CN107550933B

CN107550933B - 一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架及其制备方法和用途

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Publication number: CN107550933B
Application number: CN201710797883.7A
Authority: CN
Inventors: 龙乾发; 李征宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Shaanxi Lanyiwei Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN107550933A

Abstract

本发明提供一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架及其制备方法和用途，包括纳米胶原以及分散于纳米胶原中的外泌体。由动物组织中分离胶原，球磨为纳米尺度；由骨髓或脐带间充质干细胞的培养物中分离外泌体；将外泌体与胶原混合、冷冻干燥。本发明将外泌体分散至纳米尺度的胶原中，形成具有定向释放外泌体功能的生物支架材料，可以显著提高外泌体的靶向修复和治疗作用，符合精准给药的发展趋势，剂型多样，具有广泛的临床应用价值。

Description

一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医学生物材料领域，具体涉及外泌体复合胶原生物支架。

背景技术

国内外研究证实骨髓或脐带间充质干细胞外泌体(MSC-derived exosomes,MSC-Exo)具有明显的免疫调节作用和神经保护功能，相比单纯细胞治疗，MSC-Exo更易于透过皮肤、黏膜、神经鞘膜、筋膜、血脑屏障及创伤后受损组织，规避细胞致瘤风险，且方便冻融保存，综合提示MSC-Exo可以成为临床更理想的生物修复剂。但目前MSC-Exo用于治疗疾病尚存诸多问题，其中最重要的一点是现有给药手段，如静脉注射、鼻内给予、脑室给药等，易于扩散，导致MSC-Exo无法集中部位定向给药，难以形成作用靶点，因此，急需构建可实现MSC-Exo靶向/定向治疗作用的载药系统，从而充分发挥MSC-Exo潜在的广泛的治疗用途。

目前市场上已经具有的胶原、明胶、壳聚糖、PLGA、组织工程材料、TCP、HA、钙化物、氟化物、含钙化合物及其不同比例混合物或者生物支架，很少见到与外泌体相结合的有关产品，主要应用的还是由单纯外泌体构成的单体成分产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架及其制备方法和用途。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架，包括纳米胶原以及分散于纳米胶原中的外泌体。

所述外泌体在纳米胶原中的分散浓度按质量分数计为1～10％，优选为3～5％。

所述纳米胶原采用分离自动物组织的胶原经球磨而制成。

所述生物支架的剂型包括注射剂、水剂(非注射)、冻干剂、外敷型喷剂、口服剂(口服液)以及膜型(非填料)，其中冻干剂包括海绵型(可作为修复缺损的填料)以及粉末型。

上述定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架的制备方法，包括以下步骤：

1)由动物组织中分离胶原(例如，I型胶原)，经球磨得到纳米胶原；

2)由骨髓或脐带间充质干细胞(MSC)的培养物中分离外泌体；

3)将步骤2)得到的外泌体与步骤1)得到纳米胶原按照一定的比例于溶剂(例如水)中混合均匀，得混合溶液；

4)将混合溶液冷冻干燥，得到冻干剂等固体剂型；将固体剂型经溶剂(例如水、醋酸)溶解等步骤，得到注射剂、水剂、外敷型喷剂、口服液等液体剂型。

所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)取富含胶原的动物组织，经脱脂以及洗涤后，得到胶原提取的原料；

1.2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到(海绵状)胶原；

1.3)将步骤1.2)得到的(海绵状)胶原低温球磨≥24h，得到纳米胶原。

上述定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架在制备用于抑制神经胶质细胞活化的药物中的应用。

上述定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架在制备用于海马神经元缺失性疾病治疗的药物以及增强皮肤细胞、受损组织细胞、神经细胞代谢的药物中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明将外泌体分散至纳米尺度的胶原中，形成具有定向释放外泌体功能的生物支架材料，纳米尺度的胶原溶解后与外泌体结合更快，结合更牢固，使生物支架给至待修复部位后，外泌体释放更彻底，具有更好的靶向性，可以显著提高外泌体的靶向修复和治疗作用，符合精准给药的发展趋势，剂型多样，具有广泛的临床应用价值。

进一步的，胶原的类型多样(I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X等型胶原)，来源广泛，可体内降解，使得生物支架材料成本低、生物相容性好、毒性低，符合医药领域的规范要求。

本发明中的制备方法简单易行，成本低，工艺流程可控性强，生产效率高。

进一步的，本发明制备的胶原纯度高、活性得到有效保留，且杂质少。

本发明构建具有定向释放功能的复合生物支架，实现外泌体的靶向缓释治疗作用，在特定的靶向位点上展现出更优的调控作用，加强局部作用。

附图说明

图1为纳米胶原制备流程图。

图2为胶原显微视图。

图3为MTT法检测细胞生物活性的结果。

图4为定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架作用结果之一。

图5为定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架作用结果之二。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

1.主要试剂和仪器

胃蛋白酶、氯仿、冰醋酸、NaHCO₃、NaCl、高速离心机、冷冻干燥机、深低温冰箱、绞肉机、透析膜、液氮行星球磨机。

2.方法

2.1胶原制备

(1)预处理：取新鲜的牛(猪、羊或其他动物)跟腱、牛(猪、羊或其他动物)皮、牛(猪、羊或其他动物)关节软骨等生物材料(例如，取皮)，洗净切除皮下脂肪及真皮层，剔除筋膜，去毛，切细。

(2)脱脂：经过切细的生物材料用双蒸水洗涤，绞肉机内绞碎，氯仿-甲醇(例如，体积比1:1)混合溶剂中2～6℃(例如4℃)浸泡脱脂，浸泡时间为3～6h(例如4h)，期间间断搅拌。

(3)洗涤：将上述脱脂的生物材料于NaCl和NaHCO₃混合水溶液(NaCl质量分数为2％～30％，NaHCO₃质量分数为1％～10％，例如，均为10％)中2～6℃(例如4℃)浸泡，浸泡时间为3～8h(例如4h)，期间不断搅拌；然后双蒸水洗涤3～5次(例如，3次)，再以1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，倒掉液体，固体使用300～800目(例如，800目)筛子去除杂质、血清等成分，所得沉淀(筛余物)即为胶原提取的原料。

(4)提取胶原(图1)：

抽提：将原料浸没于0.5～1M醋酸(例如，1M)中2～6℃(例如4℃)浸泡10～72h(例如，48h)后，加入胃蛋白酶进行抽提(消化)，于2～4℃(例如置于4℃冰箱内)共抽提1～7天(例如，2～3天)，期间磁力搅拌器连续搅拌，得到抽提液；胃蛋白酶:原料的质量比为0.1～5:10～80(例如，1:10)。

离心：将上述抽提液于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心5～60min(例如，15min)，去除沉淀，所得上清液为胶原粗提液。

盐析：胶原粗提液加入质量分数2％～30％NaCl水溶液(例如，10％)中至有大量白色沉淀析出，2～6℃(例如4℃)静置5～60min(例如，30min)，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，弃掉上清液，沉淀为粗提胶原物。

复溶：粗提胶原物复溶到0.5～10M醋酸(例如，1M)中，于1000～20000r/min(例如20000r/min)离心3～60min(例如，15min)，除去不溶杂质，保留上清液。

透析：将复溶步骤所得上清液放入截留分子量为8000～20000Da透析膜(例如，14000Da)中，浸入双蒸水中2～6℃(例如4℃)透析24～72h(例如，48h)，每隔1～2h换液(双蒸水)一次，透析后获得精制胶原液(透析膜包裹的液体为精致胶原液)，即生物胶原溶液。

冻干：将精致胶原液放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干(-70℃缓慢升至-20℃，每2～4小时升温1～2℃)后，即可得到海绵状胶原(图2)。

球磨：将海绵状胶原于液氮行星球磨机中(-70℃～-20℃)球磨24h～72h(例如，48h)，得到纳米胶原。

(5)鉴定和活性分析

对胶原用Co₆₀或环氧乙烷等方法进行消毒，之后再对其成分、纯度、生物相容性进行精确鉴定。

表1.胶原成分对照表

将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的氨基酸组成对照，可以看出，二者氨基酸构成基本一致(表1)，将制备的海绵状胶原与I型胶原标准品的SDS-PAGE凝胶电泳图谱相对照，结果谱型一致，从上至下依次是γ链(分子量为130,000)、β链(分子量为98,000)、α链(分子量为97,200)，证明本实施例所制备的为纯度较高的I型胶原。

经鉴定为I型胶原(或其他类型胶原)后进行球磨，将球磨后的纳米胶原通过重溶和冻干制成固相纳米胶原支架，与胶原标准品(非纳米)制成的固相标准胶原支架一并接种骨髓间充质干细胞，进行生物活性(毒性)检测。使用MTT法对接种于两种不同支架上的骨髓间充质干细胞进行检测。随着接种时间的增长，接种于两种支架上的细胞数目不断增多，且发现纳米胶原支架具有更高的组织相容性，细胞生长更快(图3中，黑色实心为固相纳米胶原支架结果，圆形空心为固相标准胶原支架，*表示差异显著)。

2.2外泌体分离和鉴定

取第3～5代骨髓或脐带MSCs培养至70～80％融合，PBS漂洗后加入化学定性和蛋白培养基(chemically defined and protein medium,CDPF)继续孵育6h(37℃)，而后新鲜CDPF置换继续培养42h。收集培养基高速离心(2,565×g)15min除去细胞碎片，继而收集悬液加入含阴离子交换树脂(Catalog#4079302,Whatman)的离子柱，离子柱用平衡液预处理(流动相)，流速设为4mL/min，离子柱滤过完成后，平衡液漂洗离子柱交换树脂，最后用50mM氨丁三醇缓冲剂洗脱并收集洗脱液(外泌体)，BCA试剂盒定量后储存于-20℃条件下，备用。

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)或FCM检测外泌体CD63、CD81、CD9、CD13等抗原表达。外泌体数量和大小进一步采用纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)，设备(Nanosight LM10；Malvern)采用聚苯乙烯乳胶微球(NTA4088,100nm)标准化。CD63和CD81表达率≥95％，CD9和CD13表达率≤2％，外泌体数量≥10×10¹¹/mL(10～15×10¹¹/mL)，外泌体直径为50～150nm。冷冻干燥后备用。

2.3复合

将纳米胶原溶解于双蒸水中，加入外泌体，磁力搅拌器搅拌均匀，配制成胶原质量分数为0.1％～10％的混合液，静置后无明显沉淀，获得混合液后，放入大培养皿中，冷冻干燥机中进行冻干后，即可得到获得复合外泌体的新型医用胶原海绵(即海绵状固体形态的MSC-Exo复合纳米胶原生物支架)，经检测，外泌体在胶原中的分散浓度为3％～5％(w/w)。

3.MSC-Exo复合纳米胶原生物支架活性实验

实验1MSC-Exo复合纳米胶原生物支架对胶质细胞活化的抑制作用

8-10周SD大鼠腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(5mg/kg)建立神经炎症动物模型，分别接受10μL PBS(对照组I，硬膜下注射，n＝10)、约6mm²MSC-Exo胶原复合生物支架(对照组II，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝10)、约6mm²MSC-Exo复合纳米胶原生物支架(实验组，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝12)处理，炎症高峰期4～6天收集各组样本，同龄段正常SD大鼠设为阴性对照。取脑组织切片行免疫组化染色Iba1(小胶质细胞标记物)和GFAP(星形胶质细胞标记物)，Image J软件分析结果。

实验1免疫组化染色结果显示，对照组I见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4A)胞体大、突起明显，提示SD大鼠腹腔注射LPS后颅内神经胶质细胞明显活化，明显诱发神经炎症；对照组II(外泌体+I型非纳米胶原)见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4B)胞体突起回缩，提示神经胶质细胞活化被抑制；实验组见海马和皮层GFAP+和Iba1+细胞(图4C)胞体和突起形态与阴性对照相差不大，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架较对照组II显著抑制神经炎症的胶质细胞活化。Image J分析结果显示，对照组I、对照组II和实验组阳性细胞的面积百分比分别为GFAP+：64.3±8.9％，Iba1+：57.7±4.2％；GFAP+：37.3±2.9％，Iba1+：27.5±4.9％；GFAP+：24±1.7％，Iba1+：19.7±3.2％(P＜0.01，实验组vs.对照组I或对照组II)。

根据实验1结论，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架可用于抑制颅脑损伤、脑卒中、癫痫等诱发的神经胶质细胞活化(即神经炎症)。

实验2MSC-Exo复合纳米胶原生物支架的神经保护作用

8-10周SD大鼠接受3-5次(每次间隔45min)海人酸腹腔注射，诱导4级癫痫发作2小时，建立海马神经损伤模型，分别接受10μL PBS(对照组I，硬膜下注射，n＝10)、约6mm²MSC-Exo胶原复合生物支架(对照组II，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝10)、约6mm²MSC-Exo复合纳米胶原生物支架(实验组，含10×10⁹MSC-Exo，硬膜下植入，n＝12)处理，神经损伤模型诱导处理1周后收集各组样本，同龄段正常SD大鼠设为阴性对照。取脑组织切片行免疫组化染色NeuN(神经元标记物)，体视学定量分析实验结果。

实验2结果表明：对照组I见NeuN+细胞在海马CA1区(图5A)和齿状回门区(DH)较正常组明显减少，对照组II见海马CA1(图5B)和DH区神经元损失(NeuN+细胞)均较对照组I改善，实验组见NeuN+细胞在海马CA1区(图5C)和齿状回门区(DH)较对照组II显著增多。体视学定量分析NeuN+细胞量在各组分别为：对照组I CA1：1.4±0.15×10⁵，DH：0.9±0.11×10⁴；对照组II CA1：2.2±0.48×10⁵，DH：1.4±0.24×10⁴；实验组CA1：2.5±0.32×10⁵，DH：1.7±0.18×10⁴(P＜0.05，实验组vs.对照组I或对照组II)。综合提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架较MSC-Exo胶原复合生物支架硬膜下植入对神经损伤具有更好的神经保护作用。

根据实验2结论，提示MSC-Exo复合纳米胶原生物支架可以用于治疗癫痫、阿尔兹海默病、颅脑损伤、脑卒中等海马神经元缺失性疾病。

以上结论同样适用于其他类型胶原。

根据其他实验结果，对于注射剂、水剂、膜型、外敷型喷剂、口服液等不同形态的生物支架，可以用于治疗神经、皮肤、软组织等一种或多种复合系统疾病。

总之，本发明证明不同形态的MSC-Exo复合纳米胶原生物支架，可以用于有关神经损伤、软骨损伤及皮肤、皮下组织损伤的修复，以及一种或多种复合系统疾病的治疗，可以作为食品、药品、保健品和化妆品的材料，应用于医疗、美容、康复等领域。

Claims

1.一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架，其特征在于：包括纳米胶原以及分散于纳米胶原中的骨髓或脐带间充质干细胞外泌体；所述外泌体在纳米胶原中的分散浓度按质量分数计为3～5％。

2.根据权利要求1所述一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架，其特征在于：所述纳米胶原采用分离自动物组织的胶原经球磨而制成。

3.根据权利要求1所述一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架，其特征在于：所述生物支架的剂型选自注射剂、水剂、冻干剂、外敷型喷剂、口服剂或膜型。

4.根据权利要求3所述一种定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架，其特征在于：所述冻干剂为海绵型或粉末型。

5.如权利要求1所述的定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)由动物组织中分离胶原，经球磨得到纳米胶原；

2)由骨髓或脐带间充质干细胞的培养物中分离外泌体；

3)将步骤2)得到的外泌体与步骤1)得到纳米胶原按照一定的比例于溶剂中混合均匀，得混合溶液；

4)将混合溶液冷冻干燥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.2)将胶原提取的原料依次经过浸泡、酶解、离心、盐析、复溶、透析、冻干，得到胶原；

1.3)将步骤1.2)得到的胶原球磨≥24h，得到纳米胶原。

7.如权利要求1所述的定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架在制备用于抑制神经胶质细胞活化的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的定向释放功能的外泌体复合胶原生物支架在制备用于海马神经元缺失性疾病治疗的药物以及增强皮肤细胞、受损组织细胞、神经细胞代谢的药物中的应用。