al3+、Cu2+和Fe3+浓度的增加，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性随之下降。当Al3+、Cu2+和Fe3+浓度分别达到5.0mM时，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性保持率分别为50.42％、35.92％及23.30％。因此，在鳄鱼抗氧化肽复合物加工及存储过程中，应尽量避免与Al3+、Cu2+和Fe3+接触。
6.4.食品配料对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
分别在鳄鱼抗氧化肽溶液复合物(2mg/mL)中添加0、2、4、6、8、10％w/v的NaCl、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，100℃保温20min后，快速冷却至室温，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4D所示，可知在加工过程中，添加NaCl和蔗糖几乎不影响鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性；添加麦芽糖和葡萄糖时，随着浓度升高，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性保持率也随之下降，但变化不显著。
6.5.紫外照射时间对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
将鳄鱼抗氧化肽溶液复合物(2mg/mL)置于紫外灯下20cm-30cm处，使紫外灯分别垂直照射，0min、20min、40min、60min、80min、100min、120min后，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4E所示，可见随着紫外照射时间的延长，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基清除活性的保持率随之下降，当紫外照射时间为120min时，其保持率为89.94％。说明紫外照射会降低鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除能力，但变化不显著。
6.6.冻融次数对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
将鳄鱼抗氧化肽复合物溶液(2mg/mL)，反复经-80℃冷冻，流动水解冻后，测定其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4F所示，可见在-80℃条件下，对鳄鱼抗氧化肽复合物进行反复冻融，探究其抗氧化活性的变化。结果显示，随着冻融次数增加，鳄鱼抗氧化肽复合物对ABTS+·自由基的清除活性仍保持在95％以上，说明鳄鱼抗氧化肽复合物可于低温贮藏并反复冻融。
6.7.体外模拟胃肠消化对鳄鱼抗氧化肽复合物活性的影响
模拟胃消化道酶系的消化过程：将鳄鱼抗氧化肽复合物粉复溶于超纯水中，配置成3％(w/w)溶液，用1M盐酸调节体系的pH值为2.0。加入胃蛋白酶(加量为鳄鱼抗氧化肽复合物的4％)，搅拌均匀后，在37℃恒温孵育2h。置于沸水浴中灭酶10min-15min，待其冷却后，于室温环境下，12000rpm，离心15-20min，冷冻干燥，测定该肽经胃蛋白酶消化后其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
模拟肠消化道酶系的消化过程：将模拟胃消化道酶系消化2h后的鳄鱼抗氧化肽复合物溶液，用0.9M碳酸氢钠将体系pH调节至5.3，再用1M氢氧化钠调至7.5，最后加入胰酶(加量为鳄鱼抗氧化肽复合物粉的4％)，搅拌均匀后，在37℃恒温孵育2h。置于沸水浴中灭酶10min-15min，待其冷却后，于室温环境下，12000rpm，离心15min-20min，冷冻干燥，测定该肽复合物经肠蛋白酶消化后其清除ABTS+·自由基的活性保持率。
抗氧化活性保持率公式如下：
其中，ABTS+·自由基清除率如实施例3。
结果如图4G所示，可见模拟胃肠消化对鳄鱼抗氧化肽复合物的ABTS+·自由基清除能力几乎没有影响，说明当该肽复合物作为功能性成分服用时，并不会影响其的抗氧化效果。
虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 福建鼍龙实业有限责任公司
<120> 一种鳄鱼抗氧化肽复合物及其制备和应用
<130> 011925079
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Asp Thr Ser Asp His Ser Thr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Ala Phe Asn Pro His Glu Lys
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Ala Ser Phe Gly Glu Ala Val Glu His
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Asp Ile Ser Asn Ala Gln Ala Ile Ile His Asn Glu Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Ile Arg
1 5 10
Claims (6)
1.一种鳄鱼抗氧化肽复合物，所述鳄鱼抗氧化肽复合物包括：鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5，
其中，鳄鱼抗氧化肽1的氨基酸序列SEQ ID NO.1：IDTSDHST；
鳄鱼抗氧化肽2的氨基酸序列SEQ ID NO.2：SAFNPHEK；
鳄鱼抗氧化肽3的氨基酸序列SEQ ID NO.3：LASFGEAVEH；
鳄鱼抗氧化肽4的氨基酸序列SEQ ID NO.4：GDISNAQAIIHNEK；
鳄鱼抗氧化肽5的氨基酸序列SEQ ID NO.5：DLSHGSAQIR。
2.根据权利要求1所述的鳄鱼抗氧化肽复合物，其中，按照所述鳄鱼抗氧化肽复合物的质量分数计，所述的鳄鱼抗氧化肽1、鳄鱼抗氧化肽2、鳄鱼抗氧化肽3、鳄鱼抗氧化肽4和鳄鱼抗氧化肽5的含量分别为0.1%-2%、0.5%-3%、0.1%-2%、0.1%-2%和0.5%-5%。
3. 根据权利要求1或2所述的鳄鱼抗氧化肽复合物，其中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物的分子量在800 Da-1500 Da的范围内。
4.权利要求1至3中任一项所述的鳄鱼抗氧化多肽复合物在制备抗氧化化妆品或者抗氧化功能食品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物清除DPPH·自由基、ABTS+·自由基和羟基（OH-）自由基中的任一种或更多种。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述鳄鱼抗氧化肽复合物修复氧化损伤。
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| 鳄骨胶原蛋白肽的制备及其功能的研究;曹兴梅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20190515;全文 * |
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