CN109912708A

CN109912708A - 一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN109912708A
Application number: CN201910263321.3A
Authority: CN
Inventors: 刘淑集; 许旻; 苏永昌; 刘智禹
Original assignee: Fujian Fisheries Research Institute (fujian Aquatic Products Disease Control Center)
Current assignee: Fujian Fisheries Research Institute (fujian Aquatic Products Disease Control Center)
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明提供一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，提取工艺条件为0.14 mol/L NaCl溶液pH8.5，硫酸溶液浓度为0.6 mol/L，硫酸溶液用量为沉淀物的4.0倍体积，提取温度45℃，提取时间2.4 h，乙醇用量为上清液的4倍体积，鱼精蛋白实际提取率为19.07%。从河鲀精巢提取鱼精蛋白，对于研究鱼精蛋白的理化特性以及相关功能特性提供了试验基础，能够起到有效利用河鲀精巢组织的作用。

Description

一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法。

背景技术

河鲀（Tetraodontidae），俗称“河豚鱼”，属于脊索动物门、鲀形目、鲀科，是一种高蛋白、低脂肪的鱼类，具有很高的食用价值，野生河鲀有剧毒。雄性河鲀性成熟期的精巢（俗称鱼白）占整个雄鱼体质量的7 %以上。除虫纹东方鲀（Takifugu vermicularis）精巢含有河豚毒素外，其他品种的精巢基本不含。2016年，农业部等联合发布《关于有条件放开养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀加工经营的通知》；福建省也发布了关于加快推进养殖河鲀产业发展的实施意见，推进菊黄东方鲀（Takifugu Flavidus）和双斑东方鲀（Takifugubimaculatus）的人工养殖。据统计，福建省河鲀养殖面积约10万多亩，产量9 200 t，占全国河鲀养殖总产量30%左右。

鱼类精巢中含有丰富的营养成分，其中鱼精蛋白是利用价值较高的蛋白质。鱼精蛋白是一种富含精氨酸的天然多聚阳离子碱性蛋白质，通常与鱼精脱氧核糖核苷酸以1:2的比例结合，形成精核蛋白存在于鱼类精巢组织中。鱼精蛋白成分天然，安全性较高，具有良好的广谱抗菌特性。此外，鱼精蛋白具有较高的营养和药理功能特性，在医学领域应用广泛。目前鱼精蛋白主要是从鳟鱼、鲱鱼、鲑鱼、鲤鱼、鱿鱼等提取。常用的鱼精蛋白提取方法主要是利用NaCl溶液溶解、硫酸或盐酸提取，再利用冷乙醇沉淀获得，而从河鲀提取鱼精蛋白的报道还未见。本研究以菊黄东方鲀精巢为原料，进行河鲀鱼精蛋白提取工艺研究，获得提取鱼精蛋白最佳工艺条件，为提取河鲀鱼精蛋白的相关研究提供工艺参考，也为河鲀加工产业提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，所述方法为：

（1）称取菊黄东方鲀鱼精巢干制品，加入浓度为 0.14 mol/L的NaCl溶液，料液质量体积比为1：10g/mL，搅碎匀浆2 min，置于25℃下，10 000 r/min离心20 min，弃上清液；

（2）在沉淀物中按照体积比例加入硫酸溶液，在设定的温度条件下提取一定时间，6000 r/min离心15 min，取上清液，加入不定量体积无水乙醇进行沉淀，静置过夜，8000 r/min离心15 min，取沉淀液置于培养皿内，吹风晾干，在-20℃冰箱中冻藏一夜，真空冷冻干燥，所得干制品即为鱼精蛋白粗提物。

提取工艺条件为0.14 mol/L NaCl溶液pH8.5，硫酸溶液浓度为0.6 mol/L，硫酸溶液用量为沉淀物的4.0倍体积，提取温度45℃，提取时间2.4 h，乙醇用量为上清液的4倍体积。

本发明的优点在于：

本发明在单因素试验的基础上，将响应面应用于优化河鲀精巢鱼精蛋白的提取，结果表明，响应面优化河鲀精巢鱼精蛋白提取方法合理可行，得到最佳的提取工艺条件，鱼精蛋白实际提取率为19.07%。从河鲀精巢提取鱼精蛋白，对于研究鱼精蛋白的理化特性以及相关功能特性提供了试验基础，能够起到有效利用河鲀精巢组织的作用。未来关于鱼精蛋白的研究需要进一步深入，继续改进、创新以提高鱼精蛋白的提取率，增加鱼精蛋白提取纯度，最终能适应实际生产需要。

附图说明

图1各单因素对鱼精蛋白提取率的影响。

图2 NaCl溶液pH值和提取时间交互响应面图。

图3 NaCl溶液pH值和提取时间交互等高线图。

图4 NaCl溶液pH值和硫酸用量交互响应面图。

图5 NaCl溶液pH值和硫酸用量交互等高线图。

图6提取时间和硫酸用量交互响应面图。

图7提取时间和硫酸用量交互等高线图。

具体实施方式

、实验方法

1. 1 河鲀精巢成分及安全性测定

水分参照GB/T 5009.236—2016 直接干燥法测定；粗蛋白质参照GB 5009.5—2016 凯氏定氮法测定；粗脂肪参照GB/T 5009.6—2016 索氏抽提法测定；灰分测定参照GB/T5009.4—2016 灼烧称重法测定。河豚毒素( TTX ) 按照河豚毒ELISA检测试剂盒说明书进行检测，评价标准为：TTX ≥ 1 000 MU/g为剧毒，记为A级；100~999 MU/g为强毒，记为B级；10~99MU/g为弱毒，记为C级；<10 MU/g为无毒，记为D级，1MU=0.18 μg/g TTX。

1. 2 鱼精蛋白提取工艺

称取10.00 g的菊黄东方鲀鱼精巢干制品，加入100 mL不同pH、浓度为 0.14 mol/L的NaCl溶液，搅碎匀浆2 min，置于25℃下，10 000 r/min离心20 min，弃上清液。在沉淀物中按照比例加入硫酸溶液，在设定的温度条件下提取一定时间，6 000 r/min离心15 min，取上清液。加入不定量体积无水乙醇进行沉淀，静置过夜，8000 r/min离心15 min，取沉淀液置于培养皿内，吹风晾干，在-20℃冰箱中冻藏一夜，真空冷冻干燥，所得干制品即为鱼精蛋白粗提物。此试验设置重复试验3次，结果取平均值。

1. 3 试验指标的测定

鱼精蛋白提取率计算：真空冷冻干燥后取出样品，称取其重量，采用鱼精蛋白提取率 Y表示：

Y=100%× (E/M) (1)

式中：Y—鱼精蛋白提取率，%；E—冻干后鱼精蛋白粗提物，g；M—冻干河豚精巢，g。

1.4鱼精蛋白提取条件单因素试验

以鱼精蛋白提取率为指标，在固定其他影响因素保持不变的状态下，分别考察硫酸浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）、pH（6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、硫酸用量（离心所得沉淀体积的1、2、3、4、5倍）、提取时间（1、2、3、4、5 h）、提取温度（4℃、25℃、45℃、65℃、85℃）、乙醇用量（分别设定为离心所得上清液体积的1、2、3、4、5倍）对鱼精蛋白提取效果的影响，每个水平试验重复3次。

1.5 响应面优化鱼精蛋白提取工艺条件

在单因素试验基础上，选取NaCl溶液pH（A）、硫酸用量（B）与提取时间（C）3个因素作为自变量，以鱼精蛋白提取率（Y）作为响应值，在pH（7、8、9）、硫酸用量（3、4、5倍）和提取时间（1.5、2、2.5 h）3因素3水平上对鱼精蛋白提取条件进行响应面优化，并进行验证。

1.6 数据分析处理

试验数据均重复3次，运用Excel 2010 软件计算以平均数±标准差(±s)表示；采用SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 河鲀精巢成分测定结果

从菊黄东方鲀精巢成分的分析结果可以看出，冻干精巢的成分含量从高到低排列依次为蛋白质（78.0%）、灰分（10.4%）、粗脂肪（5.8%）、水分（5.0%）、碳水化合物（0.8%），蛋白质占比最大，可见该河鲀精巢中富含丰富的蛋白质，而鱼精蛋白是其中的主要蛋白，且具有良好的功能特性。同时对菊黄东方鲀精巢的河豚毒素进行测定，测定结果低于检测限，属于D级（无毒），说明精巢是安全无毒的，与Itoi等的研究结果一致。

2.2各单因素对河鲀鱼精蛋白提取率的影响

2.2.1 NaCl溶液pH的影响

NaCl溶液的pH对鱼精蛋白的提取影响显著。鱼精蛋白为偏碱性蛋白质，保持中性至偏碱性，有利于鱼精蛋白的提取。图1为各因素对鱼精蛋白提取率的影响结果。由图1a可知，随着溶液碱性的提高，鱼精蛋白提取率逐渐升高，当到达pH10时，提取率显著下降。因此，选取pH 8作为最佳提取点。

2.2.2 硫酸浓度的影响

鱼精蛋白的提取率在低浓度范围内受硫酸浓度的影响显著。从图1b可知，硫酸浓度在0.2～0.6 mol/L中变化时，鱼精蛋白的含量明显增加，浓度到达0.6 mol/L时，鱼精蛋白的提取率达到最大值，之后随着硫酸浓度的继续增加，鱼精蛋白的提取率反而呈下降趋势，当浓度增至0.8～1.0 mol/L之间时，提取率呈稳定趋势，说明鱼精蛋白的提取已接近饱和状态，再高浓度的硫酸可能会破坏蛋白质结构，降低提取率。因此，选取硫酸浓度为0.6 mol/L作为提取最佳浓度。

2.2.3 硫酸用量的影响

硫酸用量对鱼精蛋白的提取影响显著。如图1c所示，鱼精蛋白的提取率随着硫酸用量的增加呈先升后降的趋势，在1~2倍沉淀体积下鱼精蛋白溶解度较小，在2~4倍体积时提取率明显提高，随着硫酸用量的增加，鱼精蛋白与提取液的相互结合能力明显增强，但用量继续增加到5倍时，操作过程的繁琐程度增加，且转移溶液以及离心过程中的误差增大，提取率反而降低。考虑到成本以及提取率含量值，选择硫酸用量在4倍沉淀体积时为最佳。

2.2.4 提取温度的影响

提取温度对鱼精蛋白的影响如图1d所示。在较低温度范围内，鱼精蛋白提取率的变化趋势较为平缓，而在较高温度范围内提取率急剧降低。当温度到达45℃时提取率达到峰值，效果显著。适当提高温度对于提高鱼精蛋白提取率有积极作用。这可能是因为，适当提高温度能增大分子之间的相互作用，提高分子运动的速度，从而增大蛋白质分子的溶解性，但温度进一步升高会破坏蛋白质的原有结构，所提取得到的鱼精蛋白呈黄色甚至偏褐色状态，且后续表现出的水溶性较差。因此，选取45℃作为最佳提取温度较为合适。

2.2.5 提取时间的影响

由图1e可知，提取时间在1~2 h内，鱼精蛋白的提取速度增长明显，在2 h时达到最大值，随着时间的延长，提取率逐渐降低。这可能是由于提取过程中，鱼精蛋白与提取液的相互作用减弱，达到相对平衡后难以继续升高，且随着时间的延长，提取液与被提取物中的其它物质发生结合，易导致杂质增多。因此，以2 h为最佳提取时间。

2.2.6 乙醇用量的影响

乙醇用量对鱼精蛋白提取率的影响如图1f。随着乙醇用量的增加，鱼精蛋白提取率先明显上升，后逐渐趋于平缓。鱼精蛋白的提取率起先变幅较小，随着使用倍数增加提取率迅速上升，当达到4倍用量时，鱼精蛋白的溶解呈现饱和状态，而后逐渐平缓，说明鱼精蛋白的提取接近稳定。因此，选取4倍体积乙醇用量作为最佳沉淀剂用量。

2.3 响应面试验优化结果

对各单因素试验数据进行组间显著性分析发现，硫酸用量、提取时间、pH及乙醇用量4个因素在设定的水平之间均有显著性差异（P = 0.000、0.000、0.016、0.016）。由于乙醇是后续用来沉淀蛋白的，用量比较大，后续还要离心，操作繁琐，因此选择以NaCl溶液pH（A）、硫酸用量（B）、提取时间（C）作为自变量，以鱼精蛋白提取率（Y）作为因变量，应用Design-Expert软件，进行3因素3水平的鱼精蛋白提取条件优化，试验结果见表1。

表1 响应面试验设计方案与结果

以鱼精蛋白提取率（Y）关于NaCl溶液pH（A）、硫酸用量（B）、提取时间（C）所建立的二次回归响应面模型，如以下方程所示：

Y=-38.528+9.374A+5.162B+5.752C+0.034AB+1.424AC-0.603BC-0.759A ²-0.491B ²-3.168C ²。

2.3.1方差分析

二次模型的方差分析结果（表2）显示，模型P =0.0425 < 0.05，说明鱼精蛋白提取率的回归方程模型显著；失拟项P=0.143 8 > 0.05，失拟不显著，回归方程较为可靠，回归模型具有统计学意义，可准确模拟各个因素对河鲀鱼精蛋白提取率的影响，且预测值能较好地与实际操作计算出的鱼精蛋白提取率相吻合。

表2 回归模型的方差分析结果

2.3.2 响应面分析

各因素对鱼精蛋白提取率影响的交互作用响应面及等高线图如图2-7所示。NaCl溶液的pH与提取时间对鱼精蛋白提取率影响的交互作用效果如图2、3所示，随着提取时间的逐渐延长和NaCl溶液pH的增加，鱼精蛋白的提取率先升高后下降，交互曲面整体呈现凸起，呈倒U型变化，且等高线图呈椭圆形，说明NaCl溶液的pH与提取时间二者有一定交互作用。图4、5中，随着NaCl溶液pH的增大，鱼精蛋白的提取率先升高后降低，随着硫酸用量的加大，也呈现先升高后微降低并趋于稳定的态势，二者交互后整体曲面的变化趋势相对图2的曲面比较平缓，但其等高线图仍呈椭圆形，说明NaCl溶液pH和硫酸用量存在交互作用。而在图6、7中，鱼精蛋白提取率随着提取时间的增加逐渐提高，随着硫酸用量的加大也缓慢增加，从相互作用的等高线图看，二者之间的交互作用不明显。

通过Design-Expert8.0分析软件，得到河鲀精巢鱼精蛋白的最佳提取条件是：NaCl溶液pH8.55，硫酸浓度0.6 mol/L，硫酸用量为离心所得沉淀4.05倍体积，提取率预测值19.02%。为了便于实际操作，将模型优化出的最优提取条件简化为：NaCl溶液pH8.5，硫酸用量为离心所得沉淀4.0倍体积，提取时间2.4 h，硫酸浓度0.6 mol/L，提取温度45℃，乙醇用量为上清液的4倍体积。在此条件下进行3次重复试验，计算得到鱼精蛋白的提取率为19.07%，与预测值相比没有显著性差异，说明此响应面法得到的回归模型具有一定的可靠性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，其特征在于：所述方法为：

2.根据权利要求1所述的菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法，其特征在于：提取工艺条件为0.14 mol/L NaCl溶液pH8.5，硫酸溶液浓度为0.6 mol/L，硫酸溶液用量为沉淀物的4.0倍体积，提取温度45℃，提取时间2.4 h，乙醇用量为上清液的4倍体积。