CN114426998A - 鳄鱼肽的制备方法及制备的鳄鱼肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及活性成分提取技术领域，尤其涉及鳄鱼肽的制备方法及制备的鳄鱼肽。本发明通过对鳄鱼皮和鳄鱼肉进行脱脂和脱杂蛋白后，采用8％的碱性蛋白酶对鳄鱼肉和鳄鱼皮进行酶解，灭酶离心后通过超滤膜过滤控制鳄鱼肽的相对分子量，干燥后制备鳄鱼肉多肽。所获得的鳄鱼肽对自由基DPPH，OH和超氧阴离子自由基的清除能力依次是85.4％、83.479％、75.976％。
Description
技术领域
本发明涉及活性成分提取技术领域，尤其涉及鳄鱼肽的制备方法及制备 的鳄鱼肽。
背景技术
鳄鱼有“活化石”之称，具有寿命最长、免疫力最强、终身不患癌症、 骨头最硬的特征。目前，已有许多学者利用生物酶解技术以沙丁鱼、油菜籽、 鲢鱼等多种原料制备了许多抗氧化活性多肽，鳄鱼肉中含人体8种必需氨基 酸，是优势的蛋白资源，除此之外，抗氧化肽是目前国内外研究较多的一种 生物活性肽，安全、稳定、高效，胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，由二个或 二个以上氨基酸组成——蛋白肽，人体的吸收是以肽的方式进行，食用蛋白 肽的吸收利用率可达100％，胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分，目 前肽主要由蛋白质水解得到胶原蛋白肽是胶原蛋白或明胶经过酶解，分子链 解体断裂得到的产物，含有胶原蛋白全部的氨基酸，肽是构成蛋白质分子的 结构片段，当肽中的氨基酸结构发生变化时，肽的生物性功能也会改变，因 此肽的种类是成千上万的，功能也有多样性，胶原蛋白肽具有抗氧化活性、 降血压活性、抗菌活性、促进骨健康活性和良好的吸湿保湿性，可修复修复 弹性蛋白纤维和内源性胶原蛋白，减轻因紫外线辐射而引起的损伤，具有重 要作用，充分利用胶原蛋白生产活性肽并提高其附加值既节约了资源，减少 环境污染，还能增加经济效益。
就目前对胶原蛋白肽的提取制备工艺在实际使用时，大都采用酶解，酸 解，碱解等单一方法进行胶原蛋白的提取，采用多种方式酶解时，无法针对 提取原料的分子量进行对应的方法选择，同时现有的提取方法对提取原料的 分子量不进行控制，从而使胶原蛋白肽的提取率低和提取后胶原蛋白活性低 下。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种高活性的鳄鱼肽的制 备方法及制备的鳄鱼肽。
本发明提供的鳄鱼肽的制备方法包括：
步骤1：鳄鱼的皮和肉碎化后，依次经NaCl溶液清洗、蒸馏水清洗、正 丁醇溶液清洗、蒸馏水清洗；
步骤2：清洗后的鳄鱼皮肉与水混合，经匀浆获得匀浆液；
步骤3：所述匀浆液经碱性蛋白酶与47℃，pH值为9.0酶解2h后，经灭 酶、离心取上清液；
步骤4：所述上清液经超滤后取滤液，获得鳄鱼肽，所述超滤的截留分子 量为2200Da。
所述鳄鱼皮肉碎化前，采用MDF-U71V超低温冰箱进行鳄鱼皮和鳄鱼肉 的冷藏。所述碎化包括采用XFB-200粉碎机进行鳄鱼皮和鳄鱼肉的剪碎处理。
步骤1中，所述NaCl溶液中NaCl的浓度为7.5g/100mL；鳄鱼皮肉与NaCl 溶液的质量-体积为1g:10mL；所述NaCl溶液清洗的条件为4℃搅拌12h。
步骤1中，所述正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为10％，鳄鱼皮肉与正 丁醇溶液的质量-体积为1g:10mL；所述NaCl溶液清洗的条件为4℃搅拌24h， 期间每8h更换新鲜的正丁醇溶液。
步骤1中，两个蒸馏水清洗步骤中，清洗的次数皆为3次。
步骤2中，水与鳄鱼皮肉的质量比为2:1。
步骤3中，所述碱性蛋白酶为0.8wt％的碱性蛋白酶溶液，所述碱性蛋白 酶溶液与匀浆液的体积比为1:20。所述酶解时加入NaHCO3调节pH至9.0。 所述灭酶的条件为95℃保持10min。所述灭酶使采用HH-6型数显恒温水浴锅 进行灭酶时温度控制。所述灭酶后，将溶液冷却至5℃。进行离心时采用X-12R 型高速冷冻离心机进行离心，离心速度为10000r/min,离心时间20min。
步骤4中，所述超滤后，还包括对未通过滤膜的部分进行旋转蒸发的步 骤；所述旋转蒸发温度为60℃，蒸发时间为25min。
本发明所述制备方法制得的鳄鱼肽。
本发明所述制备方法制得的鳄鱼肽在制备抗氧化产品中的应用。
本发明还提供了一种抗氧化的产品，其包括本发明所述制备方法制得的 鳄鱼肽。
本发明所述的抗氧化产品包括化妆品、食品、保健品或药品。
本发明还提供了一种抗氧化的方法，其为给予本发明所述的抗氧化产品。
本发明提供了一种高活性鳄鱼肽的制作工艺，具备以下有益效果：本发 明通过对鳄鱼皮和鳄鱼肉进行脱脂和脱杂蛋白后，采用8％的碱性蛋白酶对鳄 鱼肉和鳄鱼皮进行酶解，灭酶离心后通过超滤膜过滤控制鳄鱼肽的相对分子 量，干燥后制备鳄鱼肉多肽，通过酶解2h,加入NaHCO3调节pH至9.0，控制 鳄鱼肽相对分子质量为2200Da时，鳄鱼肽对自由基DPPH，OH和超氧阴离 子自由基的清除能力依次是85.4％、83.479％、75.976％，与其他条件下提取 物获得的多肽的抗氧化性存在显著优势p<0.05，具备作为天然抗氧化剂的潜 力，对相对分子质量的范围和酶解时间的有效控制，不仅提高了鳄鱼肉多肽 的抗氧化性，还有效保持鳄鱼肉多肽的生物活性和功能性成分。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供了鳄鱼肽的制备方法及制备的鳄鱼肽，本领域技术人员可以 借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不 脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与 组合，来实现和应用本发明技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来 将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示 这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的 要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个引用结构”限定的要素， 并不排除在包括要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
在进行酶解的过程中，每隔0.5h取样，高温灭酶，过滤，得到不同酶解 时间0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h和4.5h的酶解鳄鱼多肽液进行酶解实 验梯度，其他环境温度，pH均保持相同，反应物底物量保持相同，加入酶量 保持相同，进行酶解时间的观察，进行清除自由基DPPH的能力的对比实验， 发现在碱性蛋白酶酶解2h时，鳄鱼肽清除自由基DPPH的能力最强，达到 85.4％，远远高于鳄鱼肉浆清除自由基能力46.68％，且显著优于其他时间点 取样的鳄鱼肽。说明在适宜条件下，酶解蛋白成小分子肽有利于对自由基 DPPH清除能力的提高，有助于鳄鱼功效性提升。
但继续酶解鳄鱼蛋白，鳄鱼蛋白继续水解成更小分子，其清除自由基 DPPH能力降低。这一趋势说明鳄鱼肽在一定分子量范围内，多肽链具有较强 的清除自由基DPPH能力，酶解时间越长，鳄鱼肉多肽液相对分子质量逐渐 减小，其超氧阴离子自由基清除能力逐渐增加，考虑到鳄鱼肉多肽液的活性， 发现酶解时间在2h时，超氧阴离子自由基的清除能力高达75.976％，但是都 低于DPPH和OH自由基的清除能力，高于其他鱼肉自由基清除能力，与其 DPPH自由基、羟基自由基清除能力相呼应，说明相对分子质量过低，酶解时 间过长，其鳄鱼肉多肽液的生物活性反而不是最高，因此选用酶解时间为2h。
通过对鳄鱼皮和鳄鱼肉进行脱脂和脱杂蛋白后，采用8％的碱性蛋白酶对 鳄鱼肉和鳄鱼皮进行酶解，灭酶离心后通过超滤膜过滤控制鳄鱼肽的相对分 子量，冷冻干燥后制备鳄鱼肉多肽，通过酶解2h,加入NaHCO3调节pH至9.0， 控制鳄鱼肽相对分子质量为2200Da时，鳄鱼肽对自由基DPPH，OH和超氧 阴离子自由基的清除能力最强分别是85.4％、83.479％、75.976％，表现出较 好的抗氧化性，具备作为天然抗氧化剂的潜力，对相对分子质量的范围和酶 解时间的有效控制，不仅提高了鳄鱼肉多肽的抗氧化性，还有效保持鳄鱼肉 多肽的生物活性和功能性成分。
脱脂时鳄鱼皮和鳄鱼肉与10％正丁醇体积比1:10，脱脂环境温度为4℃时 搅拌24h脱脂，8h更换一次溶液，进行脱脂，在进行酶解时胶原蛋白肽提取 率随着温度的升高呈先升高后下降的趋势，在47℃达到最大值34.29％，当温 度超过47℃后，提取率开始下降，因为升高温度可以加快酶促反应速度，而 温度过高导致酶活性降低，因此选择酶解温度在47℃，除杂蛋白时鳄鱼皮与NaCl溶液比为1:10m/V，4℃环境温度中搅拌12h进行除杂蛋白处理，原料预 处理时采用MDF-U71V超低温冰箱进行鳄鱼皮和鳄鱼肉的冷藏，除杂蛋白采 用XFB-200粉碎机进行鳄鱼皮和鳄鱼肉的剪碎处理，灭酶离心时采用X-12R 型告诉冷冻洗心剂进行离心，灭酶使采用HH-6型数显恒温水浴锅进行灭酶时 温度控制，脱杂蛋白和脱脂时蒸馏水清洗时均采用蒸馏水清洗三遍，冷冻干 燥采用Scientz-12N型冷冻干燥剂，保障脱杂蛋白和脱脂时加入的NaCl溶液 和正丁醇溶液的清洗干净，防止料液残留。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例：
如图1所示，一种高活性鳄鱼肽的制作工艺，包括如下步骤：
Sp1：原料预处理：将鳄鱼的鱼肉和鱼皮分离后洗净，放置于-20℃冷藏备 用；
Sp2：除杂蛋白：将原料预处理中冷藏的鱼皮取出，解冻后剪碎，将剪碎 后的鳄鱼皮和鳄鱼肉加入到7.5g/100mL的NaCl溶液中(鳄鱼皮与NaCl溶液 比为1g:10mL)，4℃环境温度中搅拌12h进行除杂蛋白处理，然后用蒸馏水 洗净。
Sp3：脱脂：除杂蛋白之后的鳄鱼皮和鳄鱼肉，加入10％正丁醇溶液(鳄 鱼皮和鳄鱼肉与10％正丁醇体积比1:10)进行脱脂，脱脂条件为4℃时搅拌 24h，每8h更换一次溶液，最后用蒸馏水洗净鳄鱼皮和鳄鱼肉；
Sp4：制备匀浆液：将脱脂脱杂后的鳄鱼肉和鳄鱼皮准确称重，加入水， 放入匀质机中进行匀浆，水与原料的质量比例为2:1，得到鳄鱼的匀浆液；
Sp5：酶解：向匀浆液中加入鳄鱼肉质量0.8％的碱性蛋白酶溶液(0.8％ 的碱性蛋白酶与匀浆液的体积比例为1:20)，加入NaHCO3调节pH至9.0， 47℃酶解2h。
Sp6：灭酶离心：将酶解结束后溶液放入95℃中灭酶10min，将灭酶后的 溶液进行冷却至5℃，冷却后的溶液进行离心，离心速度为10000r/min,离心 时间20min；
Sp7：超滤膜过滤：取灭酶离心后的溶液通过超滤膜进行超滤处理，过滤 后截留分子质量为2200Da；
Sp8：浓缩干燥：取超滤膜过滤后的液体进行旋转蒸发，旋转蒸发温度为 60℃，蒸发时间为25min，得到白色粉末状粗肽；
Sp9：冷冻保存：对白色粉末状的粗肽进行低温-20℃冷冻保存，提取率为34.29％。
经检测，该实施例提取获得的鳄鱼肽对自由基DPPH，OH和超氧阴离子 自由基的清除能力依次是85.4％、83.479％、75.976％，
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种鳄鱼肽的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：鳄鱼的皮和肉碎化后，依次经NaCl溶液清洗、蒸馏水清洗、正丁醇溶液清洗、蒸馏水清洗；
步骤2：清洗后的鳄鱼皮肉与水混合，经匀浆获得匀浆液；
步骤3：所述匀浆液经碱性蛋白酶与47℃，pH值为9.0酶解2h后，经灭酶、离心取上清液；
步骤4：所述上清液经超滤后取滤液，获得鳄鱼肽，所述超滤的截留分子量为2200Da。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述NaCl溶液中NaCl的浓度为7.5g/100mL；鳄鱼皮肉与NaCl溶液的质量-体积比为1g:10mL；所述NaCl溶液清洗的条件为4℃搅拌12h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述正丁醇溶液中正丁醇的体积分数为10％，鳄鱼皮肉与正丁醇溶液的质量-体积为1g:10mL；所述NaCl溶液清洗的条件为4℃搅拌24h，期间每8h更换新鲜的正丁醇溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，两个蒸馏水清洗步骤中，清洗的次数皆为3次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，水与鳄鱼皮肉的质量比为2:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述碱性蛋白酶为0.8wt％的碱性蛋白酶溶液，所述碱性蛋白酶溶液与匀浆液的体积比为1:20。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述超滤后，还包括对未通过滤膜的部分进行旋转蒸发的步骤；所述旋转蒸发温度为60℃，蒸发时间为25min。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法制得的鳄鱼肽。
9.权利要求1～7任一项所述制备方法制得的鳄鱼肽在制备抗氧化产品中的应用。
10.一种抗氧化的产品，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述制备方法制得的鳄鱼肽。
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