CN102888436A - 一种泡腾片式低分子量胶原蛋白肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种泡腾片式低分子胶原蛋白肽及其制备方法,主要步骤为:去除非胶原性蛋白、生物酶脱脂、溶胶、胰蛋白酶酶解、硅藻土和大孔树脂联合脱色、浓缩干燥、与多种有益原料混合压制成泡腾片。它在传统工艺的基础上,优化溶胶和酶解的工艺条件,得到分子量集中分布在500~1600Da的胶原蛋白肽,简化后续工艺操作,降低生产成本,首次提出用硅藻土和大孔树脂联合对胶原蛋白肽液进行脱色,脱色效果好,胶原蛋白肽损失少。在剂型方面引入泡腾片,在美容保湿的基础上,皮肤透过性好,而且不添加任何防腐剂,使得本化妆品对人体皮肤更加安全有益。

Description

一种泡腾片式低分子量胶原蛋白肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及胶原蛋白肽提取及应用领域,更加具体地说,具体涉及一种泡腾片式低分子量胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白或称胶原是由动物(从海绵动物到脊椎动物)细胞合成的一种生物高分子化合物,广泛存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中,约占哺乳动物总蛋白1/3,在骨头与肌腱中约有90%以上,皮肤中约有50%以上的蛋白质为胶原蛋白。而胶原蛋白的水解产物胶原蛋白肽具有抗血压、调节免疫、抗肿瘤、护肤美容等众多功效。蛋白质水解产生的胶原蛋白活性肽主要是以化学法和酶法水解而来,化学法以酸或碱断开蛋白质肽键,由于反应环境较极端,不利于活性的保持,而酶解蛋白质生产活性肽的安全性却很高,能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽,且水解过程易控制,因而近几年报道的活性肽的制备方法均为酶解法。酶的选择是酶解法生产活性肽的关键,而目标活性肽的下游技术则是决定能否将之用于生产的关键。对于化妆品级胶原蛋白肽而言,《皮胶原蛋白的酶法提取及在高附加值领域的应用》、《化妆品级水解蛋白质分子量分布的研究》等相关文献指出分子量低于2KD或1KD左右的胶原蛋白肽可以很好地渗入人体皮肤,达到美容护肤的作用。CN102199649A、CN102154424A、CN102031279A等相关专利以超滤、纳滤设备为基础截获低分子量的胶原蛋白肽,但是从胶原蛋白肽的提取率上说,这种纯化方法有一定的局限性,并且成本较高。目前市面上的胶原蛋白化妆品分子量分布较宽,1KD的胶原肽的比重不高,直接影响胶原化妆品的质量。并且绝大多数化妆品里都含有防腐剂,这增加了安全隐患。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法以及相对应的泡腾片剂型和制备方法。不仅解决现有技术所存在的化妆品中含有人体难以吸收的高分子胶原蛋白的问题,也解决了工业生产中胶原蛋白肽分布范围宽,得率低的问题;同时首创了不含有防腐剂的胶原化妆品新剂型。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现:
一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,按照下述步骤进行:
步骤1,除去猪皮中非胶原性蛋白质
选取新鲜猪皮(即原料猪皮),清洗,沥干,常温20-25摄氏度的条件下,用0.1mol/l~0.15mol/lNaOH水溶液浸泡,料液比为1:25~1:30(g/ml,即猪皮的质量和NaOH水溶液的体积比),在100-200转/min下搅拌18h~24h,以除去猪皮里非胶原性蛋白质,然后过滤,得猪皮备用。
步骤2,脱除猪皮中的脂肪
按料液比为1:25~1:30(g/ml,即步骤1处理后的猪皮质量和水的体积比)的比例取水,然后加入占原料猪皮质量2%~4%的脂肪酶,调整温度和体系的pH值以使加入的脂肪酶活性达到最大,在100-200转/min的搅拌条件下脱除脂肪。例如使用脂肪酶(天津市诺奥科技发展有限公司,型号IF-G-NL2)时,使用Na2CO3粉末调节pH值为9~9.3,35℃恒温低速100-200转/min搅拌8h~10h。
步骤3,溶胶
将脱去脂肪的猪皮置于水中,料液比1:15~1:20(g/ml,即步骤2处理后的猪皮质量和水的体积比),80℃的条件下恒温加热,低速100-200转/min搅拌4h~6h,得到猪皮和水溶性胶原的混合物。
步骤4,制备胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液
将上一步的猪皮和水溶性胶原的混合物降温,同时调节混合物溶液的pH值以使加入的胰蛋白酶活性达到最大,加入胰蛋白酶,E/[S]=1000~2500u/g(即每g原料猪皮对应的胰蛋白酶活性为1000-2500u),低速100-200转/min搅拌18h-24h。然后将酶解后的蛋白肽液灭酶活,离心除去不溶物,得到胰蛋白酶酶解蛋白肽液。利用使用胰蛋白酶(天津市诺奥科技发展有限公司,型号YDB-G-035)时,将上一步的猪皮和水溶性胶原的混合物降温至50℃,保持50℃恒温。调节混合物溶液的pH=7,加入胰蛋白酶,将酶解后的蛋白肽液置于95℃的环境下5-10min,以灭酶活。
步骤5,蛋白肽液脱色
配置2wt%~4wt%的硅藻土的水溶液,抽滤,使滤纸表面形成一层均匀的硅藻土层,以此为过滤介质,对蛋白肽液抽滤。抽滤后的蛋白肽液进入树脂柱进行分离,得到澄清透明的胶原蛋白肽液。在使用D296R树脂(南开大学化工厂,全称为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂)时,可控制流速为以2ml/min~6ml/min的流速进入D296R型树脂柱。
步骤6,浓缩干燥
将澄清透明的胶原蛋白肽液进行真空浓缩和喷雾干燥得胶原蛋白肽粉末。在操作时,可在真空浓缩阶段,待体系中出现固形物且固形物质量分数达到整个澄清透明的胶原蛋白肽液体系(即固形物和液体的总质量)的30%~35%时停止浓缩,并进行喷雾干燥。
利用上述方法得到的低分子量胶原蛋白肽为原料,制备泡腾片式低分子胶原蛋白肽,具体方案如下:
泡腾片式低分子胶原蛋白肽,按质量份计,由以下组分组成:
其中所述组分A为5%PVP70%乙醇,称5gPVP(天津市江天化工技术有限公司,型号为K30,数均分子量6000),加入70wt%乙醇的水溶液至100g,搅拌溶解混匀即可。
各组分优选如下:
泡腾片式低分子胶原蛋白肽,按质量份计,由以下组分组成:
制备所述泡腾片式低分子胶原蛋白肽的方法,按照下述步骤进行:
将低分子量胶原蛋白肽(粉料)、芦荟(粉料)、柠檬酸(粉料)分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀后加入组份A后造粒,40—45℃真空干燥,得到第一颗粒①;将低分子量胶原蛋白肽(粉料)、芦荟(粉料)、碳酸氢钠(粉料)分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀后加入组份A后造粒,40—45℃真空干燥,得到第二颗粒②;然后将甘露醇,山梨醇,聚乙二醇6000混匀,过80目筛,加入上述第一和第二颗粒①②,混合均匀,迅速转移至温度(20±2)℃、湿度(40±5)%无菌操作间中进行压片制得产品。
其中所述甘露醇,山梨醇,聚乙二醇6000三者均为粉末状固体。
在制备第一颗粒和第二颗粒时,优选在44℃真空干燥。
在制备第一颗粒和第二颗粒时,可选择将低分子量胶原蛋白肽(粉料)、芦荟(粉料)和组分A等用量地分配在第一颗粒和第二颗粒中。
本发明的技术方案采用溶胶和酶解工艺,得到分子量集中分布在500~1600D的胶原蛋白肽,省略了进行纳滤或者超滤工艺;硅藻土和树脂联合脱色,解决了传统的活性炭脱色后活性炭再生困难的问题和H2O2脱色后有毒物质残留的问题,并利用得到的胶原蛋白采用不含防腐剂的压片式剂型(泡腾片),更利于皮肤的美容和安全;这些有益的工艺措施使得生产工艺简单,原料利用率高,安全可靠,生产成本大大降低。
附图说明
图1为实施例1胶原蛋白肽分子量的质谱图(质谱为德国布鲁克·道尔顿的型号MALDI-TOF)。
图2为实施例2胶原蛋白肽分子量的质谱图(质谱为德国布鲁克·道尔顿的型号MALDI-TOF)。
图3为实施例3胶原蛋白肽分子量的质谱图(质谱为德国布鲁克·道尔顿的型号MALDI-TOF)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。本发明采用市售的分析纯原料,使用天津市诺奥科技发展有限公司,型号IF-G-NL2的脂肪酶,天津市诺奥科技发展有限公司,型号YDB-G-035的胰蛋白酶,硅藻土(青岛盛泰硅业有限公司,D30),D296R树脂(南开大学化工厂,全称为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂),PVP(聚乙烯吡咯烷酮)购于天津市江天化工技术有限公司,型号为K30,数均分子量6000。使用的二号筛网:20目孔径0.89毫米,产地浙江上虞市五星冲压筛具厂;80目筛:孔径0.2毫米,产地浙江上虞市五星冲压筛具厂。
实施例1
(1)除去猪皮中非胶原性蛋白质:
选取新鲜切碎猪皮500g,清洗,沥干,常温条件下,用体积为15L的0.15mol/lNaOH溶液25℃浸泡,200转/min搅拌18h,以除去猪皮里非胶原性蛋白质。然后过滤,得猪皮备用。
⑵脱除猪皮中的脂肪:
把步骤(1)处理后的猪皮放入15L清水中,用Na2CO3粉末调清水pH值为9,然后加入2.5g脂肪酶,35℃恒温200转/min搅拌10h。然后过滤,清水洗净猪皮备用。
⑶溶胶:
将步骤(2)洗净后的猪皮置于10L蒸馏水中,80℃恒温,低速200转/min搅拌5h,得到猪皮和水溶性胶原的混合物。
⑷制备胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液:
将步骤(3)猪皮和水溶性胶原的混合物降温至50℃,保持50℃恒温。调节混合物溶液的pH=7,加入胰蛋白酶,E/[S]=2000u/g,200转/min搅拌18h,得到胰蛋白酶酶酶解过的蛋白肽液。然后将蛋白肽液置于95℃的环境下8min。离心除去不溶物,取上清液,得胶原蛋白肽液。
⑸胶原蛋白肽液脱色
配置2wt%的硅藻土水溶液500ml,抽滤,使滤纸表面形成一层均匀的硅藻土层,以此为过滤介质,然后对胶原蛋白肽液抽滤。抽滤后的蛋白肽液以4ml/min的流速进入D296R型树脂柱,得到澄清透明的胶原蛋白肽液。
⑹浓缩干燥
将澄清透明的胶原蛋白肽液进行真空浓缩至固形物质量分数为35%,喷雾干燥得胶原蛋白肽粉末,图1为实施例1胶原蛋白肽分子量的质谱图,从图1看出,所制备的胶原蛋白粉的分子量集中分布在500~1560Da之间,提取率85%,纯度91%。
(7)压片
将7.5g胶原蛋白肽粉、5g芦荟粉与17.8g柠檬酸粉分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀,加入5g5%PVP70%乙醇后造粒,44℃干燥,得到颗粒①;将7.5g胶原蛋白粉、5g芦荟粉与22.2g碳酸氢钠粉分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀,加入5g5%PVP70%乙醇后造粒,44℃干燥,得到颗粒②;然后将12g甘露醇,24g山梨醇,3g聚乙二醇6000混合均匀,过80目筛后,加入上述①②颗粒,混匀,迅速转移至温度(20±2)℃、湿度(40±5)%无菌操作间中进行压片制得泡腾片式胶原蛋白肽泡腾片。
实施例2
(1)除去猪皮中非胶原性蛋白质:
选取新鲜猪皮500g,清洗,沥干,常温条件下,用体积为15L的0.1mol/lNaOH溶液常温20℃浸泡,低速100转/min搅拌20h,以除去猪皮里非胶原性蛋白质。然后过滤,得猪皮备用。
⑵脱除猪皮中的脂肪:
把步骤(1)处理后的猪皮放入15L清水中,用Na2CO3粉末调清水pH值为9.3,然后加入5g脂肪酶,35℃恒温低速100转/min搅拌10h。然后过滤,清水洗净猪皮备用。
⑶溶胶:
将步骤(2)洗净后的猪皮置于10L蒸馏水中,80℃恒温,低速100转/min搅拌6h,得到猪皮和水溶性胶原的混合物。
⑷制备胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液:
将步骤(3)猪皮和水溶性胶原的混合物降温至50℃,保持50℃恒温。调节混合物溶液的pH=7,加入胰蛋白酶,E/[S]=2500u/g,低速100转/min搅拌18h,得到胰蛋白酶酶酶解过的蛋白肽液。然后将蛋白肽液置于95℃的环境下8min。离心除去不溶物,取上清液,得胶原蛋白肽液。
⑸胶原蛋白肽液脱色
配置4wt%的硅藻土水溶液500ml,抽滤,使滤纸表面形成一层均匀的硅藻土层,以此为过滤介质,然后对胶原蛋白肽液抽滤。抽滤后的蛋白肽液以6ml/min的流速进入D296R型树脂柱,得到澄清透明的胶原蛋白肽液。
⑹浓缩干燥
将澄清透明的胶原蛋白肽液进行真空浓缩至固形物质量分数为30%,喷雾干燥得胶原蛋白肽粉末,图2为实施例2胶原蛋白肽分子量的质谱图,从图2看出,所制备的胶原蛋白粉的分子量集中分布在500~1600Da之间,提取率87.2%,纯度94%。
(7)压片
将7g胶原蛋白肽粉、4g芦荟粉与19g柠檬酸粉分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀,加入2.5g5%PVP70%乙醇后造粒,45℃干燥,得到颗粒①;将7g胶原蛋白粉、4g芦荟粉与20g碳酸氢钠粉分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀,加入2.5g5%PVP70%乙醇后造粒,45℃干燥,得到颗粒②;然后将8g甘露醇,26g山梨醇,4g聚乙二醇6000混合均匀,过80目筛后,加入上述①②颗粒,混匀,迅速转移至温度(20±2)℃、湿度(40±5)%无菌操作间中进行压片制得泡腾片式胶原蛋白肽泡腾片。
实施例3
(1)除去猪皮中非胶原性蛋白质:
选取新鲜猪皮500g,清洗,沥干,常温条件下,用体积为15L的0.1mol/lNaOH溶液常温20℃浸泡,低速150转/min搅拌24h,以除去猪皮里非胶原性蛋白质。然后过滤,得猪皮备用。
⑵脱除猪皮中的脂肪:
把步骤(1)处理后的猪皮放入15L清水中,用Na2CO3粉末调清水pH值为9.2,然后加入5g脂肪酶,35℃恒温低速150转/min搅拌10h。然后过滤,清水洗净猪皮备用。
⑶溶胶:
将步骤(2)洗净后的猪皮置于10L蒸馏水中,80℃恒温,低速150转/min搅拌6h,得到猪皮和水溶性胶原的混合物。
⑷制备胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液:
将步骤(3)猪皮和水溶性胶原的混合物降温至50℃,保持50℃恒温。调节混合物溶液的pH=7,加入胰蛋白酶,E/[S]=1000u/g,低速150转/min搅拌18h,得到胰蛋白酶酶酶解过的蛋白肽液。然后将蛋白肽液置于95℃的环境下5min。离心除去不溶物,取上清液,得胶原蛋白肽液。
⑸胶原蛋白肽液脱色
配置4wt%的硅藻土的水溶液500ml,抽滤,使滤纸表面形成一层均匀的硅藻土层,以此为过滤介质,然后对胶原蛋白肽液抽滤。抽滤后的蛋白肽液以6ml/min的流速进入D296R型树脂柱,得到澄清透明的胶原蛋白肽液。
⑹浓缩干燥
将澄清透明的胶原蛋白肽液进行真空浓缩至固形物质量分数为30%,喷雾干燥得胶原蛋白肽粉末。图3为实施例3胶原蛋白肽分子量的质谱图,从图3看出,所制备的胶原蛋白粉的分子量集中分布在500~1600Da,提取率85.8%,纯度92.5%。
(7)压片
将9g胶原蛋白肽粉、7g芦荟粉与16g柠檬酸粉分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀,加入5g5%PVP70%乙醇后造粒,40℃干燥,得到颗粒①;将9g胶原蛋白粉、7g芦荟粉与23g碳酸氢钠粉混匀,加入5g5%PVP70%乙醇后造粒,40℃干燥,得到颗粒②;然后将15g甘露醇,22g山梨醇,2g聚乙二醇6000混合均匀,过80目筛后,加入上述①②颗粒,混匀,迅速转移至温度(20±2)℃、湿度(40±5)%无菌操作间中进行压片制得泡腾片式胶原蛋白肽泡腾片。
将本发明的泡腾片置于水中,溶解迅速,水溶液无异味,澄清透明。将其水溶液涂于皮肤表面,保湿性良好,胶原蛋白肽透过率高。对20人(10男、10女,年龄为22—25周岁)次进行每天早中晚三次涂于皮肤表面,长期使用3个月,发现其能有效补充人体皮肤所需的胶原蛋白含量,有助于美容。
以上对本发明做了示例性的描述,应该说明的是,在不脱离本发明的核心的情况下,任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,其特征在于,按照下述步骤进行: 
步骤1,除去猪皮中非胶原性蛋白质,其中用0.1mol/l~0.15mol/lNaOH水溶液浸泡原料猪皮,料液比为1:25~1:30,以除去猪皮里非胶原性蛋白质 
步骤2,脱除猪皮中的脂肪,其中按料液比为1:25~1:30的比例取水,然后加入占原料猪皮质量2%~4%的脂肪酶,调整温度和体系的pH值以使加入的脂肪酶活性达到最大,脱除脂肪 
步骤3,溶胶,其中将脱去脂肪的猪皮置于水中,料液比1:15~1:20,80℃的条件下恒温加热,低速100-200转/min搅拌4h~6h,得到猪皮和水溶性胶原的混合物 
步骤4,制备胰蛋白酶酶解蛋白肽溶液,将上一步的猪皮和水溶性胶原的混合物降温,同时调节混合物溶液的pH值以使加入的胰蛋白酶活性达到最大,加入胰蛋白酶,E/[S]=1000~2500u/g,然后将酶解后的蛋白肽液灭酶活,离心除去不溶物,得到胰蛋白酶酶解蛋白肽液 
步骤5,蛋白肽液脱色,配置2wt%~4wt%的硅藻土的水溶液,抽滤,使滤纸表面形成一层均匀的硅藻土层,以此为过滤介质,对蛋白肽液抽滤,抽滤后的蛋白肽液进入树脂柱进行分离,得到澄清透明的胶原蛋白肽液 
步骤6,浓缩干燥,将澄清透明的胶原蛋白肽液进行真空浓缩和喷雾干燥得胶原蛋白肽粉末。 
2.根据权利要求1所述的一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,其特征在于,在所述步骤2中,使用Na2CO3粉末调节pH值为9~9.3,35℃恒温低速100-200转/min搅拌8h~10h,脱除猪皮中的脂肪。 
3.根据权利要求1所述的一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,其特征在于,在所述步骤4中,将上一步的猪皮和水溶性胶原的混合物降温至50℃,保持50℃恒温,调节混合物溶液的pH=7,加入胰蛋白酶,低速100-200转/min搅拌18h-24h,将酶解后的蛋白肽液置于95℃的环境下5-10min,以灭酶活。 
4.根据权利要求1所述的一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,其特征在于,在所述步骤5中,所述树脂柱为D296R型树脂柱,控制抽滤后的蛋白肽液流速为以2ml/min~6ml/min的流速进入D296R型树脂柱,得到澄清透明的胶原蛋白肽液。 
5.根据权利要求1所述的一种低分子量胶原蛋白肽的提取方法,其特征在于,在所述步骤6中,在真空浓缩阶段,待体系中出现固形物且固形物质量分数达到整个澄清透 明的胶原蛋白肽液体系的30%~35%时停止浓缩,并进行喷雾干燥。 
6.一种利用本发明制备的低分子量胶原蛋白肽粉末的泡腾片式低分子胶原蛋白肽,其特征在于,按质量份计,由以下组分组成: 
Figure FDA00002183127200021
其中所述组分A为5%PVP70%乙醇,称5gPVP,加入70wt%乙醇的水溶液至100g,搅拌溶解混匀即可。 
7.根据权利要求6所述的泡腾片式低分子胶原蛋白肽,其特征在于,各组分优选如下: 
Figure FDA00002183127200022
8.一种制备如权利要求6所述的泡腾片式低分子胶原蛋白肽的方法,其特征在于,按照下述步骤进行: 
将低分子量胶原蛋白肽、芦荟、柠檬酸分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀后加入组份A后造粒,4045℃真空干燥,得到第一颗粒①;将低分子量胶原蛋白肽、芦荟、碳酸氢钠分别研磨成细粉,过20目筛网,混合均匀后加入组份A后造粒,40-45℃真空干燥,得到第二颗粒②;然后将甘露醇,山梨醇,聚乙二醇6000混匀,过80目筛,加入上述第一和第二颗粒①②,混合均匀,迅速转移至温度(20±2)℃、湿度(40±5)% 无菌操作间中进行压片制得产品。 
9.根据权利要求8所述的一种泡腾片式低分子胶原蛋白肽的方法,其特征在于,所述甘露醇,山梨醇,聚乙二醇6000三者均为粉末状固体。 
10.根据权利要求8所述的一种泡腾片式低分子胶原蛋白肽的方法,其特征在于,在制备第一颗粒和第二颗粒时,优选在44℃真空干燥;在制备第一颗粒和第二颗粒时,可选择将低分子量胶原蛋白肽、芦荟和组分A等用量地分配在第一颗粒和第二颗粒中。 
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