CN110760509A - 河豚精巢的鱼精成分提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种河豚精巢的鱼精成分提取方法。其中，所述提取方法包括：预处理河豚精巢，获得分散的精巢细胞；超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物；加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液；令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液；在所述截留液中提取获得鱼精核酸；在所述滤液中提取获得鱼精蛋白。其利用河豚精巢作为提取原料，可以有效的利用河豚养殖产业产生的大量河豚内脏废弃物。而且，在技术方案中实现鱼精DNA和鱼精蛋白的分离提取，有利于提高精巢组织的利用度，还减少了表面活性剂和有机溶剂的使用，更为环保。

Description

河豚精巢的鱼精成分提取方法

技术领域

本发明涉及生物制剂的技术领域，尤其涉及一种河豚精巢的鱼精成分提取方法。

背景技术

河鲀为硬骨鱼纲鲀科鱼类的统称，俗称河豚，是暖温带及热带近海底层鱼类，主要栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中。当遇到外来危险时河鲀会使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。常见的有红鳍东方鲀、暗纹东方鲀、黑鳃兔鲀、凹鼻鲀、黑斑叉鼻鲀等。

河豚鱼肉质鲜美且营养价值高，成为人们口中的“鱼中之王”。然而河豚 含有致命的河豚毒素，每年都有因食用河豚丧命者，因此我国禁食河豚鱼。 这大大阻碍了我国对河豚鱼研究的发展。

伴随着河豚市场的开放，人工养殖河豚鱼产业会有快速的发展，同时也会极大的增加河豚鱼内脏废弃物的产量。其中，河豚的精巢组织可以作为提取原料，用于提取鱼精相关成分，具有很好的生物学活性，可应用于临床使用。

但是，发明人在实现本申请的过程中发现现有技术存在如下问题：现有的鱼精DNA和鱼精蛋白等鱼精相关成分的提取、纯化过程较为复杂，暂时未能实现大规模工业化生产，这使得鱼精DNA和鱼精蛋白的供应有限，限制了它们广泛使用的可能性。

河鲀鱼精巢约占鱼体重的10％左右，自河豚人工养殖的发展，加工产生的鱼精精巢废弃物将越来越多，如何能够有效的利用这些内脏废弃物提取鱼精相关成分是一个需要迫切解决的技术问题。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种河豚精巢的鱼精成分提取方法，以解决现有河豚鱼精蛋白和鱼精DNA提取方法复杂，提取原料受限，无法有效的实现产业化的问题。

本发明实施例的第一方面提供一种河豚精巢的鱼精成分提取方法。所述方法包括：

预处理河豚精巢，获得分散的精巢细胞；超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物；加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液；令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液；在所述截留液中提取获得鱼精核酸；在所述滤液中提取获得鱼精蛋白。

可选地，所述预处理河豚精巢，具体包括：

使用缓冲液清洗所述河豚精巢；机械破碎所述河豚精巢，形成若干组织碎块；向所述组织碎块加入胰蛋白酶进行消化；消化设定的消化时间后，灭活所述胰蛋白酶并离心过滤，获得分散的所述精巢细胞。

可选地，所述超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物，具体包括：

向所述精巢细胞加入缓冲液后进行超声破碎；离心分离所述超声破碎后的产物；向离心分离后的沉淀物加入缓冲液并继续离心分离；重复操作若干次所述离心分离步骤，直至获得白色沉淀。

可选地，所述加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液，具体包括：向所述白色沉淀物加入10倍体积，浓度为1mol/L的浓盐酸；冷藏48小时后，获得所述白色沉淀的溶液。

可选地，所述方法还包括：将所述白色沉淀的溶液通过0.2μm的微滤膜进行过滤，获得对应的滤液。

可选地，令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液的步骤具体包括：将所述滤液通过截留分子量为5000至6000的超滤膜，分别收集通过所述超滤膜的超滤液和被所述超滤膜截留的截留液。

可选地，在所述截留液中提取获得鱼精核酸的步骤具体包括：向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐，获得第一浓缩液；重复所述向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第一浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值；将所述第一浓缩液倒入90-95％的酒精中洗涤，获得纤维状DNA并沥干；沥干后的所述纤维状DNA放入无水酒精中脱水，获得鱼精核酸。

可选地，在所述滤液中提取获得鱼精蛋白，具体包括：

通过截留分子量为1000-2000的超滤膜过滤所述滤液，获得第二浓缩液；向所述第二浓缩液加入纯水并浓缩脱盐；重复所述向所述浓缩液加入纯水并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第二浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值；喷雾干燥所述第二浓缩液，制备获得鱼精蛋白干粉。

可选地，所述喷雾干燥所述第二浓缩液，制备获得鱼精蛋白干粉，具体包括：在真空度为0-0.02MPa的条件下，喷雾干燥所述第二浓缩液；所述喷雾干燥的进风温度为110至120℃，出风温度为80至90℃。

可选地，所述设定的电导阈值小于10μs/cm。

本发明实施例提供的技术方案提供了一种高效环保的鱼精DNA和鱼精蛋白的提取方法。其利用河豚精巢作为提取原料，可以有效的利用河豚养殖产业产生的大量河豚内脏废弃物。而且，在技术方案中实现鱼精DNA和鱼精蛋白的分离提取，有利于提高精巢组织的利用度，还减少了表面活性剂和有机溶剂的使用，更为环保。

附图说明

图1为本发明实施例的鱼精成分的提取方法的一个实施例示意图；

图2为本发明实施例的预处理方法的一个实施例示意图；

图3为本发明实施例的河豚精巢组织的处理方法的一个实施例示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。本说明书所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

本发明实施例中揭露的数值是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值而不限于本发明实施例中公开的具体数值。

本发明实施例中揭露的数值范围用于表示在混合物中组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。该数值范围内的一个或者多个数值点在适当的条件下取得。

鱼精主要成分为核蛋白、酶类以及多种微量元素。核蛋白是由鱼精分离、提取的白色纤维状物质，主要由脱氧核糖核酸(DNA)和碱性蛋白质(鱼精蛋白) 组成。其中DNA占大约2/3，鱼精蛋白占1/3，所以以鱼精为原料提取DNA 的经济效益十分可观。

脱氧核糖酸及其钠盐(DNA一Na)是常用的重要遗传工程研究材料，也是常用的生化试剂和医药制品的原料之一。在人体中核酸是细胞内负责细胞分裂及生长的重要成分，存在于生物体的每个细胞中。

充足的核酸能保持皮肤弹性及乌黑的秀发，促进皮肤基底层细胞的分裂，加速创伤的愈合以及防止瘢痕的产生。其还可以进一步的影响脂肪代谢，防止血清中胆固醇增加，降低动脉硬化的可能性。

从营养医学的角度来看，核酸有各种各样的作用，作为医用抗癌剂，其具有保湿性和紫外吸光性，可用于化妆品。用鱼精DNA制成的片剂和注射液，可以用于治疗因使用抗癌药或放射疗法治疗引起的白细胞减少症，也可用于治疗再生障碍性贫血、血小板减少、肝炎、牛皮癣等疾病。

鱼精蛋白是一种碱性蛋白，由于其含有多种氨基酸且碱性氨基酸占的比例较大而显碱性。国内外研究表明，鱼精蛋白对细菌、霉菌和酵母菌均有显著的抑制作用。

最近20年，由于意识到化学防腐剂对人体的危害，人们开始不断的寻找天然食品防腐剂，鱼精蛋白因其良好的抗菌活性和天然性，开始受到广泛的关注和研究。除了作为食品保鲜剂以外，鱼精蛋白还具有促进细胞繁殖发育、增强肝功能、抑制肿瘤生长繁殖等功能。另外，在医药领域鱼精蛋白还有它不可替代的功能，是目前体外循环心脏手术中唯一对抗肝素的药物。

以河豚精巢组织作为提取原料，图1为本发明实施例提供的鱼精成分的提取方法的方法流程图。如图1所示，所述方法包括：

110、预处理河豚精巢，获得分散的精巢细胞。

该预处理过程具体可以采用任何合适的若干处理步骤，以便初步的去除杂质和充分分散细胞。

在一些实施例中，如图2所示，该预处理过程可以包括如下步骤：

111、使用缓冲液清洗所述河豚精巢。

采集获得的河豚精巢通常会存在比较多的杂质或者污染物，可以使用缓冲液冲洗若干次以确保河豚精巢可以被充分的清洁干净，以免带入杂质影响后续操作。

112、机械破碎所述河豚精巢，形成若干组织碎块。

机械破碎是指采用锐利物，如刀或者剪刀等，通过机械剪切的方式完成。例如，可以使用剪刀等将这些精巢组织分为许多的组织块。

113、向所述组织碎块加入胰蛋白酶进行消化。胰蛋白酶可以消化和去除细胞间质，实现细胞与细胞之间的相互分离。

114、消化设定的消化时间后，灭活所述胰蛋白酶并离心过滤，获得分散的所述精巢细胞。

该消化时间是一个经验数值，可以由技术人员通过实验验证或者根据经验进行设置或者调整。过短的消化时间可能会导致消化不充分，但是过长的消化时间又会导致过分消化而破坏细胞结构。

120、超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物。

超声破碎可以由超声破碎仪等实现，由超声波提供能量，破坏细胞结构使其中的内容物流出。

具体的，为了获得纯的白色沉淀物，可以采用如下步骤：

首先，向所述精巢细胞加入缓冲液后进行超声破碎。然后，离心分离所述超声破碎后的产物。最后，向离心分离后的沉淀物加入缓冲液并继续离心分离，获得破碎后的产物。

根据实际情况的需要，可以重复操作若干次所述离心分离的清洗步骤，直至获得较纯的白色沉淀。

130、加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液。鱼精蛋白和鱼精DNA基本存在在所述白色沉淀物中，可以通过合适体积的浓盐酸来溶解。

具体的，可以向所述白色沉淀物加入10倍体积，浓度为1mol/L的浓盐酸并冷藏48小时后，即可充分溶解该白色沉淀，获得所述白色沉淀的溶液。

较佳的是，在获得溶解溶液以后，还可以使用0.2μm的微滤膜进行过滤，以实现去除不溶性杂质的效果，获得无菌的滤液。

140、令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液。

根据蛋白质和DNA的分子量大小的区别，使用超滤膜的形式将两者进行分离。具体的，可以将所述滤液通过截留分子量为5000至6000的超滤膜，分别收集通过所述超滤膜的超滤液和被所述超滤膜截留的截留液。

150、在所述截留液中提取获得鱼精核酸。

经过超滤膜的分离以后，分子量较大的鱼精核酸被截留在截留液中。其可以采用任何合适的提取方法在截留液中提取该鱼精核酸。

具体的，该提取鱼精核酸的方法可以基于酒精析出提取的方式实现，其可以包括如下步骤：

首先，向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐，获得第一浓缩液。然后，重复所述向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第一浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值。最后，将所述第一浓缩液倒入 90-95％的酒精中洗涤，获得纤维状DNA并沥干。沥干后的所述纤维状DNA 放入无水酒精中脱水以后，便获得鱼精核酸。

160、在所述滤液中提取获得鱼精蛋白。

在一些实施例中，鱼精蛋白可以在浓缩脱盐以后，通过干燥的方式获得相应的蛋白粉末。例如，可以将滤液通过截留分子量为1000-2000的超滤膜进行过滤浓缩，获得第二浓缩液。

然后，向所述第二浓缩液加入纯水并浓缩脱盐；重复所述向所述浓缩液加入纯水并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第二浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值。

最后，采用喷雾干燥的方式，干燥所述第二浓缩液从而制备获得鱼精蛋白干粉。喷雾干燥可以在相应的真空干燥环境下，通过相应的喷雾干燥设备完成。例如，可以在真空度为0-0.02MPa的条件下，喷雾干燥所述第二浓缩液。所述喷雾干燥的进风温度为110至120℃，出风温度为80至90℃。

在一些实施例中，第一浓缩液和第二浓缩液所述设定的电导阈值均可以为10μs/cm，用以保证脱盐效果的符合提取的纯度要求。当然，本领域技术人员也可以根据实际情况的需要，调整设置该电导阈值。

本发明实施例提供的提取方法，可以以河豚的精巢组织为提取原料，同时完成鱼精蛋白和鱼精DNA的提取分离，提高了精巢组织的利用度。同时，与传统的提取生成工艺相比，进一步的减少了表面活性剂和有机溶剂的使用，更环保健康。

图3为本发明实施例提供的河豚精巢组织的处理方法的流程示意图。以下结合图3所示的流程，提供巢提取方法的具体实例以充分说明鱼精DNA和鱼精蛋白的提取过程。

1)从加工厂中回收河豚精巢，并用清水洗净备用。

2)配制柠檬酸钠+0.14MNacl作为缓冲液备用。

3)使用缓冲液将洗净干净的精巢清洗至无色，并放入绞切机中剪碎，形成组织碎块。

4)加入0.25％胰蛋白酶至刚好没过精巢组织碎块，消化处理0.5～2h后离心过滤得到精巢细胞。

5)灭活胰蛋白酶，并把精巢细胞放入超声波破碎仪中，加入2倍体积的缓冲液进行超声破碎。其中，超声波破碎仪工作参数为：超声温度40℃，超声功率60W，超声时间30min。

6)超声破碎后的物质以离心力5000～8000Xg离心得到沉淀。

7)取沉淀并加入缓冲液重悬后离心过滤。

8)重复上述重悬和离心过滤的操作两次以获得白色沉淀。

9)在白色沉淀中加入10倍体积，1mol/L浓盐酸进行溶解，冷藏48h后获得充分溶解后形成的溶液。

10)通过0.2μm微滤膜过滤该溶液，过滤后的溶液再通过截留分子量为 5000～6000的超滤膜分别得到截留液和滤液。

11)得到的截留液加纯水稀释后，重新脱盐浓缩，重复以上操作3～5次直至截留液的溶液电导率<10μS/CM。

12)把浓缩液倒入事先准备好的90％～95％的酒精中洗涤得纤维状DNA 后，撩起沥干。

13)沥干以后的纤维状DNA进一步放入95％酒精中浸泡5min，撩起沥干并放入无水酒精中脱水，获得鱼精DNA。

14)超滤膜产生的滤液则进一步的通过截留分子量为1000～2000的超滤膜过滤得浓缩液。

15)超滤脱盐浓缩后获得的浓缩液加纯水稀释后继续进行脱盐浓缩的操作，重复操作3～5次直至浓缩液的溶液电导率<10μS/CM。

16)将浓缩液倒入干燥机中，通过喷雾干燥的方式获得鱼精蛋白粉。其中，设置干燥机的参数为：真空度0-0.02MPa，进风温度为110-120℃，出风温度为80-90℃。

综上所述，本发明实施例提供的提取方法可以同时提取鱼精DNA和鱼精蛋白，基本不需要使用到表面活性剂和有机溶液，更为环保健康。而且，创造性的使用了河豚精巢作为提取原料，填补了河豚内脏废弃物利用上的空白，可以很好的降低鱼精蛋白和鱼精DNA的制作成本。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种河豚精巢的鱼精成分提取方法，其特征在于，包括：

预处理河豚精巢，获得分散的精巢细胞；

超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物；

加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液；

令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液；

在所述截留液中提取获得鱼精核酸；

在所述滤液中提取获得鱼精蛋白。

2.根据权利要求1所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述预处理河豚精巢，具体包括：

使用缓冲液清洗所述河豚精巢；

机械破碎所述河豚精巢，形成若干组织碎块；

向所述组织碎块加入胰蛋白酶进行消化；

消化设定的消化时间后，灭活所述胰蛋白酶并离心过滤，获得分散的所述精巢细胞。

3.根据权利要求1所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述超声破碎所述精巢细胞，过滤分离获得白色沉淀物，具体包括：

向所述精巢细胞加入缓冲液后进行超声破碎；

离心分离所述超声破碎后的产物；

向离心分离后的沉淀物加入缓冲液并继续离心分离；

重复操作若干次所述离心分离步骤，直至获得白色沉淀。

4.根据权利要求1所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述加入设定体积的浓盐酸溶解所述白色沉淀物，形成溶液，具体包括：

向所述白色沉淀物加入10倍体积，浓度为1mol/L的浓盐酸；

冷藏48小时后，获得所述白色沉淀的溶液。

5.根据权利要求4所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述白色沉淀的溶液通过0.2μm的微滤膜进行过滤，获得对应的滤液。

6.根据权利要求5所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，令所述溶液通过超滤膜，分别获得截留液和滤液的步骤具体包括：

将所述滤液通过截留分子量为5000至6000的超滤膜，分别收集通过所述超滤膜的超滤液和被所述超滤膜截留的截留液。

7.根据权利要求1所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，在所述截留液中提取获得鱼精核酸的步骤具体包括：

向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐，获得第一浓缩液；

重复所述向所述截留液加入纯水洗涤并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第一浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值；

将所述第一浓缩液倒入90-95％的酒精中洗涤，获得纤维状DNA并沥干；

沥干后的所述纤维状DNA放入无水酒精中脱水，获得鱼精核酸。

8.根据权利要求1所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，在所述滤液中提取获得鱼精蛋白，具体包括：

通过截留分子量为1000-2000的超滤膜过滤所述滤液，获得第二浓缩液；

向所述第二浓缩液加入纯水并浓缩脱盐；

重复所述向所述浓缩液加入纯水并浓缩脱盐的步骤若干次，直至获得的第二浓缩液的电导率降低到设定的电导阈值；

喷雾干燥所述第二浓缩液，制备获得鱼精蛋白干粉。

9.根据权利要求8所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述喷雾干燥所述第二浓缩液，制备获得鱼精蛋白干粉，具体包括：

在真空度为0-0.02MPa的条件下，喷雾干燥所述第二浓缩液；所述喷雾干燥的进风温度为110至120℃，出风温度为80至90℃。

10.根据权利要求7-9任一项所述的鱼精成分提取方法，其特征在于，所述设定的电导阈值小于10μs/cm。

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