CN105481978B - 一种高纯度胶原蛋白的制备方法 - Google Patents

一种高纯度胶原蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：(a)选取动物身上的结缔组织；(b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织；(c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质；(d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液；(e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中，得到胶原蛋白沉淀；(f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析，取出干燥即可。通过将含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中沉淀并进行透析，这样能够得到高纯度胶原蛋白；并且采用特定的清洗剂，能够提高得到的胶原蛋白基质纯度，从而为得到高纯度胶原蛋白打下基础。

Description

一种高纯度胶原蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于蛋白质的制备领域，具体涉及一种高纯度胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种纤维蛋白(fibrous protein)，其可在软骨、筋腱、真皮组织以及其它结缔组织中发现。
目前，胶原蛋白已广泛运用于工业以及医药，它一般藉由可将非胶原蛋白物质移除的反复酸溶或酵素处理，而由结缔组织纯化出来；此种处理需重复数次以改善胶原蛋白的纯度。重复处理不仅会拉长纯化工艺，更会导致胶原蛋白产率低。公开号为CN102131403A的中国发明专利公开了一种新颖的胶原蛋白制备方法，通过先制造胶原蛋白基质，然后再由基质萃取出胶原蛋白，这种方法避免了制备过程中的重复操作，然而造胶原蛋的纯度仍有改善空间。
发明内容
本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：
(a)选取动物身上的结缔组织；
(b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织；
(c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质；
(d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液；
(e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
(f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析，取出干燥即可。
优化地，步骤(c)中，采用清洗液对所述膨胀结缔组织进行清洗，所述清洗液中包含以下重量份数的原料：
Figure BDA0000926648440000011
Figure BDA0000926648440000021
优化地，所述步骤(a)中，采用人工或机械清理结缔组织除去脂肪和脂质。
优化地，步骤(b)中，所述第一酸液中包含甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸中的一种和多种，其浓度为0.5～3mol/L。
优化地，步骤(d)中，所述萃取液包含有机弱酸或/和无机盐的溶液，其pH值为3～7。
优化地，步骤(e)中，所述盐溶液的浓度为0.3～2mol/L，其体积与所述含有胶原蛋白的溶液体积比为5～10：1。
优化地，步骤(f)中，所述清水每30～60分钟更换一次，透析时间为3～5小时。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明高纯度胶原蛋白的制备方法，通过将含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中沉淀并进行透析，这样能够得到高纯度胶原蛋白；并且采用特定的清洗剂，能够提高得到的胶原蛋白基质纯度，从而为得到高纯度胶原蛋白打下基础。
具体实施方式
本发明高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：(a)选取动物身上的结缔组织，结缔组织选取的表面积为20平方毫米(mm2)至2平方米(m2)；起始材料(即结缔组织)取自于动物，例如牛、猪、马、羊、鸡、鸭、火鸡、鹅、鲸鱼或者鲨鱼等畜类或鱼类，具体部位为真皮组织、皮下组织、韧带、筋腱、腱膜、软骨以及骨头组织等；在取用时可先用人工切开或机械清理结缔组织以除去不需要的材料，例如脂肪及脂质。如将动物皮除去脂质、以盐水清洗皮数次后，以一植皮刀除去动物皮的表面层即可获得真皮组织，所得的真皮组织可用磷酸盐缓冲溶液进一步清洗。根据需要，结缔组织可以先用适合的有机溶剂(如醇、酮、丙酮、乙腈、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或其混合物)或者有机溶剂与水的混合液(其体积比为1：1～5)进行处理，使有机溶剂可以渗透入结缔组织；当结缔组织含有毛发或毛根时，可以用微碱溶液或蛋白水解酶处理以除去毛发或毛根，蛋白水解酶可为分散酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凤梨蛋白酶、无花果蛋白酶或其混合物。
(b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织；第一酸液为有机酸，例如甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸或其混合物，其浓度为0.5～3mol/L；醋酸效果较佳；为了获得较佳的膨胀效果，可以在其中加入清洗液中含有的表面活性剂，使其浓度为0.1～0.5mol/L。
(c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质；步骤(c)中，采用清洗液对所述膨胀结缔组织进行清洗，所述清洗液中包含以下重量份数的原料：水100～150份、表面活性剂1～10份、螯合剂1～10份、蛋白水解酶1～10份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐0.1～1份和氯化钠1～5份，以得到高纯度胶原蛋白基质。表面活性剂选用常规的即可，如十二烷基硫酸钠(SDS)、Tego化合物、氯化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基铵等；螯合剂选用常规的即可，如乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1,4,7,10’-四乙酸(DOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1,4,7,10’-四亚甲基磷酸(DOTP)等。蛋白水解酶可以采用无花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶以及溶血素，以除去连接于细胞外基质的蛋白质、其它非胶原蛋白的蛋白质与胶原蛋白分子的末端肽。
(d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液；可以将前述的胶原蛋白基质进行研磨、震荡、搅拌、均质化、绞碎、撕裂、切割、磨碎、切或其混合方式使其有利于在萃取液中的溶解；随后将处理过的胶原蛋白基质浸于萃取液中，并对其进行震荡、搅动或搅拌使得萃取液能够溶解最大量的胶原蛋白，过滤除去未溶解的部分；该萃取液包含有机弱酸或/和无机盐的溶液，其pH值为3～7；弱酸为甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、硼酸、磷酸或其混合物；无机盐包含氯化钠或/和氯化钾，其浓度为0.1～2mol/L。
(e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐(也是氯化钠或/和氯化钾)溶液中，得到胶原蛋白沉淀；盐溶液的浓度为0.3～2mol/L，其体积与含有胶原蛋白的溶液体积比为5～10：1。
(f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析3～5小时，取出干燥即可；清水每30～60分钟更换一次。
下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：
(a)自猪身上取得皮肤组织，除去脂质后，以盐水清洗皮数次，以植皮刀除去皮的表皮层以获得厚度为0.3mm的真皮组织；随后用磷酸盐缓冲溶液清洗该真皮组织，将缓冲溶液残余物自真皮组织的表面完全的除去；
(b)将上面的真皮组织浸入盛有浓度为0.5mol/L的醋酸溶液的容器内，在40℃恒温放置48h使真皮组织膨胀至厚度为0.6毫米；
(c)用清洗液清洗膨胀结缔组织，该清洗液中包含以下重量份数的原料：水100份、表面活性剂1份、螯合剂1份、蛋白水解酶1份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐0.1份和氯化钠1份；从而形成胶原蛋白基质；
(d)将胶原蛋白基质浸于0.5mol/L的醋酸溶液24小时，期间不断搅拌；将该混合物以2000rpm的速度离心1小时后，收集上清液并在4℃储存；随后用胃蛋白酶(0.2mg/ml)处理24小时得无端肽胶原蛋白，
(e)取上述含有无端肽胶原蛋白的溶液50ml倾入1mol/L、250ml的氯化钠溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
(f)将该胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析3小时，30分钟更换一次清水，取出干燥即可；最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为95％。
实施例2
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它的制备方法与实施例1中的基本相同，不同的是：清洗液中包含以下重量份数的原料：水150份、表面活性剂10份、螯合剂10份、蛋白水解酶10份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐1份和氯化钠5份，最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为96％。
实施例3
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它的制备方法与实施例1中的基本相同，不同的是：清洗液中包含以下重量份数的原料：水120份、表面活性剂8份、螯合剂8份、蛋白水解酶5份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐0.5份和氯化钠2份，最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为99％。
实施例4
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：
(a)自鲸鱼身上取得皮下组织，除去脂质后，以盐水清洗皮数次，以植皮刀除去皮的表皮层以获得厚度为0.4mm的皮下组织；随后用磷酸盐缓冲溶液清洗该真皮组织，将缓冲溶液残余物自真皮组织的表面完全的除去；
(b)将上面的皮下组织浸入盛有浓度为1mol/L的甲酸溶液的容器内，在35℃恒温放置36h使真皮组织膨胀至厚度为1毫米；
(c)用清洗液清洗膨胀结缔组织，该清洗液中包含以下重量份数的原料：水120份、表面活性剂7份、螯合剂5份、蛋白水解酶6份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐0.6份和氯化钠3份，从而形成胶原蛋白基质；
(d)将胶原蛋白基质浸于1mol/L的醋酸溶液20小时，期间不断搅拌；将该混合物以2500rpm的速度离心0.5小时后，收集上清液并在6℃储存；随后用胰蛋白酶(0.5mg/ml)处理20小时得无端肽胶原蛋白；
(e)取上述含有无端肽胶原蛋白的溶液50ml倾入1.5mol/L、500ml的氯化钠溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
(f)将该胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析5小时，60分钟更换一次清水，取出干燥即可；最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为94％。
实施例5
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它依次包括以下步骤：
(a)自牛身上取得牛蹄筋组织，除去脂质后，以盐水清洗皮数次，获得厚度为1mm的牛蹄筋；
(b)将上面的皮下组织浸入盛有浓度为1.5mol/L的柠檬酸溶液的容器内，在25℃恒温放置36h使真皮组织膨胀至厚度为3毫米；
(c)用清洗液清洗膨胀结缔组织，该清洗液中包含以下重量份数的原料：水110份、表面活性剂9份、螯合剂6份、蛋白水解酶4份、1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐0.7份和氯化钠5份，从而形成胶原蛋白基质；
(d)将胶原蛋白基质浸于1mol/L的醋酸溶液20小时，期间不断搅拌；随后将该混合物以2500rpm的速度离心0.5小时后，收集上清液并在6℃储存；
(e)取上述含有胶原蛋白的溶液100ml倾入2mol/L、300ml的氯化钠溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
(f)将该胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析4小时，20分钟更换一次清水，取出干燥即可；最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为90％。
对比例1
本实施例提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，它的制备方法与实施例1中的基本相同，不同的是：清洗液中不含有1-甲基-3-乙基咪唑氯鎓盐，最终采用液相色谱仪测得胶原蛋白纯度为85％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，它依次包括以下步骤：
(a)选取动物身上的结缔组织；
(b)将所述结缔组织浸入第一酸液中，使其体积至少膨胀一倍形成膨胀结缔组织；
(c)清洗所述膨胀结缔组织，形成胶原蛋白基质；
(d)利用萃取液从所述胶原蛋白基质萃取出胶原蛋白，形成含有胶原蛋白的溶液；
(e)将所述含有胶原蛋白的溶液倾入盐溶液中，得到胶原蛋白沉淀；
(f)将所述胶原蛋白沉淀置于透析袋内放入清水中进行透析，取出干燥即可；
步骤(c)中，采用清洗液对所述膨胀结缔组织进行清洗，所述清洗液中包含以下重量份数的原料：
Figure FDA0001821567130000011
2.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，采用人工或机械清理结缔组织除去脂肪和脂质。
3.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(b)中，所述第一酸液中包含甲酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸中的一种和多种，其浓度为0.5～3mol/L。
4.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(d)中，所述萃取液包含有机弱酸或/和无机盐的溶液，其pH值为3～7。
5.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(e)中，所述盐溶液的浓度为0.3～2mol/L，其体积与所述含有胶原蛋白的溶液体积比为5～10∶1。
6.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(f)中，所述清水每30～60分钟更换一次，透析时间为3～5小时。
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