CN102416195A - 胶原蛋白海绵的制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种胶原蛋白海绵的制备方法。该方法包括如下步骤：在pH值1.0～5.0的条件，将牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白进行透析；在交联剂水溶液中将透析后的胶原蛋白交联；将交联后的胶原蛋白凝胶冻干，在交联剂水溶液中将所述胶原蛋白交联，然后冷冻干燥得到胶原蛋白海绵。本发明的胶原蛋白海绵的制备方法获得的胶原蛋白海绵浸水后有一定弹拉韧性、有良好的生物相容性能和组织修复性能，可控降解，蛋白质含量高。

Description

胶原蛋白海绵的制备方法
技术领域
本发明涉及胶原蛋白海绵的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种细胞外蛋白质，它是曲3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质，胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30％以上。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分。由于胶原蛋白具有优越的生物相容性和安全性，胶原被认为是最有用的生物材料之一。胶原作为药物递送系统的主要应用有：眼外科的胶原罩、创伤和灼伤中的胶原海绵、蛋白质传递的微丸和片剂、控释凝胶处方、透皮给药的控释材料、基因递送的纳米粒及细胞培养基质。另外，还有组织工程学方面的应用包括：皮肤代用品、骨代用品、人工血管、瓣膜和人工硬脑脊膜等。胶原蛋白海绵是一种新型的生物医学材料，其不仅有效地促进毛细血管的形成，加速肉芽组织生长，作缺损部位组织填充物从而引导组织再生，促进各种创面的快速愈合，还具有止血消炎、减轻疼痛、减轻疤痕及色素沉着等作用。目前市场上胶原蛋白海绵主要缺点为力学性能差，降解时间短。
发明内容
本发明的目的是提供一种既有良好的生物相容性能和组织修复性能，又有良好的力学性能和可控降解性能的胶原蛋白海绵的制备方法。
本发明所提供的胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：
在pH值1.0～5.0的条件，将牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；
酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；
将盐析出的胶原蛋白进行透析；
在交联剂水溶液中将透析后的胶原蛋白交联；
将交联后的胶原蛋白凝胶冻干，在交联剂水溶液中将所述胶原蛋白交联，然后冷冻干燥得到胶原蛋白海绵。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述饱和盐溶液为饱和氯化钠溶液或饱和氯化钾溶液。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述交联剂选自甲醛、戊二醛、碳化亚胺、双环氧化合物、京尼平、原花青素中任一种或几种。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述交联剂水溶液中交联剂的体积百分含量为1～0.01％。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.01～1000mg/L。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法，其中：所述上清与所述饱和盐溶液的体积比为1∶(1～100)。
本发明的胶原蛋白海绵的制备方法获得的胶原蛋白海绵浸水后有一定弹拉韧性、有良好的生物相容性能和组织修复性能，可控降解，蛋白质含量高。
具体实施方式
实施例1
利用去离子水清洗购买的合格原材料牛跟腱，利用切片机切割牛跟腱至合适大小放入酶解罐中待用。1000g牛跟腱加入注射用水，加适量的醋酸调节pH值至1.0，加入胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶的浓度为0.01mg/L，温度0℃，酶解120h。酶解完成后，将酶解罐内溶液加入离心机离心，转速为1000r/min，120min。取上清液。将离心后上清液倒入不锈钢桶内，将氯化钠饱和溶液加入不锈钢桶内，氯化钠饱和溶液与上清液的体积比为1∶1，不断搅拌，直至胶原蛋白全部析出。将盐析出来的胶原蛋白装入透析袋内，放入透析罐内透析5天。将透析完成的胶原蛋白加入交联罐中，加适量的注射用水至胶原蛋白胶液固体含量在0.1％，搅拌均匀后加入甲醛交联1h，甲醛与胶原蛋白胶液的体积比为1∶100，将交联好的混合凝胶装入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时。在交联罐中加入适量注射用水，将冻干的胶原蛋白凝胶放入交联罐中，加入甲醛交联1h，甲醛与按注射用水体积比1∶100。将交联好的胶原蛋白海绵放入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时，冻干完成后取得到胶原蛋白海绵。
胶原蛋白海绵的外观为白色海绵状薄片，有晶体光泽，浸水后有一定弹拉韧性。
胶原蛋白海绵的长为4.32～4.62cm，宽为4.57～4.61cm，厚为0.39～0.42cm。
胶原蛋白海绵的化学性能：吸水力为本身重量的50～56倍。胶原蛋白海绵的炽灼残渣0.2％，pH值6.2，胶原蛋白海绵的重金属含量(以铅计)小于10ug/g。羟脯氨酸含量为12％。蛋白质总量为96％。
胶原蛋白海绵的生物学性能：无菌检验(GB/T19973.2-2005)胶原蛋白海绵符合无菌规定。细胞毒性试验(GB/T 16886.5-2003)检测胶原蛋白海绵的细胞毒性为0～1级。细菌内毒素试验(EN455-3-2000)检测胶原蛋白海绵的细菌内毒素小于0.5EU/ml。Ames试验(GB/T16886.3-2008)检测为阴性。染色体畸变试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。微核试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。致敏试验(GB/T 16886.10-2005)检测无致敏反应。急性供毒试验(ISO 10993-11：2006)检测无急性生身毒性反应。植入后局部反应试验(ISO10993-6：2007)，胶原蛋白海绵植入1周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞及少量多核巨细胞，材料周围有肉芽组织包绕。植入4周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞。植入12周后，植入部位有极少的淋巴细胞、嗜中性粒细胞，试样材料被降解吸收，无肉眼可辨别异物。
实施例2
利用去离子水清洗购买的合格原材料牛跟腱，利用切片机切割牛跟腱至合适大小放入酶解罐中待用。1000g牛跟腱加入注射用水，加适量的柠檬酸调节pH值至5.0，加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的浓度为1000mg/L，温度30℃，酶解12h。酶解完成后，将酶解罐内溶液加入离心机离心，转速为10000r/min，12min。取上清液。将离心后上清液倒入不锈钢桶内，将氯化钠钾和溶液加入不锈钢桶内，氯化钠钾饱和溶液与上清液的体积比为1∶100，不断搅拌，直至胶原蛋白全部析出。将盐析出来的胶原蛋白装入透析袋内，放入透析罐内透析5天。将透析完成的胶原蛋白加入交联罐中，加适量的注射用水至胶原蛋白胶液固体含量在5％，搅拌均匀后加入戊二醛交联24h，戊二醛与胶原蛋白胶液的体积比为1∶10000，将交联好的混合凝胶装入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时。在交联罐中加入适量注射用水，将冻干的胶原蛋白凝胶放入交联罐中，加入碳化亚胺交联24h，碳化亚胺与按注射用水体积比1∶10000。将交联好的胶原蛋白海绵放入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时，冻干完成后取得到胶原蛋白海绵。
胶原蛋白海绵的外观为白色海绵状薄片，有晶体光泽，浸水后有一定弹拉韧性。
胶原蛋白海绵的长为4.32～4.62cm，宽为4.57～4.61cm，厚为0.39～0.42cm。
胶原蛋白海绵的化学性能：吸水力为本身重量的50～56倍。胶原蛋白海绵的炽灼残渣0.2％，pH值6.2，胶原蛋白海绵的重金属含量(以铅计)小于10ug/g。羟脯氨酸含量为12％。蛋白质总量为96％。
胶原蛋白海绵的生物学性能：无菌检验(GB/T19973.2-2005)胶原蛋白海绵符合无菌规定。细胞毒性试验(GB/T 16886.5-2003)检测胶原蛋白海绵的细胞毒性为0～1级。细菌内毒素试验(EN455-3-2000)检测胶原蛋白海绵的细菌内毒素小于0.5EU/ml。Ames试验(GB/T16886.3-2008)检测为阴性。染色体畸变试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。微核试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。致敏试验(GB/T 16886.10-2005)检测无致敏反应。急性供毒试验(ISO 10993-11：2006)检测无急性生身毒性反应。植入后局部反应试验(ISO10993-6：2007)，胶原蛋白海绵植入1周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞及少量多核巨细胞，材料周围有肉芽组织包绕。植入4周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞。植入12周后，植入部位有极少的淋巴细胞、嗜中性粒细胞，试样材料被降解吸收，无肉眼可辨别异物。
实施例3
利用去离子水清洗购买的合格原材料牛跟腱，利用切片机切割牛跟腱至合适大小放入酶解罐中待用。1000g牛跟腱加入注射用水，加适量的盐酸调节pH值至4.0，加入木瓜蛋白酶进行酶解，木瓜蛋白酶的浓度为100mg/L，温度30℃，酶解80h。酶解完成后，将酶解罐内溶液加入离心机离心，转速为10000r/min，10min。取上清液。将离心后上清液倒入不锈钢桶内，将氯化钠饱和溶液加入不锈钢桶内，氯化钠饱和溶液与上清液的体积比为1∶50，不断搅拌，直至胶原蛋白全部析出。将盐析出来的胶原蛋白装入透析袋内，放入透析罐内透析5天。将透析完成的胶原蛋白加入交联罐中，加适量的注射用水至胶原蛋白胶液固体含量在2％，搅拌均匀后加入双环氧化物交联1h，双环氧化物与胶原蛋白胶液的体积比为1∶1000，将交联好的混合凝胶装入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时。在交联罐中加入适量注射用水，将冻干的胶原蛋白凝胶放入交联罐中，加入原花青素交联1h，原花青素与按注射用水体积比1∶1000。将交联好的胶原蛋白海绵放入适当规格的冻干盘内-80℃下冷冻干燥1小时，冻干完成后取得到胶原蛋白海绵。
胶原蛋白海绵的外观为白色海绵状薄片，有晶体光泽，浸水后有一定弹拉韧性。
胶原蛋白海绵的长为4.32～4.62cm，宽为4.57～4.61cm，厚为0.39～0.42cm。
胶原蛋白海绵的化学性能：吸水力为本身重量的50～56倍。胶原蛋白海绵的炽灼残渣0.2％，pH值6.2，胶原蛋白海绵的重金属含量(以铅计)小于10ug/g。羟脯氨酸含量为12％。蛋白质总量为96％。
胶原蛋白海绵的生物学性能：无菌检验(GB/T19973.2-2005)胶原蛋白海绵符合无菌规定。细胞毒性试验(GB/T 16886.5-2003)检测胶原蛋白海绵的细胞毒性为0～1级。细菌内毒素试验(EN455-3-2000)检测胶原蛋白海绵的细菌内毒素小于0.5EU/ml。Ames试验(GB/T16886.3-2008)检测为阴性。染色体畸变试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。微核试验(GB/T 16886.3-2008)检测为阴性。致敏试验(GB/T 16886.10-2005)检测无致敏反应。急性供毒试验(ISO 10993-11：2006)检测无急性生身毒性反应。植入后局部反应试验(ISO10993-6：2007)，胶原蛋白海绵植入1周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞及少量多核巨细胞，材料周围有肉芽组织包绕。植入4周后，在试样材料周围有较多的淋巴细胞、嗜中性粒细胞。植入12周后，植入部位有极少的淋巴细胞、嗜中性粒细胞，试样材料被降解吸收，无肉眼可辨别异物。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.胶原蛋白海绵的制备方法，包括如下步骤：
在pH值1.0～5.0的条件，将牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；
酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；
将盐析出的胶原蛋白进行透析；
在交联剂水溶液中将透析后的胶原蛋白交联；
将交联后的胶原蛋白凝胶冻干，在交联剂水溶液中将所述胶原蛋白交联，然后冷冻干燥得到胶原蛋白海绵。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述饱和盐溶液为饱和氯化钠溶液或饱和氯化钾溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂选自甲醛、戊二醛、碳化亚胺、双环氧化合物、京尼平、原花青素中任一种或几种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂水溶液中交联剂的体积百分含量为0.01～1％。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的浓度为0.01～1000mg/L。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述上清与所述饱和盐溶液的体积比为1∶(1～100)。
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