CN103882082B

CN103882082B - 一种i型和v型胶原蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN103882082B
Application number: CN201410064575.XA
Authority: CN
Inventors: 王林; 梁秋芳; 徐军民; 王振斌; 马海乐
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: HANGZHOU NUTRITION BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2034-02-26
Also published as: CN103882082A

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种I型和V型胶原蛋白的制备方法。主要技术方法如下：将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，清洗，沥干，剪碎，烘干，粉碎后浸泡于0.1 M NaOH溶液，搅拌后离心取沉淀，洗至接近中性，然后置于预冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶后搅拌，离心取上清液，加入NaCl后盐析，离心将沉淀溶解于含NaCl的Tris‑HCl缓冲液中，离心后取上清液，再加入NaCl盐析，离心后分别收集沉淀和上清液：（1）将沉淀溶解，透析，冻干，即得I型胶原蛋白；（2）上清液中再加入NaCl后盐析，离心后取沉淀，溶解，透析，冻干，即得V型胶原蛋白，所有操作均在4°C下进行。本发明利用分级盐析的方法制备I型和V型胶原蛋白，工艺简单，可操作性强，成本低，效率高。

Description

一种 I 型和 V 型胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种I型和V型胶原蛋白的制备方法。

技术背景

我国是一个渔业大国，但加工技术水平较低，大量的加工废弃物造成了严重的资源浪费和环境污染。胶原蛋白可广泛应用于食品、化妆品、医药、材料等领域，但近年来疯牛病、口蹄疫、猪链球菌、禽流感等传染病的频繁暴发，使传统畜禽来源胶原蛋白的安全性越来越让人担心；同时，宗教习俗原因也使其应用受到一定的限制。因此，利用水产品加工废弃物生产可以替代畜禽来源的胶原蛋白，对于减少环境污染、提高渔业效益、促进产品安全具有重要意义。

至今，研究人员已经鉴定出了至少29种胶原蛋白（I-XXIX）。I型胶原蛋白在脊椎动物体内含量最多，广泛分布于机体的各个组织，也是当前各领域应用最多的一种。V型胶原蛋白常常伴随着I型胶原蛋白表达，但含量较少，具有其独特的生理功能，如抑制表皮、内皮、平滑肌、癌细胞的粘附和增殖，结合肝素、胰岛素、骨矿化结合素、血管内皮抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子等生物活性物质，可用于医药、材料和生物医学等领域。

近年来，人们从多种水产品加工废弃物（皮、鳞、骨、鳍）中提取出了胶原蛋白粗品，但由于胶原蛋白分子量大，溶液粘度高，各型分子特征又高度相似，所以胶原蛋白的纯化相当困难，也少有文献报道。

发明内容

本发明以水产品加工废弃物（鱼皮）为原料，利用生物酶解和分级盐析的方法分离纯化I型和V型胶原蛋白，应用于食品、医药、化妆品、生物材料等领域。

本发明采用的技术方案：

（ 1 ）原料的预处理：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，用自来水清洗，沥干，剪碎（约1 cm²），烘干，粉碎，浸泡于NaOH溶液，搅拌，离心取沉淀，用自来水冲洗后烘干。

（ 2 ）胶原蛋白的提取：

将预处理过的鱼皮置于预冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶，搅拌后离心取上清液，缓慢加入NaCl粉末至混合液中，盐析过夜，再次离心，所得白色沉淀即为胶原蛋白粗品。

（ 3 ）胶原蛋白的纯化：

将上述胶原蛋白粗品充分溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液：

A. 将沉淀溶解于乙酸1中，用乙酸2透析后，冷冻干燥，即得I型胶原蛋白。

B. 向上清液中再次加入NaCl至混合液中，盐析，离心取沉淀，同步骤A中I型胶原蛋白操作，溶解，透析，干燥后即得V型胶原蛋白。

其中，步骤（1）中所述烘干条件均为50-60°C；所述粉碎至20-100目；所述粉碎后的鱼皮与NaOH溶液比例为1g:50-100mL，其中NaOH溶液浓度为0.1mol/L；所述搅拌时间为24-36h；所述用自来水洗至pH为6-8；所述离心为2,500 g离心10min。

其中，步骤（2）中所述乙酸在水中的浓度为0.1-0.5 mol/L，所述胃蛋白酶在水中的质量分数为0.1%；所述搅拌时间为36-48h；所述加入NaCl粉末的混合液中NaCl的浓度为2.0 mol/L；所述搅拌后离心为100,000 g离心60 min，所述再次离心为100,000 g 离心15 min。

其中，步骤（3）中所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.05 mol/L并含有1.0 mol/L NaCl，pH 7.5；所述加入NaCl后的上清液中NaCl浓度为2.4 mol/L；所述离心为100,000 g 离心60 min，所述再次离心为100,000 g 离心15 min。

其中步骤（3）第A步中所述乙酸1浓度为0.1-0.5 mol/L；所述乙酸2浓度为0.01-0.05 mol/L，所述透析时间为48-72h。

其中步骤（3）第B步中所述加入NaCl后的混合液中NaCl浓度为4.0 mol/L；所述离心为100,000 g 离心15 min。

上述技术方案中，所有提取和纯化操作均在4°C下进行。

上述技术方案中所述的鱼皮包括所有用于加工生鱼片、鱼糜制品等的淡水鱼和海水鱼的鱼皮。

此工艺适合批量生产，只需按比例放大即可。

本发明的有益效果：

1．我国每年大量的水产品加工下脚料被用于饲料或肥料，甚至作为垃圾掩埋丢弃，造成了严重的资源浪费和环境污染。本发明以水产品加工废弃物（皮）为原料生产可广泛应用于食品、医药、化妆品、生物材料等领域的胶原蛋白，既延伸产业链，提高产品附加值，又减少环境污染，增加经济和社会效益。

2. 胶原蛋白在机体内以胶原纤维的形式存在，具有较高的稳定性。传统胶原蛋白的提取大多采用盐、酸、碱、热水等方法，存在提取效率较低，环境污染大，产品质量不稳定等问题。本发明利用限制酶解的方法提取胶原蛋白，不仅无环境污染，提取效率高，而且所得产品具有良好的生物学特性。

3．胶原蛋白分子量大，溶液粘度高，各型分子特征又高度相似，所以各型胶原蛋白的纯化相当困难。目前胶原蛋白的纯化大多采用多级柱层析的方法，但流程复杂，效率低，成本高，并且难以产业化。本发明利用分级盐析的方法纯化出了I型和V型胶原蛋白，工艺简单，操作性强，成本低，效率高。

附图说明

图1：鱼皮I型和V型胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。泳道1：蛋白质分子量标准；泳道2：V型胶原蛋白；泳道3：I型胶原蛋白。

具体实施方式

结合以下实例，对本发明进行进一步详细说明：

实施例 1 ：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，自来水清洗，沥干，剪碎（约1 cm²），烘干（55°C），粉碎（50目），称取200 g室温浸泡于15 L 0.1 mol/L NaOH 溶液中，连续搅拌30 h，离心（2,500 g × 10 min）取沉淀，用自来水洗至pH为7.0，烘干（55°C）。

取100 g（以干基计）预处理过的鱼皮置于10 L预冷水中，加入150 mL冰乙酸和10 g胃蛋白酶，连续搅拌42 h后，离心（100,000 g × 60 min）后取上清，缓慢加入1.25 Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L，盐析过夜，离心（10,000 g × 15 min），所得沉淀即为胶原蛋白粗品。

将胶原蛋白粗品溶解于7.5 L 1.0 mol/L NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）溶液中（用1.0 mol/L NaOH调节pH至7.5），离心（100,000 g × 60 min）取上清液，缓慢加入0.68 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，盐析过夜，再次离心（100,000 g × 15 min），分别收集沉淀和上清液：

（1）将沉淀溶解于约5 L预冷的0.25 mol/L乙酸中，装入截留分子量为10 kDa的透析袋，对大量0.025 mol/L乙酸透析60 h脱盐，真空冷冻干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为I型胶原蛋白（约92.4 g）；

（2）向上清液中再次缓慢加入0.83 Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，盐析过夜，离心（100,000 g × 15 min）后取沉淀，同I型胶原蛋白溶解，透析，干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为V型胶原蛋白（约2.1 g）。

实施例 2 ：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，自来水清洗，沥干，剪碎（约1 cm²），烘干（50°C），粉碎（20目），称取200 g室温浸泡于10 L 0.1 mol/L NaOH 溶液中，连续搅拌36 h，离心（2,500 g × 10 min）取沉淀，用自来水洗至pH为6.0，烘干（50°C）。

取100 g（以干基计）预处理过的鱼皮置于7.5 L预冷水中，加入45 mL冰乙酸和7.5 g胃蛋白酶，连续搅拌48 h后，离心（100,000 g × 60 min）后取上清，缓慢加入1.0 Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L，盐析过夜，离心（10,000 g × 15 min），所得沉淀即为胶原蛋白粗品。

将胶原蛋白粗品溶解于5 L 1.0 mol/L NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）溶液中（用1.0 mol/L NaOH调节pH至7.5），离心（100,000 g × 60 min）取上清液，缓慢加入0.45 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，盐析过夜，再次离心（100,000 g × 15 min），分别收集沉淀和上清液：

（1）将沉淀溶解于约5 L预冷的0.1 mol/L乙酸中，装入截留分子量为30 kDa的透析袋，对大量0.01 mol/L乙酸透析48 h脱盐，真空冷冻干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为I型胶原蛋白（约90.8 g）；

（2）向上清液中再次缓慢加入0.55 Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，盐析过夜，离心（100,000 g × 15 min）后取沉淀，同I型胶原蛋白溶解，透析，干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为V型胶原蛋白（约2.0 g）。

实施例 3 ：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，自来水清洗，沥干，剪碎（约1 cm²），烘干（60°C），粉碎（100目），称取200 g室温浸泡于20 L 0.1 mol/L NaOH 溶液中，连续搅拌24 h，离心（2,500 g × 10 min）取沉淀，用自来水洗至pH为8.0，烘干（60°C）。取100 g（以干基计）预处理过的鱼皮置于15 L预冷水中，加入450 mL冰乙酸和15 g胃蛋白酶，连续搅拌36 h后，离心（100,000 g × 60 min）后取上清，缓慢加入1.85 Kg NaCl粉沫至2.0 mol/L，盐析过夜，离心（10,000 g × 15 min），所得沉淀即为胶原蛋白粗品。

将胶原蛋白粗品溶解于10 L 1.0 mol/L NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）溶液中（用1.0 mol/L NaOH调节pH至7.5），离心（100,000 g × 60 min）取上清液，缓慢加入0.9 Kg NaCl粉沫至2.4 mol/L，盐析过夜，再次离心（100,000 g × 15 min），分别收集沉淀和上清液：

（1）将沉淀溶解于约5 L预冷的0.5 mol/L乙酸中，装入截留分子量为30 kDa的透析袋，对大量0.05 mol/L乙酸透析72 h脱盐，真空冷冻干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为I型胶原蛋白（约92.0 g）；

（2）向上清液中再次缓慢加入1.1 Kg NaCl粉沫至4.0 mol/L，盐析过夜，离心（100,000 g × 15 min）后取沉淀，同I型胶原蛋白溶解，透析，干燥，所得无臭无味白色海绵状固体即为V型胶原蛋白（约2.1 g）。

实例1、2、3的所有提取和纯化操作均在4°C下进行。所制备的I型和V型胶原蛋白可通过SDS-PAGE图谱鉴定其纯度（见附图），从图中可以看出，I型胶原蛋白至少含有α₁(I)、α₂(I)两条α链及其二聚体β链和三聚体γ链；V型胶原蛋白至少含有α₁(V)、α₂(V)、α₃(V)三条α链。若达不到应用要求，可将其再次溶解于预冷的0.5 mol/L乙酸（1:100，w/v）中，高速离心（100,000 g × 60 min）后重复上述“胶原蛋白的纯化”步骤，可显著提高I型和V型胶原蛋白的纯度。

Claims

1.一种I型和V型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）原料的预处理：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，用自来水清洗，沥干，剪碎，烘干，粉碎，浸泡于NaOH溶液，搅拌，离心取沉淀，用自来水冲洗后烘干；

（2）胶原蛋白的提取：

将预处理过的鱼皮置于预冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶，搅拌后离心取上清液，缓慢加入NaCl粉末至混合液中，盐析过夜，再次离心，所得白色沉淀即为胶原蛋白粗品；

（3）胶原蛋白的纯化：

A. 将沉淀溶解于第一乙酸溶液中，用第二乙酸溶液透析后，冷冻干燥，即得I型胶原蛋白；

B. 向上清液中再次加入NaCl至混合液中，盐析，离心取沉淀，同步骤A中I型胶原蛋白操作，溶解，透析，干燥后即得V型胶原蛋白；

步骤（1）中所述粉碎后的鱼皮与NaOH溶液比例为1g:50-100mL；所述NaOH溶液浓度为0.1mol/L；

步骤（2）中所述胃蛋白酶在水中的质量分数为0.1%；

步骤（3）中所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.05 mol/L并含有1.0 mol/L NaCl，pH 7.5；

步骤（2）中所述乙酸在水中的浓度为0.1-0.5 mol/L；所述搅拌时间为36-48h；所述加入NaCl粉末的混合液中NaCl的浓度为2.0 mol/L；所述搅拌后离心为100,000g离心60min，所述再次离心为100,000g离心 15 min。

2.根据权利要求1所述的一种I型和V型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述烘干条件均为50-60°C；所述粉碎至20-100目；所述搅拌时间为24-36 h；所述用自来水洗至pH为6-8；所述离心为2,500g离心10min。

3.根据权利要求1所述的一种I型和V型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述加入NaCl后的上清液中NaCl的浓度为2.4mol/L；所述离心为100,000g离心60min，所述再次离心为100,000g离心15 min；

其中步骤（3）第A步中所述第一乙酸溶液浓度为0.1-0.5mol/L；所述第二乙酸溶液浓度为0.01-0.05 mol/L，所述透析时间为48-72h；

其中步骤（3）第B步中所述加入NaCl后的混合液中NaCl浓度为4.0mol/L；所述离心为100,000 g离心15min。

4.根据权利要求1所述的一种I型和V型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所有提取和纯化操作均在4°C下进行。

5.根据权利要求1所述的一种I型和V型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述的鱼皮包括所有用于加工生鱼片、鱼糜制品的淡水鱼和海水鱼的鱼皮。