CN113577110B - 一种海胆壳提取物及其制备方法和抗氧化应用 - Google Patents

Abstract

一种海胆壳提取物，所述提取物为海胆壳蛋白和/或海胆壳蛋白酶解寡肽，所述海胆壳为长刺海胆的海胆壳。本发明所述海胆壳蛋白，通过将海胆壳洗净，干燥，粉碎，并用有机溶剂浸泡除去杂质后，用水提法获得；所述海胆壳蛋白酶解寡肽通过海胆壳蛋白水解获得。本发明所得海胆壳蛋白和/或海胆壳蛋白酶解寡肽可以制备抗氧化日化产品和/或药品，具有清除自由基的效果。

Description

一种海胆壳提取物及其制备方法和抗氧化应用

技术领域

本发明涉及食品领域，特别涉及一种海胆壳提取物及其制备方法和抗氧化应用。

背景技术

海胆是一种相对较小的海洋无脊椎动物,属于棘皮动物门(Echinodemata)、游走亚门(Eleutherozea)、海胆纲(Echinoidea)。海胆具有较广泛的药用功能。它的药用部位为全壳，壳呈石灰质，药材名就叫“海胆”。

海胆以其生殖腺供食，其生殖腺又称海胆卵、海胆籽、海胆黄、海胆膏，色橙黄，味鲜香，占海胆全重的8％-15％。其生殖腺中所含有二十碳烯酸占总脂肪酸的30％以上，可预防心血管病。海胆不仅是一种上等的海鲜美味，还是一种贵重的中药材。海胆卵的主要营养成分为卵磷脂、蛋白质、核黄素、硫胺素、脂肪酸等。海胆卵所含的脂肪酸对预防某些心血管疾病有很好的作用。中医认为海胆卵味咸，性平，具有软坚散结、化痰消肿之功效。海胆死后极易变质。此外，海胆提取物波乃利宁(Bonellinin)有抑制癌细胞生长作用。

我国很早就有海胆药用的记载，《本草原始》记载海胆有“治心痛”的功效，近代中医药认为“海胆性味咸平，有软坚散结、化痰消肿的功用”。现代药理学研究也表明海胆具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化等作用。海胆是重要的海产品之一，其中可食用部位海胆卵黄营养价值丰富、味道鲜美，自古以来便是上好的滋补佳品。海胆壳中同样含有多种活性物质，但其多被当做废弃物丢弃，这不仅浪费了潜在的药用资源，还给环境造成一定的压力。

目前，国内外对海胆资源的研究多集中于生活习性、生长发育和遗传育种等方面，对海胆性腺的营养成分分析和评价也有报道，但关于海胆壳的研究却甚少。海胆壳是尚未充分利用的蛋白质资源，酶水解法是提高蛋白质资源利用率和附加值的有效途径。故本研究考察了海胆壳蛋白质的酶解优化条件，并对其酶解产物清除自由基能力进行了研究，以期为寻找天然、高效抗氧化剂及充分开发利用海胆资源提供一定的理论依据。

专利CN101732352B公开一种以紫海胆壳为原料，提取血管紧张素I转换酶抑制剂的方法：取干燥的紫海胆壳，剪碎研磨后放入提取器中，先加入一定量的乙醇溶液或丙酮溶液浸泡，加热回流，弃去提取液；然后再用适量水加热提取，冷却后收集合并提取液，减压浓缩，冷冻干燥得紫海胆壳提取物。经过血管紧张素I转换酶抑制活性实验证明，该提取物具有较为显著的抑制血管紧张素I转换酶(ACE)活性。该专利采用热回流提取海胆壳提取物，没有对海胆壳提取物做进一步处理，也未公开对自由基的作用。

专利CN109645030A公开一种防治柑橘黄龙病的海胆制剂，依次按照如下步骤制备：以海胆壳为原料，按照1：10体积比置于发酵液中30～37℃振摇24～72h，所述发酵液是质量浓度为2～6％的混合粉水溶液，所述混合粉是由植物乳杆菌与酵母按质量比1:1混合而成，所述植物乳杆菌≥1×107cfu/g，酵母为干酵母粉；收集海胆壳进行干燥并粉碎，获得700～1000目海胆壳粉；用超声辅助提取法用质量浓度为50％的乙醇对海胆壳粉进行提取，得到海胆粉提取液，所述超声辅助法中料液比1:20，超声时间40min，超声功率60W；对海胆粉提取液减压浓缩后得到海胆制剂。专利通过海胆壳制备防治柑橘黄龙病的药剂，没有公开海胆壳对自由基的作用。

发明内容

鉴以此，本发明的目的在于提出一种海胆壳提取物及其制备方法。所述海胆壳提取物为海胆壳蛋白和/或海胆壳蛋白酶解寡肽，可以制备抗氧化日化产品和/或药品，具有清除自由基的效果。

一种海胆壳提取物，所述提取物为海胆壳蛋白和/或海胆壳蛋白酶解寡肽。

优选的，所述海胆壳为长刺海胆的海胆壳。

所述的海胆壳蛋白，采用以下方法制备获得：

步骤1：将海胆解剖，分离，得到海胆壳，洗净，干燥，放入高速粉碎机粉碎；

步骤2：取步骤1所得海胆壳粉末，加入有机溶剂，低温静置，除去上层有机溶剂，并重复3～5次，除去海胆壳中的杂质；

步骤3：在步骤2所得的海胆壳粉末加入去离子水，使之充分与水接触，低温水提蛋白，离心取上清液，进行冷冻干燥，冻成干粉，即得所述海胆壳蛋白。

优选的，所述步骤2中，有机溶剂为丙酮，单次用量为海胆壳粉末重量的50～150％，静置时间为2-4h，温度为-30℃～-10℃；所述步骤3中，去离子水的用量为海胆壳粉末重量的8～12倍，水提温度为0-8℃，水提时间为20-28h，冷冻干燥温度为-80℃～-50℃。

所述海胆壳蛋白酶解寡肽的制备方法，采用以下方法制备获得：在所得海胆壳蛋白粉末中，加入蛋白酶酶解，控制温度、pH，酶解完成后，冷冻干燥，获得海胆壳蛋白酶解寡肽。

优选的，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种的混合物。

优选的，所述蛋白酶为胃蛋白酶，用量为2000-4000U/g，酶解温度为32-42℃，酶解时间为3-4h。

优选的，所述蛋白酶为胃蛋白酶，用量为3000U/g，酶解温度为37℃，酶解时间为3.5h。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本申请采用海胆壳为原料，提高了海胆的利用效率，变废为宝；

2)本申请制备获得的海胆壳提取物，可以制备抗氧化日化产品和/或药品，具有清除自由基的效果。

3)本申请制备方法简单，成本低廉，可以批量生产；

4)本申请提取效率高，每10kg干海胆壳粉中提取到的蛋白量为146.7g。

附图说明

图1为海胆壳蛋白的SDS-PAGE电泳分析图

图2为四种蛋白酶对海胆壳蛋白的水解效果图

图3为胆壳蛋白的酶解前后对DPpH自由基清除能力的影响图

具体实施方式

为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明人结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，海胆壳蛋白提取：

步骤1：将海胆解剖，分离，得到海胆壳，洗净，干燥，放入高速粉碎机粉碎；

步骤2：取步骤1所得海胆壳粉末，加入有机溶剂，低温静置，除去上层有机溶剂，并重复3次，除去海胆壳中的杂质；有机溶剂为丙酮，单次用量为海胆壳粉末重量的60％，静置时间为2h，温度为-20℃；

步骤3：在步骤2所得的海胆壳粉末加入去离子水，使之充分与水接触，低温水提蛋白，离心取上清液，进行冷冻干燥，冻成干粉，即得所述海胆壳蛋白；去离子水的用量为海胆壳粉末重量的100倍，水提温度为4℃，水提时间为24h，冷冻干燥温度为-80℃(保留部分)。

100g干海胆壳粉中提取到的总蛋白量为1.467g。

采用SDS-PAGE对得到的海胆壳蛋白的蛋白条带分布情况进行检测，海胆壳蛋白的SDS-PAGE电泳分析图如图1所示，经BCA法测定结果表明，10μL样品溶液通过SDS-PAGE电泳显示较明显，海胆壳蛋白的分子量主要分布在31.0kDa，其余部分蛋白较少。其中，M为低分子蛋白质Marker；1和2为10μL的水提比例1：10海胆壳蛋白样品。

实施例2，不同酶对海胆壳蛋白酶解寡肽的制备的影响：

取实施例1中的海胆壳蛋白粉末，溶于去离子水中，配置成海胆壳蛋白浓缩液，蛋白浓度为2.934mg/mL。

取5ml海胆壳蛋白浓缩液，加入蛋白酶酶解，控制温度、pH，酶解完成后，冷冻干燥，获得海胆壳蛋白酶解寡肽，用BCA法测定各个酶解产物的水解度。

样品1：加入2000U/g中性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，pH为7。

样品2：加入2000U/g胃蛋白酶，酶解温度为37℃，酶解时间为4h，pH为4。

样品3：加入2000U/g碱性蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，pH为9。

样品4：加入2000U/g木瓜蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，pH为7。

水解度(％)＝(多肽含量/总蛋白量)×100％

具体结果如图2所示。可以看出，水解度从高到低依次为胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

实施例3，胃蛋白酶制备海胆壳蛋白酶解寡肽：

取实施例1中的海胆壳蛋白粉末，溶于去离子水中，配置成海胆壳蛋白浓缩液，蛋白浓度为2.934mg/mL。

取5ml海胆壳蛋白浓缩液，加入蛋白酶酶解，控制温度、pH，酶解完成后，冷冻干燥，获得海胆壳蛋白酶解寡肽，用BCA法测定各个酶解产物的水解度。

样品5：加入2000U/g胃蛋白酶，酶解温度为32℃，酶解时间为3h，pH为3，水解度为66.61％。

样品6：加入3000U/g胃蛋白酶，酶解温度为37℃，酶解时间为3.5h，pH为3，水解度为70.70％。

样品7：加入4000U/g胃蛋白酶，酶解温度为42℃，酶解时间为4h，pH为3，水解度为48.99％。

样品8：加入2000U/g胃蛋白酶，酶解温度为37℃，酶解时间为4h，pH为4，水解度为59.59％。

样品9：加入3000U/g胃蛋白酶，酶解温度为42℃，酶解时间为3h，pH为4，水解度为41.41％。

样品10：加入4000U/g胃蛋白酶，酶解温度为32℃，酶解时间为3.5h，pH为4，水解度为31.82％。

样品11：加入2000U/g胃蛋白酶，酶解温度为42℃，酶解时间为3.5h，pH为5，水解度为53.53％。

样品12：加入3000U/g胃蛋白酶，酶解温度为32℃，酶解时间为4h，pH为5，水解度为48.48％。

样品13：加入4000U/g胃蛋白酶，酶解温度为37℃，酶解时间为3h，pH为5，水解度为61.11％。

实施例4，DPpH自由基清除实验：

对海胆样品做DPpH自由基清除能力的测定。即用工作液粉剂加入40mL无水乙醇制备工作液，对照管为400μL样本加600μL 80％甲醇混匀，测定管为400μL样本加600μL工作液混匀，空白管为400μL 80％甲醇加600μL工作液混匀。并在锡纸包裹的暗处反应30min后4000r/min离心5min，波长517nm，吸取800μL至比色皿中，无水乙醇调零，测定各管的吸光度值。分别记为A测定，A对照，A空白。根据公式计算样品的清除率。

DPpH·清除率％＝(1-)×100％

结果如图3所示，可见，海胆壳蛋白酶解前和酶解后样品对DPpH自由基清除能力均随浓度的增加而增强，酶解后的海胆壳蛋白样品对DPpH清除率比酶解前的要好，IC50为0.478mg/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种海胆壳提取物的应用，其特征在于，所述海胆壳提取物在制备抗氧化日化产品和/或药品中的应用；所述海胆壳提取物为海胆壳蛋白和/或海胆壳蛋白酶解寡肽；所述海胆壳为长刺海胆的海胆壳；

所述的海胆壳蛋白，采用以下方法制备获得：

步骤1：将海胆解剖，分离，得到海胆壳，洗净，干燥，放入高速粉碎机粉碎；

步骤2：取步骤1所得海胆壳粉末，加入有机溶剂，低温静置，除去上层有机溶剂，并重复3~5次，除去海胆壳中的杂质；

所述步骤2中，有机溶剂为丙酮，单次用量为海胆壳粉末重量的50~150%，静置时间为2-4h，温度为-30℃~-10℃；

步骤3：在步骤2所得的海胆壳粉末加入去离子水，使之充分与水接触，低温水提蛋白，离心取上清液，进行冷冻干燥，冻成干粉，即得所述海胆壳蛋白；

所述步骤3中，去离子水的用量为海胆壳粉末重量的8~12倍，水提温度为0-8℃，水提时间为20-28h，冷冻干燥温度为-80℃~-50℃。

2.根据权利要求1所述海胆壳提取物的应用，其特征在于，所述海胆壳蛋白酶解寡肽，采用以下方法制备获得：在根据权利要求1所得海胆壳蛋白粉末中，加入蛋白酶酶解，控制温度、pH，酶解完成后，冷冻干燥，获得海胆壳蛋白酶解寡肽。

3.根据权利要求2所述海胆壳提取物的应用，其特征在于，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种的混合物。

4.根据权利要求3所述海胆壳提取物的应用，其特征在于，所述蛋白酶为胃蛋白酶，用量为2000-4000U/g，酶解温度为32-42℃，酶解时间为3-4h，pH为3-5。

5.根据权利要求4所述海胆壳提取物的应用，其特征在于，所述蛋白酶为胃蛋白酶，用量为3000U/g，酶解温度为37℃，酶解时间为3.5h，pH为3。