CN102146117A - 一种酶溶性胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特征在于：原料经处理去除杂蛋白和脂肪后，添加醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提，同时加入胃蛋白酶，浸提后过滤得酶溶性胶原蛋白粗提液；然后在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入氢氧化钠溶液调节其pH至7.0-12，静置得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。本发明方法更为简单合理，它不使用Tris，除低了生产成本。该方法不仅大大提高了酶溶性胶原蛋白的得率，也保持了蛋白质的热稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白的制备方法，特别是一种酶溶性胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是动物支持结构最主要的组成部分，在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原蛋白是一大类蛋白质，从不同组织中分离得到的胶原蛋白在肽链、氨基酸组成、物化性质、胶原蛋白构型等方面有非常显著的差异，本发明主要针对的是数量最丰富的I型胶原蛋白。目前我国胶原蛋白生产主以猪、牛等的皮、腱等为原料经过提取、纯化得到。
现有技术中胶原蛋白的提取过程基本都是将原料经过氢氧化钠脱除杂蛋白后直接采用低温长时间浸泡提取的工艺，一般以0.5M醋酸在4℃左右浸泡72-96小时，在提取过程中加入胃蛋白酶，然后过滤得到粗酶溶性胶原蛋白。在粗酶溶性胶原蛋白溶液中加入Tris使其最终的浓度为0.5M，然后再加入氯化钠使其最终浓度为2.5M，使胶原蛋白会不断的析出。再次进行冷冻离心，取其沉淀，用0.5M醋酸将沉淀溶解，然后装入透析袋中，用0.02M磷酸氢二钠和蒸馏水分别进行透析；透析以后得到的胶原蛋白经过冷冻干燥工艺，得到酶溶性胶原蛋白。其缺陷在于：该方法成本高，制备的酶溶性胶原蛋白的热稳定性差，制备工艺复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种工艺更为简单、可同时提高产品热稳定性与得率的酶溶性胶原蛋白的制备方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特点是，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于0-40℃用0.05—5.0mol/L的NaOH溶液浸泡1-50小时，在浸泡过程中，每隔1-5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡1-50小时，再用0-30℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.05—10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提2-72h，浸提温度为0-40℃，同时加入原料重量的0.05-10%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：5—100，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5-5.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至7.0-12，0-40℃静置2-72小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.05—10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析1-8天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
本发明所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法的步骤（1）中所述的有机溶剂可以为现有技术中可适用于本发明用于去除原料中的脂肪的有机溶剂，优选为丙酮、四氯化碳或己烷。所述的洗涤剂为常规的日用品洗涤剂，优选安利公司生产的碟新洗涤剂。
本发明所采用的原料可以为水产加工过程中产生的下脚料—鱼皮，如鲤鱼皮、鲢鱼皮、鳕鱼皮等等；所述的其它动物组织可以为猪、牛等的皮、腱等。
本发明的优选技术方案是：一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特点是，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于4-5℃用0.5—2.0mol/L的NaOH溶液浸泡20--30小时，在浸泡过程中，每隔3-5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡20-30小时，再用0-5℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.1—1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提48-72h，浸提温度为3-10℃，同时加入原料重量的0.5-2.0%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：20—50，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5-2.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至10.0-12.0，0-4℃静置40-50小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.1—1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析2-3天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特点是：取步骤（3）所制得的酶溶性胶原蛋白，重复步骤（3）所述的提纯步骤1-2次，得到进一步纯化以及酶进一步钝化的酶溶性胶原蛋白。
与现有技术相比，本发明利用了胃蛋白酶对碱性条件敏感的特性，用氢氧化钠溶液对得到的酶溶性胶原蛋白进行处理，可以较好的提高酶溶性胶原蛋白的热稳定性，达到与一般不加胃蛋白酶所得胶原蛋白同样的稳定性。本发明方法更为简单合理，它不使用Tris，除低了生产成本。该方法通过加入胃蛋白酶，大大提高了酶溶性胶原蛋白的得率，但蛋白酶的存在也降低了蛋白质的热稳定性。
附图说明
图1为用现有技术方法得到的酶溶性胶原蛋白40℃热稳定性电泳图。图中：1：标准样品，2：0 min，3：30min，4：1h，5：2h, 6：3h，7：5h。
图2 为本发明方法得到的酶溶性胶原蛋白40℃热稳定性电泳图。图中：1：0 min，2：30min，3：1h，4：2h，5：3h，6：5h。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于0℃用0.05mol/L的NaOH溶液浸泡1小时，在浸泡过程中，每隔1小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡1小时，再用0℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.05mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提2h，浸提温度为0℃，同时加入原料重量的0.05%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：5，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至7.0，0℃静置2小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.05mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析1天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
实施例2。一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于40℃用5.0mol/L的NaOH溶液浸泡50小时，在浸泡过程中，每隔5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡50小时，再用30℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提72h，浸提温度为40℃，同时加入原料重量的10%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1： 100，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入5.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至12，40℃静置72小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析8天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
实施例3。一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于4℃用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡20小时，在浸泡过程中，每隔3小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡20小时，再用2℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.1mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提48h，浸提温度为3℃，同时加入原料重量的0.5%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：20，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至10.0，2℃静置40小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.1mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析2天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
实施例4。一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于5℃用2.0mol/L的NaOH溶液浸泡30小时，在浸泡过程中，每隔5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡30小时，再用5℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提72h，浸提温度为10℃，同时加入原料重量的2.0%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：50，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入2.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至12.0， 4℃静置50小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析3天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
实施例5。一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于4℃用1.0mol/L的NaOH溶液浸泡24小时，在浸泡过程中，每隔4小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡24小时，再用4℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.5mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提60h，浸提温度为4℃，同时加入原料重量的1.0%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：30，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至11.0，3℃静置48小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.5mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析2天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
实施例6。实施例1-5任何一项所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法的步骤（1）中所述的有机溶剂为丙酮、四氯化碳或己烷。
实施例7。实施例1-6任何一项所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法中，取步骤（3）所制得的酶溶性胶原蛋白，重复步骤（3）所述的提纯步骤1-2次，得到进一步纯化以及酶进一步钝化的酶溶性胶原蛋白。
实施例8。参照图1-2。鲤鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白的制备方法实验。
提取工艺步骤如下：
1、取新鲜鲤鱼鱼皮或冷冻鲤鱼鱼皮，同一批原料做好厚薄均匀，大小一致，原料无腐烂、霉变的现象。
2、原料预处理：
2.1清洗：冻结原料首先用自来水流水解冻，解冻后的原料用自来水清洗，除去原料表面的血污、粘液、鳞片等杂质，洗涤水温度4℃。
2.2除杂蛋白：杂蛋白的去除采用NaOH溶液浸泡，碱液浓度0.5mol/L,浸泡时间24小时，浸泡温度4℃，在浸泡过程中，不断搅拌，每隔4小时，换水一次。
2.3、除脂肪：采用有机溶剂丙酮4℃浸泡6小时，脱除脂肪。
3、提取：
3.1去除部分脂肪的原料皮按照1：25的比例加入提取剂，提取剂为0.5mol/L 的醋酸溶液，温度为4℃，时间为48小时, 同时加入胃蛋白酶，添加量为鱼皮重量的2.0%。
3.2、4℃过滤后，得酶溶性胶原蛋白粗提液。
3.3、向酶溶性胶原蛋白粗提液中，缓缓加入1 mol/L的氢氧化钠溶液，使其pH值为11，然后静置12小时，得胶原蛋白凝胶。
3.4、用提取剂0.5mol/L 的醋酸溶液溶解胶原蛋白凝胶，用蒸馏水进行透析，大约48h；
3.5、将被透析蛋白质冷冻干燥，到的酶溶性胶原蛋白。
将本实验得到的酶溶性胶原蛋白进行检测，发现其热稳定性明显提高，基本可以达到不加胃蛋白酶时胶原蛋白的热稳定性，结果参照图1-2。电泳方法可参见文章：段蕊，张俊杰，杜修桥，姚兴存，今野久仁彦鲤鱼(Cyprinus carpio)鱼皮、鱼鳞和鱼骨胶原蛋白的性质. 食品化学（112）,702-706（英）。
Claims (4)
1.一种酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于0-40℃用0.05—5.0mol/L的NaOH溶液浸泡1-50小时，在浸泡过程中，每隔1-5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡1-50小时，再用0-30℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.05—10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提2-72h，浸提温度为0-40℃，同时加入原料重量的0.05-10%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：5—100，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5-5.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至7.0-12，0-40℃静置2-72小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.05—10mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析1-8天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的有机溶剂为丙酮、四氯化碳或己烷。
3.根据权利要求1所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）原料处理：以鱼皮或者其它动物组织为原料，用水清洗后，于4-5℃用0.5—2.0mol/L的NaOH溶液浸泡20--30小时，在浸泡过程中，每隔3-5小时，换浸泡液一次，得去除杂蛋白的原料；然后用洗涤剂或有机溶剂浸泡20-30小时，再用0-5℃水清洗，得去除脂肪的原料；
（2）胶原蛋白提取：向处理后的原料中添加0.1—1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液作提取剂进行浸提48-72h，浸提温度为3-10℃，同时加入原料重量的0.5-2.0%的胃蛋白酶，原料与提取剂的重量比为1：20—50，浸提后过滤，所得滤液为酶溶性胶原蛋白粗提液；
（3）胶原蛋白纯化并钝化酶的活性：在搅拌条件下向酶溶性胶原蛋白粗提液中加入0.5-2.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH至10.0-12.0，0-4℃静置40-50小时，得蛋白质凝胶，然后取蛋白质凝胶用0.1—1.0mol/L 的醋酸、柠檬酸或盐酸溶液溶解，得蛋白质凝胶溶液，再用蒸馏水透析2-3天，冷冻干燥，即得酶溶性胶原蛋白。
4.根据权利要求1或2或3所述的酶溶性胶原蛋白的制备方法，其特征在于：取步骤（3）所制得的酶溶性胶原蛋白，重复步骤（3）所述的提纯步骤1-2次，得到进一步纯化以及酶进一步钝化的酶溶性胶原蛋白。
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