KR20230174269A

KR20230174269A - 골관절 질환 및 자가면역 질환 치료를 위한 제대 중간엽세포 세포외 소포(umbilical cord mesenchymal cell extracellular vesicles for the treatment of osteoarticular and autoimmune diseases)

Info

Publication number: KR20230174269A
Application number: KR1020237040308A
Authority: KR
Inventors: 마룬 쿠리; 프란시스카 알카야가; 알리오샤 피게로아
Original assignee: 콘소르시오 레제네로 에스.에이.
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2023-12-27
Also published as: WO2022221969A1; EP4328307A1; JP2024514273A; BR112023021931A2; CL2023003152A1

Abstract

특정 마커 및 miRNA와 함께 제대 중간엽 세포의 세포외 소포(EV)가 풍부한 조성물에 관한 것으로서, 이러한 조성물은 골관절 및 자가면역 질환의 치료에 유용하다. 특히 제대 중간엽 세포의 세포외 소포(EV)에 풍부한 조성물은 가장 풍부한 10개의 miRNA 중 hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p, 또는 hsa-miR-6780b-5p인 miRNA가 포함된 EV 세트, 여기서 하기 miRNA 중 적어도 5개를 추가로 포함하며: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa- miR-6088, hsa-miR-1307-5p 또는 hsa-miR-6782-5p; 그리고 표면 마커 CD63, CD81 및 CD9가 있으며, 및 동물성 성분과 단백질이 없고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인 배지 또는 비히클로 구성된다. 이러한 조성물을 얻는 방법과 골관절 및 자가면역 질환 치료의 용도에 관한 것이다.

Description

골관절 질환 및 자가면역 질환 치료를 위한 제대 중간엽세포 세포외 소포(UMBILICAL CORD MESENCHYMAL CELL EXTRACELLULAR VESICLES FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTICULAR AND AUTOIMMUNE DISEASES)

본 발명은 생명공학의 일반 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 골관절 및 자가면역 질환의 치료를 위한 재생 의학 분야 및 인간 중간엽 세포, 특히 세포외 소포를 기반으로 한 치료제의 제조에 관한 것이다.

현재, 세포 치료는 연구와 임상 적용 사이의 가교 역할을 하며, 기능을 회복하기 위해 인간 세포, 조직, 또는 기관을 대체, 재생 또는 변형하기 위한 조직 공학과 관련하여 진보를 이루고 있다. 이러한 변화는 줄기 세포, 주로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 사용하는 임상 시험의 수가 증가함에 따라 동반되고 장려된다. 세포 치료 분야가 다양한 의료 응용 분야에서 급속히 발전했지만, 한편으로는 많은 사람들과 새로운 분야에 도움을 줄 수 있도록, 이러한 기술의 비용을 낮추고, 더 효율적이고 안전하게 만들 수 있도록 개발 과정에 더 나은 솔루션이 필요한 몇 가지 기술적 문제가 있다.

이와 관련하여 보다 안전하고 비용이 적게 드는 최근의 접근법은 세포 배양 중에 세포에서 자연적으로 분비되는 소포를 사용하는 것인데. 소포가 무세포 치료법에 대한 큰 잠재력을 가지고 있는 것으로 나타났기 때문이다. 연구자들은 세포 간 의사소통에서 중요한 역할을 하고, 근본적으로 단백질과 RNA에 해당하는 내용물을 통해 질환의 형성 또는 조절에 영향을 미치는 것을 포함하여, 다양한 분야에서의 이러한 소포의 기능을 연구했다. 특히 이러한 소포에는 2000 내지 3000가지 유형의 마이크로RNA 또는 miRNA가 많이 포함되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 분자는 비암호화 RNA 가닥으로, 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 한다. 세포외 소포의 하위 집합은 엑소좀(30 내지 200 nm)이며, 이미 다양한 약물 전달을 위한 소포로서 사용되어 왔다.

현재, 엑소좀 또는 작은 세포외 소포(sEV)를 포함하는 세포외 소포를 기반으로 한 치료법의 개발은 전임상 연구에서 발전을 이루었으며, 본 발명에서 제안한 것과 같은 임상 적용 가능성이 매우 높다.

최신 기술로는 다양한 진단 적용과 분리된 엑소좀을 사용한 일부 치료법이 있으며, 예를 들어, 국제공개 WO2019038660A1호(Seattle Childrens Hospital DBA Seattle Childrens Res Inst, 2019-02-28)는 환자의 체액에 존재하는 엑소좀을 검사하여 가와사키병을 진단하는 방법을 보호한다.

녹내장과 같은 일부 질환의 치료를 위해 중간엽 세포의 엑소좀을 사용하는 일부 특허 출원(미국 특허 US20190224242A1 호, 문헌[Tomarev et al, 2019-07-25])이 있지만, 해당 문서에서 관찰된 특성과 사용된 조성물은 본 발명의 조성물과는 매우 다르며, 예를 들어, 응용에서 엑소좀은 마커 CD11c+ 및 CD63+를 갖는 반면, 본 발명에서는 단지 한 가지 차이점을 언급하기 위해 마커 CD63, CD81, 및 CD9가 필요하다.

발명자는 선행 기술에서 본 발명을 예상하는 어떠한 문서도 발견하지 못했다. 따라서, 본 발명은 골관절 및 자가면역 질환 치료를 위한 miRNA 및 특정 표면 마커를 함유하는 제대 중간엽 세포(UC-MSC)로부터 얻은 엑소좀의 조성물을 목표로 한다.

도 1. 본 발명의 조성물로 치료하면 골관절염의 뮤린 모델에서 병변의 중증도가 감소한다(연구 1). a) OA 조직학 점수(또는 OA 점수)는 건강한 관절(위장(sham) 또는 위약(placebo)), 골관절염이 있는 관절, 및 본 발명의 조성물(엑소좀)로 치료된 골관절염이 있는 관절을 보여줌. b) "위장(sham)" 대조군 무릎(왼쪽), OA 유도된 무릎(중앙), 및 본 발명의 조성물, 즉 엑소좀으로 치료된 무릎(오른쪽)의 조직학적 절편을 보여주는 대표적인 이미지. OA 그룹에 비해 p < 0.05로 엑소좀을 처리한 무릎에서 연골하골의 비율이 더 높게 관찰되었다.
도 2. 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 골관절염의 뮤린 모델에서 골 무기물 밀도에 긍정적인 결과를 보여준다(연구 2). a) 3D 이미지의 조직 형태학적 분석에 해당하는 무릎의 내측 경골의 골 무기물 밀도 분석. b) "위장(sham)" 대조군의 무릎(왼쪽), OA 유도가 있는 무릎(중앙), 및 엑소좀 치료가 있는 무릎(오른쪽)의 μCT로 관찰된 내측 경골의 이미지를 보여주는 대표 이미지로, 무기질침착을 나타내는 색상 척도로 가장 왼쪽은 무기질침착이 가장 낮은 평가이고, 맨 오른쪽은 무기질침착이 가장 높은 평가임. 무기질침착 정도와 관련하여 관찰된 색상이 "위장(sham)" 대조군에서 획득된 색상, 즉 상기에서 기재한 척도의 왼쪽에 있는 색상과 유사하기 때문에 엑소좀을 사용한 치료는 추가적인 뼈의 무기질침착을 방지하는 것으로 관찰된다.
도 3. 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 골관절염의 뮤린 모델에서 골 무기질 밀도에 긍정적인 결과를 보여준다(연구 3). a) 3D 이미지의 조직 형태학적 분석에 해당하는 무릎의 내측 경골의 골 무기질 밀도 분석. b) "위장(sham)" 대조군의 무릎(왼쪽), OA 유도가 있는 무릎(중앙), 및 엑소좀 치료가 있는 무릎(오른쪽)의 μCT로 관찰된 내측 경골의 이미지를 보여주는 대표 이미지로, 무기질침착을 나타내는 색상 척도로 가장 왼쪽은 무기질침착이 가장 낮은 평가이고, 맨 오른쪽은 무기질침착이 가장 높은 평가임. 무기질침착 정도와 관련하여 관찰된 색상이 "위장(sham)" 대조군에서 획득된 색상, 즉 상기에서 기재한 척도의 왼쪽에 있는 색상과 유사하기 때문에 엑소좀을 사용한 처리는 추가적인 골의 무기질침착을 방지하는 것으로 관찰된다.
도 4. 본 발명의 조성물로 치료하면 CD4+ Th 세포의 증식이 감소된다. a) PHA(20 μg/mL)로 활성화되고, PBS 대조군과 본 발명의 조성물로 처리된 말초 혈액 단핵 세포에서, CD4+ Th 세포의 증식은 배양 3일째에 나타난다. b) 5일째에 증식. 본 발명의 조성물은 두 경우 모두 대조군보다 증식이 적다.
도 5. 본 발명의 조성물로 처리하면 Treg 세포의 증식이 증가하고; 마커 CD4, FOXP3, 및 CD25를 보유하는 것이 특징이다. PHA(20 μg/mL)로 활성화되고, PBS 대조군과 본 발명의 조성물로 처리된 말초 혈액 단핵 세포에서 Tregs 세포의 증식은 배양 3일째에 나타난다. 본 발명의 조성물은 대조군보다 더 큰 증식을 허용한다.
도 6. 본 발명의 조성물로 처리하면 대식세포의 분화가 긍정적으로 극성화된다. 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리되었으며, 배양되어, M-CSF 및 GM-CSF 인자에 의해 대식세포로 분화되었고, 6일째에 PBS 대조군과 본 발명의 조성물로 처리되었고, a) 자극 24시간 후 M1 또는 전염증성 대식세포의 증식은 sEV 발명의 조성물에 의해 감소되고, b) 자극 후 24시간에 M2 대식세포 또는 항염증 물질의 증식이 sEV 발명의 조성물에 의해 증가된다.
도 7. 본 발명의 조성물에 존재하는 세포외 소포 내 hsa-miRNA의 상대적인 농도를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 특정 마커 및 miRNA와 함께 제대 중간엽 세포의 세포외 소포(EV)가 풍부한 조성물에 관한 것이며, 이러한 조성물은 특히 치료할 병변 부위에 주사되는 경우 골관절 및 자가면역 질환의 치료에 유용하다.

구체적으로, 본 발명은 제대 중간엽 세포의 세포외 소포(EV)에서 농축된 조성물을 목표로 하며, 가장 농도가 높은 10개의 miRNA 중 hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p, 및 hsa-miR-6780b-5p의 miRNA를 포함하며, 추가로 하기 miRNA 중 적어도 5개를 포함하고: hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR-1307-5p, 또는 hsa-miR-6782-5p, 및 표면 마커 CD63, CD81, 및 CD9를 갖는 EV 세트로 구성되고;

- 동물성 성분과 단백질이 없고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인 배지 또는 비히클을 목표로 한다.

또한, 소포 또는 엑소좀에는 하기와 같은 miRNA가 포함되어 있다: 가장 농도가 높은 100개의 miRNA 중 hsa-miR-8078; hsa-miR-7150; hsa-miR-6750-5p; hsa-miR-6727-5p; hsa-miR-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa-miR-4449; hsa-miR-3687; hsa-miR-3197; hsa-miR-1915-3p; hsa-miR-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR-1273h-5p; hsa-miR-1273d; hsa-miR-1237-5p; hsa-miR-874-3p; hsa-miR-671-5p; hsa-miR-424-5p; hsa-miR-376c-3p; hsa-miR-339-3p; hsa-miR-222-3p; hsa-miR-221-3p; hsa-miR-199a-3p; hsa-miR-193a-3p; hsa-miR-181a-5p; hsa-miR-146a-5p; hsa-miR-145-5p; hsa-miR-143-3p; hsa-miR-130a-3p; hsa-miR-125b-5p; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-100-5p; hsa-miR-99a-5p; hsa-miR-92a-3p; hsa-miR-31-5p; hsa-miR-29b-3p; hsa-miR-29a-3p; hsa-miR-27b-3p; hsa-miR-27a-3p; hsa-miR-26a-5p; hsa-miR-24-3p; hsa-miR-23b-3p; hsa-miR-23a-3p; hsa-miR-22-3p; hsa-miR-19b-3p; hsa-miR-16-5p 또는 hsa-let-7i-5p.

상기에서 언급한 바와 같이, EV에는 매우 다양한 비율로 매우 다양한 miRNA가 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 약 2000 내지 3000개의 miRNA의 농도가 서열화되고, 계산되므로, 가장 농도가 높은 100개의 miRNA의 하위 그룹이 작다는 것은 당업자에게는 분명한다. 본 발명자들은 여러 기증자로부터 특정 제대 중간엽 세포(UC-MSC)의 배양물을 얻었고, 이로부터 특정 마커의 존재와 표시된 miRNA의 상대 농도를 복제하는 본 발명의 조성물을 얻었다. 이러한 발명의 화합물은 골관절 병변의 치료에 유용하고, 실시예에서 입증되는 바와 같이, 자가면역 질환의 치료와 연관된 모델에서 긍정적인 효과를 갖는 것으로 입증되었다.

두 번째 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 소포는 하기 miRNA 중 적어도 8개를 함유한다: 가장 농도가 높은 100개의 miRNA 중 hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa- miR-2861, hsa-miR-6088, hsa-miR-1307-5p, 또는 hsa-miR-6782-5p.

또한, 소포에는 표면 마커인 N-카데린(N-cadherin) 또는 CD90 또는 CD44가 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 소포는 mL당 총 입자 5 × 10⁷ 내지 1 × 10¹³의 농도로 존재하며, 크기는 30 내지 300 nm이다.

두 번째 양태에서, 본 발명은 시험관 내에서 증식된 제대 중간엽 세포 배양의 상층액으로부터 EV를 분리하는 본 발명의 조성물을 얻는 방법에 관한 것이며, 여기서 이러한 세포는 표면 마커 N-카데린, CD44, RANKL, CD105, CD56, 또는 CD90 중 적어도 2개를 발현하고, 동물 성분 및 단백질이 없고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인 배지 또는 비히클에 재현탁된다. 최신 기술에는 이러한 조건을 충족하는 많은 수단, 즉 상업적인 수단과 실험실에서 준비할 수 있는 수단 둘 다가 있다. 예를 들어, 인산염 완충액 또는 PBS, 젖산 링거, Hypotemerosol^®, Plasmalyte^® 등을 명명할 수 있다. 나타낸 바와 같이, 기본적인 것은 이미 나타낸 오스몰 농도와 pH이다.

또한, EV를 여과 또는 원심분리를 통해 상층액으로부터 분리하고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인 동물성 성분 및 단백질이 없는 배지 또는 비히클로 적어도 2회 세척하고, 그리고 마지막으로 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고 pH가 6.0 내지 8.0인 동물성 성분과 단백질이 없는 배지 또는 비히클에 재현탁한다. 중간엽 세포 배양물로부터 상층액의 세포외 소포를 분리하기 위한 다양한 프로토콜이 있을 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 본 발명의 방법은 30 내지 300 nm 크기의 소포를 분리하는 데 효율적인 한 이러한 분리에 사용되는 프로토콜이나 시스템에 의존하지 않으며, 따라서 이러한 분리는 발명 당시 이용 가능한 모든 기술이나 도구를 통해 수행될 수 있다.

EV를 수득하는 제대 중간엽 세포는 표면 마커 N-카데린, CD44, RANKL, CD105, CD56, 또는 CD90 중 적어도 3개를 발현한다.

본 발명의 조성물은 골관절 및 자가면역 질환 치료용 약물을 제조하는 데 유용하게 하는 특정 활성을 가지고 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 연골 재생을 촉진하고, 뿐만 아니라 생체 내 골관절염의 임상 사례에서의 골 무기질 밀도도 증가시키는 것으로 확인되었다.

또한, 이러한 조성물은 CD4+ T 세포의 증식을 감소시키는 동시에 Treg 세포의 증식을 증가시키는데 유용하다. 조성물은 M2 대식세포 또는 CD206+ HLA-DR+ 항염증성 대식세포의 증가 또는 M1 대식세포 또는 전염증성 대식세포 또는 CD86+HLA-DR+의 감소를 허용한다.

실시예에 포함된 입증 외에도 이러한 모든 기능은 조성물이 예를 들어, 관절염, 골관절염의 치료에 유용하다는 것을 명백히 보여준다. 이 밖에도, 류마티스관절염, 전신홍반루푸스, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증, 건선, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관염, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈 질환, 복강 질환, 또는 이식편대숙주병의 치료에 유용하다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 조성물 수득

제대 중간엽 세포를 수득하였고, N-카데린, CD44, RANKL, CD105, CD56, 또는 CD90 마커를 갖는 것으로 확인되었다. 3개 배치의 세포를 얻었으며, 하기 표 1에 중간엽 세포의 마커와 이들 각각에 대한 본 발명의 선택 조건이 나타나 있다.

[표 1]

이렇게 확인된 세포를 상용 배지(고글루코스 DMEM; 5% hPL, 1% L-Glut, 1% Pen/Strep 보충)를 사용하여 총 부피 650 mL의 컨플루언스까지 임의의 중간엽 세포 배양의 일반적인 조건에서 배양했다. 이어서, 세포를 PBS(인산염 완충액, pH 7.2; 290 mOsm/L)로 2회 세척한 후, 유도 배지(고글루코스 DMEM; 1% L-Glut만 보충) 650 mL를 첨가하였다.

48시간 배양 후, 세포로부터 모든 상등액 배지를 수집하고, 650 mL의 유도 배지를 다시 배양액에 첨가하여 48시간의 두 번째 배양을 수행하였다.

각 배양 1 또는 2 후에 수집된 상등액을 600 g 4℃에서 10분간 원심분리하여 불순물을 제거했다.

이전 원심분리의 상등액을 초원심분리기에서 100,000 g 4℃에서 1시간 10분 동안 처리했으며, 상등액의 전체 부피가 처리될 때까지 이 단계를 반복했다. 상등액을 제거하고, 볼텍스를 사용하여 펠렛을 방출했다. 그 후, 가능한 오염 물질을 제거하기 위해 펠릿을 두 번 세척했다. 이를 위해 펠릿을 여과된 PBS에 재현탁하여 최종 부피가 10ml가 되도록 하고, 100,000 g 4℃에서 밤새 원심분리했다. 이어서, 마지막 세척을 수행하여 상층액을 제거하고 펠렛을 최종 부피 10 ml의 링거 젖산(pH 6.5, 273 mOsm/L)에 재현탁시키고, 100,000 g 4℃의 초원심분리기에서 1시간 10분 동안 처리했다. 마지막으로, 상등액을 제거하고, 펠릿을 볼텍스한 후 보관을 위해 분취했다.

다음에, 분취량 입자를 정량화했다. NanoSight NS300을 사용하여 여과된 PBS(1 : 100)로 펠렛을 희석하여 입자 정량화를 수행했다.

3번의 초기 배양으로부터, 본 발명의 분취량 입자 또는 조성물의 4개 배치를 얻었다. 하기 표 2는 수득된 농도와 검증 마커의 존재 측면에서 이러한 입자의 특성을 나타낸다.

[표 2]

수득된 4개 배치를 포함된 miRNA의 동일성 및 상대적 농도와 관련하여 추가로 분석하였으며, 이들 각각에서 약 2500개의 miRNA가 서열 분석되었다. 표 3은 본 발명에서 가장 관련이 높은 miRNA의 농도를 나타낸다. 도 7은 Lot A의 농도를 그래프로 나타낸 것이다.

[표 3]

다른 서열화된 miR 중에서 하기는 분석된 모든 배치에서 0.02% 이하의 농도로 발견되었다:

hsa-miR-8078; hsa-miR-7150; hsa-miR-6750-5p; hsa-miR-6727-5p; hsa-miR-5585-3p; hsa-miR-4459; hsa-miR-4449; hsa-miR-3687; hsa-miR-3197; hsa-miR-1915-3p; hsa-miR-1285-5p; hsa-miR-1275; hsa-miR-1273h-5p; hsa-miR-1273d; hsa-miR-1237-5p; hsa-miR-874-3p; hsa-miR-671-5p; hsa-miR-424-5p; hsa-miR-376c-3p; hsa-miR-339-3p; hsa-miR-222-3p; hsa-miR-221-3p; hsa-miR-199a-3p; hsa-miR-193a-3p; hsa-miR-181a-5p; hsa-miR-146a-5p; hsa-miR-145-5p; hsa-miR-143-3p; hsa-miR-130a-3p; hsa-miR-125b-5p; hsa-miR-125a-5p; hsa-miR-100-5p; hsa-miR-99a-5p; hsa-miR-92a-3p; hsa-miR-31-5p; hsa-miR-29b-3p; hsa-miR-29a-3p; hsa-miR-27b-3p; hsa-miR-27a-3p; hsa-miR-26a-5p; hsa-miR-24-3p; hsa-miR-23b-3p; hsa-miR-23a-3p; hsa-miR-22-3p; hsa-miR-19b-3p; hsa-miR-16-5p, 및 hsa-let-7i-5p.

실시예 2: 골관절염 치료에 대한 본 발명의 조성물의 적용.

골관절 질환(OA)에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 평가하기 위해, 실시예 1에서 수득된 조성물을 뮤린 골관절염 모델에서 구별없이 사용하였다.

이러한 모델에서는 0일째와 2일째에 관절(이 경우 무릎)에 콜라게나제를 주사하여 질병을 유발한 다음 7일째와 14일째에는 각각의 치료법을 관절에 주사하여 적용한다. 그런 다음 40일째에 안락사를 실시하고 관절을 분석한다.

이 경우, 총 65마리의 동물을 치료한 3개의 독립적인 연구가 수행되었다(연구 1: 17마리의 동물, 연구 2: 20마리의 동물, 연구 3: 28마리의 동물).

각 그룹은 3개로 세분화하였으며, 위약(PBS, 5μL )을 투여한 첫 번째 대조군, 병변이 유발되었으나 치료제를 적용하지 않아 골관절염 질환(OA)을 유지하는 두 번째 대조군, 그리고 최종적으로 병변이 유발되어 본 발명의 치료법을 적용한 그룹으로 세분화하였다. 부상을 유발하기 위해 5 μL 콜라게나제 유형 VII, 1 U/5 μL를 실험 시작 시와 실험 2일째에 부상 전용(OA) 그룹과 후속 치료 그룹에 대해 관절에 주입했다. 이후, 세 번째 그룹의 동물은 2 × 10⁸ 엑소좀의 양이 적용되도록 조정된 본 발명의 조성물을 치료제로 투여 받았고, 실험 시작 후 7일째와 14일째에 5 μL의 용량으로 2회에 걸쳐 치료제를 도포하였다.

생체 내 연구가 완료된 후, 위약, 병변 단독 또는 치료제와 함께 치료된 관절에 대한 분석이 수행되었다. 관절의 상태를 분석하기 위해 2가지 기술이 사용되었는데, 첫 번째는 골 무기질 밀도의 결과를 전달하는 마이크로CT 장비를 이용한 영상 연구이다. 사용된 두 번째 옵션은 골관절염의 뮤린 모델의 임상 징후 지표에 해당하는 OA 조직학 점수가 확립된 치료된 무릎의 조직학적 분석을 수행하는 것이다(문헌[Cosenza, S., Ruiz, M., Maumus, M., Jorgensen, C. & No l, D. Pathogenic or Therapeutic Extracellular Vesicles in Rheumatic Diseases: Role of Mesenchymal Stem Cell-Derived Vesicles. Int. J. Mol. Sci. 18, (2017)]).

지적한 바와 같이, 본 발명자들은 3가지 생체 내 연구를 수행하였고, 실험 요약은 하기 표 4에 제시되어 있다. 생체 내 N°1에서는 결과가 조직학적 분석으로 분석되었고 생체 내 2 및 3의 결과는 마이크로CT 분석을 사용하여 평가되었다.

[표 4]

결과

생체 내 연구 No. 1에 대한 결과는 도 1에 나타냈다. 본 발명의 조성물을 사용한 치료는 병변에 효과가 있는 것으로 관찰되었으며, 즉 관절의 OA 점수는 치료하지 않은 대조군에 비해 감소했으며(도 1a), 이는 각각 연골 교체 또는 연골 재생을 나타내며, 이는 생체 내 모델이 작동하고, 엑소좀이 예방 또는 재생 활성을 나타냄을 모두 검증할 것이다.

이러한 생체 내 연구가 분리된 실험에 해당한다는 것을 이해하면, 이러한 데이터는 마이크로CT로 결과를 분석한 다른 연구를 통해 재확인되었다.

생체 내 연구 N°2(도 2)와 관련하여, 마이크로CT 분석에 따르면, 본 발명의 조성물, 즉 본 발명자들이 생산한 엑소좀은, 병변만 있는 대조군에 비해 골 무기질 밀도 BMD 수치가 더 낮다는 사실(도 2a)로 인해, 골관절염으로 인한 손상을 예방할 수 있음을 알 수 있으며, 위약으로 치료한 건강한 관절과 유사한 값을 얻었다. 특히, 골 무기질 밀도의 영상 분석(도 2b)은 사용된 유도 모델이 상당한 부상을 생성했음을 보여주었지만, 이에도 불구하고 엑소좀은 재생 효과를 생성할 수 있다.

마지막 생체 내 연구인 연구 3의 경우, 도 3에서 볼 수 있듯이, 병변(OA)에 관해 본 발명의 조성물과 UC-MSC 세포의 실시예 1에 따라 수득된 sEV 사이에 유의한 효과가 있음을 관찰할 수 있다. 이전의 생체 내에서와 마찬가지로, 본 발명에 따른 조성물이 골관절염 질환에 대한 예방 또는 재생 효과를 갖는다는 것이 입증되었다.

이러한 결과는 골관절염과 같은 골관절 병변에 본 발명의 조성물을 적용하는 것이 관절의 조직학 연구 및 OA 점수에서 볼 수 있는 병변의 정도뿐만 아니라 골 무기질 밀도에도 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.

실시예 3: 본 발명의 조성물을 이용한 면역억제 분석.

말초 혈액에서 단핵 세포를 분리하고, PHA(20 μg/mL)로 활성화한 후 CTV(1 : 1000)로 염색하여 증식을 평가했다. a) 10 μL의 PBS 대조군 및 b) 10 μL의 비히클에 용해된 총 입자 양이 2 × 10⁸인 본 발명의 조성물(sEV's)의 단일 용량으로 처리한 두 개의 실험 그룹을 고려했다. 두 그룹 모두에서 헬퍼 T 림프구 세포(Th로 약칭; CD4+)의 증식과 조절 T 세포(Treg로 약칭; CD4+FOXP3+CD25+)의 백분율이 나타났다. 도 4는 배양 3일째(도 4a) 및 배양 5일째(도 4b)에 Th 림프구 세포의 증식 백분율을 보여주며, 여기서 본 발명의 조성물로 처리하면 증식이 덜 일어나는 것으로 관찰된다. 도 5는 Treg 세포의 백분율을 보여주며, 이는 본 발명의 조성물(sEV's)로 처리하면 배양 3일째에 이 집단의 백분율이 증가했음을 보여준다.

Th 세포는 적응 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 세포 집단에 해당한다. 이러한 세포는 Th1, Th2, 및 Th17로 나뉘며; 이들 모두 사이토카인을 분비해 면역 반응에 관여하는 세포의 증식과 분화를 자극한다. 건강한 대조군보다 OA가 있는 기관에 T 세포가 더 많이 존재한다는 증거가 있다. 반면 Treg는 면역 체계 내에서 항상성과 내성을 유지하고, 다른 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 B 림프구 및 수지상 세포도 조절하거나 억제하는 CD4+ T 세포의 하위 집단이다. Treg 세포는 TFG-β, IL-10, 및 아데노신과 같은 면역억제 기능을 가진 분자를 생산할 수 있다.

실시예 4: 본 발명의 조성물을 이용한 대식세포 분극 분석

말초 혈액으로부터 단핵 세포를 분리한 후 음성 선별 키트를 이용하여 존재하는 단핵구를 수득하였다. 이러한 단핵구를 M-CSF 및 GM-CSF 인자를 사용하여 배양하고 대식세포로 분화시켰다. 6일간의 배양 후, a) 대조군 및 b) 총 입자 양이 1 × 10⁹인 본 발명의 sEV 조성물의 단일 용량으로 처리된 두 개의 실험 그룹을 확립하였다.

자극 24시간 후, 유세포 분석을 사용하여 전염증성 대식세포(M1이라고 함; CD86+HLA-DR+) 및 항염증제(M2라고 함; CD206+HLA-DR+)의 백분율을 평가했다. 도 6은 M1(도 6a) 및 M2(도 6b) 마커에 대한 이중 양성 세포의 백분율을 보여준다.

결과는 sEV 처리가 M1 대식세포의 개체수를 감소시키고, M2 대식세포의 개체수를 증가시킨다는 것을 보여준다.

Claims

제대 중간엽 세포(umbilical cord mesenchymal cell)의 세포외 소포(Extracellular Vesicles, EV)가 포함된 조성물로서,
상기 조성물은,
- 가장 높은 농도를 가진 10개의 miRNA 중 hsa-miR-6126, hsa-miR-149-3p, 및 hsa-miR-6780b-5p 중 적어도 하나인 miRNA를 포함하며;
가장 높은 농도를 가진 100개의 miRNA 중 하기 miRNA 중 적어도 5개를 추가로 포함하며;
hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa- miR-6088, hsa-miR-1307-5p 또는 hsa-miR-6782-5p;
표면 마커 CD63, CD81 또는 CD9를 추가로 포함하는, EV세트;
- 및 동물성 성분과 단백질이 없고, 오스몰(osmolality) 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인 배지(medium) 또는 비히클(vehicle);
로 구성되는,
조성물.
제1항에 있어서,
상기 소포는 가장 농도가 높은 100개의 miRNA 중, hsa-miR-574-5p, hsa-miR-6131, hsa-miR-6741-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-1290, hsa-miR-4530, hsa-miR-2861, hsa- miR-6088, hsa-miR-1307-5p 및 hsa-miR-6782-5p의 miRNA 중 적어도 8개를 함유(contain)하는,
조성물.
제1항에 있어서,
상기 소포는 상기 표면 마커로 N-카데린(cadherin) 및 CD90 및 CD44 중 적어도 하나를 추가로 갖는,
조성물.
제1항에 있어서,
상기 소포의 농도는 mL당 총 입자가 5 × 10⁷ 내지 1 × 10¹³인,
조성물.
제4항에 있어서,
상기 소포의 크기는 30 내지 300 nm 범위인,
조성물.
제1항에 따른 조성물을 수득하는 방법으로서,
30 내지 300 nm의 복수의 EV들은 시험관(vitro) 내에서 확장된 제대 중간엽 세포 배양(culture of umbilical cord mesenchymal cells)의 상층액(supernatant)으로부터 분리되며,
이러한 세포는 표면 마커 N-카데린, CD44, RANKL, CD105, CD56, 및 CD90 중 적어도 2개를 발현하고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인, 동물성 및 단백질 성분이 없는 배지 또는 비히클에서 재현탁되는(resuspended),
방법.
제6항에 있어서,
상기 EV는 한외여과(ultrafiltration), 여과(filtration), 초원심분리(ultracentrifugation), 및 원심분리 중 적어도 하나에 의해 상등액으로부터 분리되고, 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인, 동물성 성분 및 단백질이 없는 배지 또는 비히클로 적어도 2회 세척되고, 마지막으로 오스몰 농도가 250 내지 310 mOsmol/L이고, pH가 6.0 내지 8.0인, 동물성 성분과 단백질이 없는 배지 또는 비히클에 재현탁되는,
방법.
제7항에 있어서,
제대 중간엽 세포는 표면 마커 N-카데린, CD44, RANKL, CD105, CD56, 및 CD90중 적어도 3개를 발현(express)하는,
방법.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 골관절(osteoarticular) 및 자가면역(autoimmune) 질환을 치료하는 의약품을 제조하는 데 사용되는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 연골 재생(cartilage regeneration)을 촉진하는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 연골 분해(degradation of cartilage)를 예방하는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 골관절 질환에서 골 무기질 밀도를 감소시키는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 CD4+ T 세포의 증식을 감소시키는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 T regs 세포의 증식을 증가시키는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 다음의 효과 중 적어도 하나의 효과의 용도를 갖는: M2 대식세포 또는 CD206+ HLA-DR+ 항염증성 대식세포를 증가시키는 효과 또는 M1 또는 전염증성 또는 CD86+HLA-DR+ 대식세포를 감소시키는 효과,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은, 관절염, 골관절염을 치료하는 용도를 갖는,
조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 류마티스관절염, 전신홍반루푸스, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 길랭-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증, 건선, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, 혈관염, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈 질환, 복강 질환, 또는 이식편대숙주병을 치료하는 용도를 갖는,
조성물.