CN103966294A - 生物活性胶原提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物活性胶原提纯方法，包括：前处理步骤，对新鲜牛跟腱前处理制成碎片备用；酸法粗提步骤，取1重量份碎片加入4~8重量份醋酸或柠檬酸溶液并搅拌，然后经粗过滤、高速离心粗滤液后取上清液备用；酶法去端基步骤，调节上清液pH至9.0，再加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶进行酶解消化；梯度盐析步骤，用沉淀剂对酶解后的溶液进行多梯度盐析处理，获得溶解有胶原的溶液；透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，依次用醋酸溶液和纯水为透析外液进行透析，得到具有生物活性的胶原原液。本发明结合酸法和酶法两种现有胶原提取方法，既克服了酸法产率低又克服了酶法水解不彻底的缺点，且采用非动物源性蛋白酶，减小了关于动物源性的风险。

Description

生物活性胶原提取方法

技术领域

本发明涉及胶原提取技术领域，具体涉及一种生物活性胶原提取方法。

背景技术

胶原是细胞外基质的一种结构蛋白，具有三螺旋结构。胶原含有18种氨基酸，不含色氨酸，是一种非完全蛋白质。胶原的特殊结构使其广泛应用于诊断、治疗、康复及美容等方面。

胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，广泛分布于角膜、皮肤、骨骼、韧带、腱等部位，是组成结缔组织的重要结构蛋白。因此从动物组织提取胶原是获得胶原的重要途径。

在提取胶原的生产过程中会产生一些副产品胶原蛋白和明胶，明胶是由胶原变性解螺旋后不再具有生物活性的肽链组成，而胶原蛋白则是胶原降解为更小的链段组成。胶原之所以具有生物活性，主要取决于它的三螺旋结构，所以明胶和胶原蛋白都是没有生物活性的。

目前，胶原的提取方法主要有碱法、酸法、盐法及酶法。

碱法提取的优点在于反应迅速彻底，其缺点在于造成胶原肽键水解，破坏胶原的三螺旋结构，使含有羟基和巯基的氨基酸破坏且产生消旋。其产生的D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突变的危害，因此，碱法提取胶原不适合用于生物医用材料用胶原的提取。

酸法提取胶原主要是通过低离子浓度及酸性环境破坏胶原分子间的盐键和Schiff键，从而使胶原纤维溶胀、溶解来提取胶原。其优点在于最大限度的保持胶原分子的三螺旋结构，即生物活性，其缺点主要是产率低。

中性盐法提取胶原的主要缺点是其工艺不稳定，使得提取的胶原分子结构也不稳定。

酶法具有水解反应快、对环境友好等优点，而且提取的胶原纯度高、物理化学性质稳定，酶解可切除胶原分子端肽的非螺旋区，降低胶原的抗原性。其缺点是水解不够彻底。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种生物活性胶原提取方法，以提取出高生物活性的胶原原液。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种生物活性胶原提纯方法，步骤如下：

前处理步骤，将新鲜牛跟腱、牛皮或猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法脱去动物组织中的细胞，将脱去细胞的组织用冷却纯水清洗，然后放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1~1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

酸法粗提步骤，取1重量份备用的组织碎屑于烧杯中，加入0.05~0.5mol/L的醋酸或柠檬酸溶液4~8重量份，搅拌10~20小时，使组织碎屑充分溶胀，然后用滤网进行粗过滤，将粗滤液进行高速离心，取上清液备用；

酶法去端基步骤，用氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液缓慢调节上清液的pH至8.0~8.5，然后加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10~30小时；

梯度盐析步骤，用5~8mol/L的沉淀剂对酶解后的溶液进行多梯度盐析处理，获得溶解有胶原的溶液；

透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01~0.03mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为5~10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1~2天，然后将透析外液换成纯水，内外液比例5~10倍，每12小时更换一次透析外液，透析2~3天，即得到具有生物活性的胶原原液。

进一步地，所述透析步骤后还进行如下步骤：

超滤浓缩步骤，将透析步骤所得的胶原原液装入到超滤管中进行高速离心，获得高纯度胶原原液。

进一步地，本方法的各步骤均在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

进一步地，梯度盐析步骤中，边加沉淀剂边搅拌，沉淀剂的终浓度达到2mol/L后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后再加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解。

进一步地，酸法粗提步骤和超滤浓缩步骤中的高速离心的转速10000~15000rpm。

进一步地，所述梯度盐析步骤采用的沉淀剂为如下试剂中的任一种：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾和柠檬酸钠。

进一步地，酶法去端基步骤中，用于调节上清液pH的试剂为质量百分比为5%的氢氧化钠溶液。

进一步地，原料前处理步骤中，所述脱细胞法具体操作如下：用质量百分比为5~10%的氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.2~0.3%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，再用1~5%氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后再用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.05~0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时。

进一步地，原料前处理步骤中，用切片机将原料切成厚度为1~2mm的小片。

进一步地，酸法粗提步骤中采用不锈钢滤网进行粗滤。

采用上述技术方案后，本发明至少具有如下有益效果：本发明将酸法提取胶原和酶法提取胶原两种方法结合，既克服了酸法产率低又克服了酶法水解不彻底的缺点，且所用蛋白酶是非动物源性蛋白酶，减小了关于动物源性的风险。

本发明采用梯度盐析工艺，且盐析后用纯水漂洗多次，盐析时胶原随着盐溶液的加入会缓慢沉淀，也会带入少量胶原溶液中含有的各种杂蛋白，如角蛋白、纤连蛋白，层粘连蛋白，整合蛋白，以及各种糖蛋白等，经多次梯度盐析反复溶解沉淀，可最大程度地去除胶原中的杂蛋白，从而得到高纯度的胶原。

本发明采用机械搅拌、超声波处理以及阴离子表面活性剂结合的脱细胞法去除动物组织中的细胞，超声波可将细胞膜震碎，从而释放细胞内的细胞核、细胞器、细胞液等，可将组织中大部分引起免疫原型的杂质去除，如DNA、RNA以及各种糖蛋白等等，而且，经过此方式的前处理后还有利于后续脱脂，去除细胞膜。

附图说明

图1是本发明生物活性胶原蛋白提取方法的流程图。

图2为采用本发明生物活性胶原蛋白提取方法获得的胶原的SDS-PAGE电泳图。

图3为采用本发明生物活性胶原蛋白提取方法获得的胶原的DSC热变性温度图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互结合。

请参考图1所示的实施方式，本发明提供一种生物活性胶原提纯方法，包括如下步骤：

前处理步骤，将新鲜牛跟腱、牛皮或猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法将动物组织中的细胞脱去，具体方法如，用质量百分比为5~10%的氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后用超声波处理0.5~1小时，再用质量百分比为0.2~0.3%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，再用1~5%氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后再用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.05~0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，最后用冷却纯水清洗后，放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1~1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

酸法粗提步骤，取1重量份备用的碎片于烧杯中，加入0.05~0.5mol/L的醋酸或柠檬酸溶液4~8重量份，搅拌10~20小时，使牛跟腱组织充分溶胀，然后将酸溶液进行粗过滤，优选采用耐酸蚀的不锈钢滤网，最后，将粗滤液进行高速离心，取上清液备用，高速离心的转速优选为10000~15000rpm；

酶法去端基步骤，用5%的氢氧化钠溶液缓慢调节上清液的pH至8.0~8.5，然后加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10~30小时；

梯度盐析步骤，先用5~8mol/L的沉淀剂进行盐析，可以选用氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、柠檬酸钠等试剂中的任一种作为沉淀剂，边加沉淀剂边搅拌，沉淀剂终浓度达到2mol/L后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水进行漂洗多次，然后加入0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗数次，然后加入0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗数次，然后加入0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，获得溶解有胶原的溶液；

透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01~0.03mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为5~10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1~2天。然后将透析外液换成纯水，内外液比例5~10倍，每12小时更换一次透析外液，透析2~3天，即可得到具有生物活性的胶原原液，透析后胶原原液质量分数大概为0.5%。

而为进一步纯化胶原，获得高纯度的胶原原液，在透析步骤之后还可进一步进行超滤浓缩步骤，将透析步骤所得的胶原原液装入到超滤管中，高速离心，即获得高纯度的胶原原液，高速离心的转速优选为10000~15000rpm，超浓缩后，高纯度的胶原原液的质量分数可达1.5%以上。

为获得更好的产品品质，以上所述的各工艺步骤均优选在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

本发明采用机械搅拌和超声波处理结合的方式去除牛跟腱组织中的细胞，超声波可将细胞膜震碎，从而释放细胞内的细胞核、细胞器、细胞液等，可将组织中大部分引起免疫原型的杂质去除，如DNA、RNA以及各种糖蛋白等等，而且，经过此方式的前处理后还有利于后续脱脂，去除细胞膜。

本发明将酸法提取胶原和酶法提取胶原两种方法结合，既克服了酸法产率低又克服了酶法水解不彻底的缺点，且所用蛋白酶是非动物源性蛋白酶，减小了关于动物源性的风险。

本发明采用梯度盐析工艺，且盐析后用纯水漂洗多次，盐析时胶原随着盐溶液的加入会缓慢沉淀，也会带入少量胶原溶液中含有的各种杂蛋白，如角蛋白、纤连蛋白，层粘连蛋白，整合蛋白，以及各种糖蛋白等，经多次梯度盐析反复溶解沉淀，可最大程度地去除胶原中的杂蛋白，从而得到高纯度的胶原。

图2示出的本发明的提取方法所获得的胶原样品和用于参照的标准样品电泳图，图中的第1泳道为标准样品，第2泳道为采用本发明的提取方法所提取的胶原样品，α链分子量约为10万，β是两条α链的二聚体，γ是三条α链的三聚体。从图2中可以看出，采用本发明的方法获得的胶原样品与标准样品的电泳性能相当。

图3为采用本发明生物活性胶原蛋白提取方法获得的胶原的DSC热变性温度图，经检测，采用本发明生物活性胶原蛋白提取方法获得的胶原样品的热变性温度为101.57℃。而Sionkowska A等人采用DSC法研究胶原的热变性行为时，测得未变性胶原的热变性温度为101.9℃（Thermal helix-coil transition in UV-irradiated collagen from rat tail tendon. International Journal of Biomaterials Macromolecules,1999,24:337-340），这一温度与采用本发明方法所得胶原产品的热变性温度相当。胶原的热变性主要是由于胶原材料中两交联点间区域内的三股螺旋结构向无规线团结构的转变，其热变温度高，说明产品本身还保留着三螺旋结构，由此，证明了采用本发明的方法提取的胶原产品生物活性高。

以下通过几个实施例对本发明的提取方法进行详细具体描述。以下各实施例的各工艺步骤均是在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

实施例1

（1）前处理步骤，将新鲜牛跟腱用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法将动物组织中的细胞脱去，具体方法是，用质量百分比为10%的氯化钠溶液浸泡搅拌2小时，然后用超声波处理0.5小时，再用质量百分比为0.3%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2小时，再用5%氯化钠溶液浸泡搅拌2小时，然后再用超声波处理0.5小时，然后用质量百分比为0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2小时，最后用冷却纯水清洗后，放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

(2)酸法粗提，取1重量份过滤后牛跟腱碎片于烧杯中，加入0.05mol/L的醋酸溶液8重量份，搅拌10小时，使牛跟腱组织充分溶胀，然后将酸溶液用不锈钢滤网进行粗过滤，最后将粗滤液进行高速离心，取上清液，离心机转速10000rpm。

（3）酶法去端基，用5%的氢氧化钠溶液调节上清液的pH直至8.0，然后加入0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10小时。

（4）梯度盐析，先用8mol/L的氯化钠进行盐析，边加边搅拌，氯化钠终浓度达到2mol/L，然后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水进行漂洗多次，然后加入0.05mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的氯化钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.05mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的氯化钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.05mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，获得溶解有胶原的溶液。

（5）透析，将梯度盐析所得的溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液比例为5倍，每8小时更换一次透析外液，透析2天。然后将透析外液换成纯水，内外液比例5倍，每12小时更换一次透析外液，透析3天。

（6）超滤浓缩，将所得透析液装入到超滤管中，高速离心，离心机转速15000rpm。

实施例2

（1）前处理步骤，将新鲜牛皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法将动物组织中的细胞脱去，具体方法是，用质量百分比为5%的氯化钠溶液浸泡搅拌2小时，然后用超声波处理1小时，再用质量百分比为0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌3小时，再用1%氯化钠溶液浸泡搅拌2小时，然后再用超声波处理1小时，然后用质量百分比为0.05%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，最后用冷却纯水清洗后，放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1%的氢氧化钠溶液浸泡4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

(2)酸法粗提，取1重量份过滤后组织碎屑于烧杯中，加入0.5mol/L的醋酸溶液4重量份，搅拌20小时，使组织碎屑充分溶胀，然后将酸溶液用不锈钢滤网进行粗过滤，最后将粗滤液进行高速离心，取上清液，离心机转速15000rpm。

（3）酶法去端基，用5%的氢氧化钠溶液调节上清液的pH直至8.5，然后加入0.1%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化30小时。

（4）梯度盐析，先用5mol/L的柠檬酸钠进行盐析，边加边搅拌，柠檬酸钠终浓度达到2mol/L，然后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水进行漂洗多次，然后加入0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的柠檬酸钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的柠檬酸钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，获得溶解有胶原的溶液。

（5）透析，将梯度盐析所得的溶解好的胶原溶液装入透析袋中，用0.01mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液比例为10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1天。然后将透析外液换成纯水，内外液比例10倍，每天换两次，透析2天。

（6）超滤浓缩，将所得透析液装入到超滤管中，高速离心，离心机转速10000rpm。

实施例3

（1）前处理步骤，将新鲜猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法将动物组织中的细胞脱去，具体方法如，用质量百分比为7%的氯化钠溶液浸泡搅拌1.5小时，然后用超声波处理0.8小时，再用质量百分比为0.25%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2.5小时，再用2.5%氯化钠溶液浸泡搅拌1.5小时，然后再用超声波处理0.8小时，然后用质量百分比为0.1%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2.5小时，最后用冷却纯水清洗后，放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.12%的氢氧化钠溶液浸泡3小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

(2)酸法粗提，取1重量份过滤后组织碎屑于烧杯中，加入0.3/L的醋酸溶液6重量份，搅拌16小时，使组织碎屑充分溶胀，然后将酸溶液用不锈钢滤网进行粗过滤，最后将粗滤液进行高速离心，取上清液，离心机转速12000rpm。

（3）酶法去端基，用5%的氢氧化钠溶液调节上清液的pH直至8.2，然后加入0.2%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化20小时。

（4）梯度盐析，先用6mol/L的沉淀剂硫酸钠进行盐析，边加边搅拌，硫酸钠终浓度达到2mol/L，然后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水进行漂洗多次，然后加入0.3mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的硫酸钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.3mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的硫酸钠盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入0.3mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，获得溶解有胶原的溶液。

（5）透析，将梯度盐析所得的溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为8倍，每8小时更换一次透析外液，透析2天。然后将透析外液换成纯水，内外液比例7倍，每天换也两次，透析2.5天。

（6）超滤浓缩，进一步纯化胶原，将所得透析液装入到超滤管中，高速离心，转速12000rpm。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同范围限定。

Claims (10)

1. 一种生物活性胶原提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

前处理步骤，将新鲜牛跟腱、牛皮或猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法脱去动物组织中的细胞，将脱去细胞的组织用冷却纯水清洗，然后放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1~1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

酸法粗提步骤，取1重量份备用的组织碎屑于烧杯中，加入0.05~0.5mol/L的醋酸或柠檬酸溶液4~8重量份，搅拌10~20小时，使组织碎屑充分溶胀，然后用滤网进行粗过滤，将粗滤液进行高速离心，取上清液备用；

酶法去端基步骤，用氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液缓慢调节上清液的pH至8.0~8.5，然后加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10~30小时；

梯度盐析步骤，用5~8mol/L的沉淀剂对酶解后的溶液进行多梯度盐析处理，获得溶解有胶原的溶液；

透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01~0.03mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为5~10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1~2天，然后将透析外液换成纯水，内外液比例5~10倍，每12小时更换一次透析外液，透析2~3天，即得到具有生物活性的胶原原液。

2. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，所述透析步骤后还进行如下步骤：

超滤浓缩步骤，将透析步骤所得的胶原原液装入到超滤管中进行高速离心，获得高纯度胶原原液。

3. 如权利要求1或2所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，本方法的各步骤均在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

4. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，梯度盐析步骤中，边加沉淀剂边搅拌，沉淀剂的终浓度达到2mol/L后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后再加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解。

5. 如权利要求2所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酸法粗提步骤和超滤浓缩步骤中的高速离心的转速10000~15000rpm。

6. 如权利要求1或4所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，所述梯度盐析步骤采用的沉淀剂为如下试剂中的任一种：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾和柠檬酸钠。

7. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酶法去端基步骤中，用于调节上清液pH的试剂为质量百分比为5%的氢氧化钠溶液。

8. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，原料前处理步骤中，所述脱细胞法具体操作如下：用质量百分比为5~10%的氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.2~0.3%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，再用1~5%氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后再用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.05~0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时。

9. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，原料前处理步骤中，用切片机将原料切成厚度为1~2mm的小片。

10. 如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酸法粗提步骤中采用不锈钢滤网进行粗滤。