JP2024514273A - 骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置のための臍帯間葉系細胞の細胞外小胞 - Google Patents
骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置のための臍帯間葉系細胞の細胞外小胞 Download PDFInfo
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Abstract
特異的マーカー及びｍｉＲＮＡを有する臍帯間葉系細胞の細胞外小胞（ＥＶ）が濃縮された組成物であり、この組成物は、骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置において有用である。具体的には、臍帯間葉系細胞の細胞外小胞（ＥＶ）が濃縮された組成物が保護され、これは、１０個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７８０ｂ－５ｐを含有し、以下のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐのうちの少なくとも５個をさらに含有し、表面マーカーＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ９を有するＥＶのセット；ならびに２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨを有する、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクルからなる。前記組成物を得る方法、ならびに骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置におけるその使用。
Description
本発明は、バイオテクノロジーの一般的な分野に関し、具体的には、骨関節疾患及び自己免疫疾患を処置するための再生医療、ならびにヒト間葉系細胞、具体的には細胞外小胞に基づく治療製品の製造の分野に関する。
現在、細胞療法は、研究と臨床応用との間の橋渡しを形成し、機能性の回復を目指してヒトの細胞、組織又は器官を置換、再生及び／又は改変するために、組織工学に関する進歩を構成する。この転換期は、幹細胞、主に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用するますます多くの臨床試験を伴い、それにより促進される。細胞療法の分野は様々な医療用途で急速に進歩しているが、その開発には、よりよい解決策を必要とするいくつかの技術的問題があり、この解決策によって、一方ではこれらの技術のコストを低減することができ、またより多くの人々を助け新しい用途の一助となり得るように、それをより効率的かつより安全にすることができる。
この点に関して、より安全で安価な最近のアプローチは、細胞培養中に細胞によって自然に分泌される小胞を使用することであるが、これは、それらが無細胞療法の大きな可能性を有することが示されているためである。細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たすこと、本質的にタンパク質及びＲＮＡに対応する内容物を介して疾患の形成及び／又は調節に影響を及ぼすことを含む、様々な領域におけるこれらの小胞の機能が、研究者らにより研究されてきた。これらの小胞は、２０００～３０００種類の多数及び多様なマイクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含むことが特に見出されている。これらの分子は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす非コードＲＮＡ鎖である。細胞外小胞のサブセットはエキソソーム（３０～２００ｎｍ）であり、これらは異なる薬物の送達のためのビヒクルとして既に使用されている。
現在、エキソソーム又は小型細胞外小胞（ｓＥＶ）を含む細胞外小胞に基づく療法の開発は、前臨床研究の進歩及び本発明で提案されるものなどの臨床応用の大きな可能性を有する。
最新技術には様々な診断用途及び単離されたエキソソームによるいくつかの処置があり、例えば刊行物ＷＯ２０１９０３８６６０Ａ１（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＤＢＡ Ｓｅａｔｔｌｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎｓ Ｒｅｓ Ｉｎｓｔ，２０１９－０２－２８）は、患者の体液中に存在するエキソソームを検査することによって川崎病を診断する方法を保護している。
間葉系細胞のエキソソームが緑内障などのいくつかの疾患の処置に使用されるいくつかの特許出願、米国特許出願公開第２０１９０２２４２４２号明細書（Ｔｏｍａｒｅｖら、２０１９－０７－２５）があるが、その文献で使用される組成物及び観察される特性は本発明の組成物からかけ離れており、例えば、その出願では、エキソソームはマーカーＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ６３＋を有するが、本発明では、１つの違いを挙げると、マーカーＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ９が必要である。
本発明者らは、先行技術において、本発明を予想するいかなる文献も見出していない。したがって、本発明は、骨関節疾患及び自己免疫疾患を処置するための、ｍｉＲＮＡ及び／又は特異的表面マーカーを含有する臍帯間葉系細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）から得られるエキソソームの組成物を目指している。
本発明は、特異的マーカー及びｍｉＲＮＡを有する臍帯間葉系細胞の細胞外小胞（ＥＶ）が濃縮された組成物に関し、この組成物は、特に処置される病変の部位に注射された場合、骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置において有用である。
本発明は、具体的には、臍帯間葉系細胞の細胞外小胞（ＥＶ）が濃縮された組成物をターゲットとし、該組成物は、
１０個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７８０ｂ－５ｐを含有するＥＶのセットからなり、
該ＥＶは、以下のｍｉＲＮＡ、すなわちｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐ、のうちの少なくとも５個をさらに含有し、
表面マーカーＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ９を有する；
ならびに２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨを有する、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクルからなる。
１０個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－６７８０ｂ－５ｐを含有するＥＶのセットからなり、
該ＥＶは、以下のｍｉＲＮＡ、すなわちｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐ、のうちの少なくとも５個をさらに含有し、
表面マーカーＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ９を有する；
ならびに２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨを有する、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクルからなる。
加えて、小胞又はエキソソームは、１００個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、以下のｍｉＲＮＡを含有する：ｈｓａ－ｍｉＲ－８０７８；ｈｓａ－ｍｉＲ－７１５０；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５０－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７２７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９；ｈｓａ－ｍｉＲ－３６８７；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９７；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｈ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｄ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｃ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ。
上述のように、ＥＶは非常に異なる割合で非常に多様なｍｉＲＮＡを含有することが知られており、この技術の専門家にとっては、２０００個～３０００個程度のｍｉＲＮＡの濃度が通常は配列決定及び計算されるため、１００個の最も豊富なｍｉＲＮＡのサブグループは小さいことが明らかである。本発明者らは、異なるドナーから特定の臍帯間葉系細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）の培養物を得ており、そこから、特定のマーカーの存在及び示されるｍｉＲＮＡの相対濃度を複製する本発明の組成物を得ている。本発明の化合物は、例で実証されるように、骨関節病変の処置に有用であり、自己免疫疾患の処置と相関するモデルにプラスの効果を有することが証明されている。
第２の実施形態において、本発明の組成物の小胞は、１００個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、以下のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐの少なくとも８個を含有する。
さらに、小胞は、表面マーカーＮ－カドヘリン及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４４を含有し得る。
本発明の組成物において、小胞は、５×１０７～１×１０１３総粒子／ｍＬの濃度であり、３０～３００ｎｍのサイズを有する。
第２の態様では、本発明は、ＥＶが、インビトロで増殖させた臍帯間葉系細胞の培養物の上清から単離され、これらの細胞が、表面マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０の少なくとも２つを発現し、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクル中に、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで再懸濁される、本発明の組成物を得る方法に関する。最新技術では、これらの条件を満たす多くの手段、すなわち商業的手段及び実験室で調製することができる手段の両方がある。例えば、いくつか例を挙げると、リン酸緩衝液又はＰＢＳ、乳酸加リンゲル、Ｈｙｐｏｔｅｍｅｒｏｓｏｌ（登録商標）、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ（登録商標）などを挙げることができる。示されているように、必須なのは、既に示されているオスモル濃度及びｐＨである。
さらに、本発明のＥＶは、濾過及び／又は遠心分離によって上清から単離され、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクルで、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで少なくとも２回洗浄され、最後に、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクル中に、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで再懸濁される。この技術の専門家にとって、間葉系細胞の培養物から上清の細胞外小胞を単離するための異なるプロトコルが存在し得ることは明らかであろう。本発明の方法は、３０ｎｍ～３００ｎｍのサイズの小胞を分離するのに効率的である限り、この分離に使用されるプロトコル又はシステムに依存しないので、この分離は、本発明の作製時に利用可能な任意の技術又は機器によって行うことができる。
ＥＶが得られる臍帯間葉系細胞は、表面マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０のうちの少なくとも３つを発現する。
本発明の組成物は、骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置のための薬物を調製するのに有用となる特定の活性を有する。例えば、組成物は、軟骨再生、及びインビボでの変形性関節症の臨床症例における骨密度の増加を促進することが示されている。
さらに、本組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を減少させると同時に、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を増加させるのに有用である。組成物は、Ｍ２マクロファージもしくはＣＤ２０６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋抗炎症性マクロファージの増加、及び／又はＭ１マクロファージもしくは炎症促進性マクロファージもしくはＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋の減少を可能にする。
下記の例に実証された事項に加えて、これらの全ての能力により、本組成物が、例えば変形性関節症、関節症、変形性関節症の処置に有用であることは明らかである。さらに、本組成物は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、シェーグレン症候群、悪性疾患貧血、セリアック病又は移植片対宿主病の処置にも有用である。
例
例１：本発明の組成物の獲得。
臍帯間葉系細胞が得られ、マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０を有することが判明した。３バッチの細胞が得られ、それらの各々について、間葉系細胞のマーカー及び本発明の選択条件を以下の表１に示す。
例１：本発明の組成物の獲得。
臍帯間葉系細胞が得られ、マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０を有することが判明した。３バッチの細胞が得られ、それらの各々について、間葉系細胞のマーカー及び本発明の選択条件を以下の表１に示す。
このように検証された細胞を、市販の培地（高グルコースＤＭＥＭ；５％ ｈＰＬ、１％ Ｌ－Ｇｌｕｔ、１％ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充）を用いて、任意の間葉系細胞培養物の通常の条件下で、総体積６５０ｍＬのコンフルエンスまで培養した。その後、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．２；２９０ｍＯｓｍ／Ｌ）で２回洗浄し、次いで、６５０ｍＬの誘導培地（高グルコースＤＭＥＭ；１％ Ｌ－Ｇｌｕｔのみを補充）を添加した。
４８時間のインキュベーション後、全ての上清培地を細胞から収集し、４８時間の２回目のインキュベーションのために６５０ｍＬの誘導培地を培養物に再び添加した。
各インキュベーション１又は２後に収集した上清を６００ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、不純物を除去した。
前の遠心分離からの上清を１００，０００ｇの超遠心機で４°Ｃで１時間と１０分間処理し、上清の総体積が処理されるまでこの工程を繰り返した。上清を除去し、ボルテックスを用いてペレットを解放した。続いて、可能性のある汚染物質を除去するためにペレットを２回洗浄した。これを行うために、ペレットを濾過したＰＢＳに再懸濁して最終体積を１０ｍｌにし、４℃で一晩１００，０００ｇで遠心分離した。その後、最後の洗浄を行い、上清を除去し、ペレットを最終容量１０ｍｌの乳酸リンゲル液（ｐＨ６．５、２７３ｍＯｓｍ／Ｌ）に再懸濁し、１００，０００ｇの超遠心機で、４℃で１時間と１０分間処理した。最後に、上清を除去し、ペレットをボルテックスに通し、保存のために等分した。
次いで、アリコート粒子を定量した。粒子定量は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して、濾過ＰＢＳ（１：１００）中のペレット希釈液を使用して行った。
３つの初期培養物から、４バッチのアリコート粒子又は本発明の組成物を得た。以下の表２は、得られた濃度及び検証マーカーの存在に関するこれらの粒子の特性評価を示す。
得られた４つのバッチを、それらが含有するｍｉＲＮＡの同一性及び相対濃度に関してさらに分析し、それらの各々においておよそ２５００個のｍｉＲＮＡを配列決定した。表３は、本発明における最も関連するｍｉＲＮＡの濃度を示す。図７は、ロットＡの濃度をグラフ化したものである。
他の配列決定されたｍｉＲのうち、分析された全てのバッチにおいて、０．０２％以下の濃度で以下が見出された：
ｈｓａ－ｍｉＲ－８０７８；ｈｓａ－ｍｉＲ－７１５０；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５０－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７２７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９；ｈｓａ－ｍｉＲ－３６８７；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９７；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｈ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｄ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｃ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及びｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ。
ｈｓａ－ｍｉＲ－８０７８；ｈｓａ－ｍｉＲ－７１５０；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５０－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７２７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４５９；ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９；ｈｓａ－ｍｉＲ－３６８７；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９７；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１５－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｈ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３ｄ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３７－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｃ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－３１－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－３ｐ；ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及びｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ。
例２：本発明の組成物の、変形性関節症の処置への適用。
骨関節疾患（ＯＡ）に対する本発明の組成物の効果を評価するために、実施例１で得られた組成物を、マウス変形性関節症のモデルにおいて互換的に使用した。
骨関節疾患（ＯＡ）に対する本発明の組成物の効果を評価するために、実施例１で得られた組成物を、マウス変形性関節症のモデルにおいて互換的に使用した。
このモデルでは、０及び２日目に関節、この場合は膝関節にコラゲナーゼを注射することによって疾患を誘発し、次いで７及び１４日目に、同じく関節への注射によってそれぞれの処置を適用する。次いで、４０日目に安楽死を行い、関節を分析する。
この場合、３つの独立した試験を行い、合計６５匹の動物を処置した（試験１：１７匹の動物、試験２：２０匹の動物、試験３：２８匹の動物）。
各群を、プラセボ（ＰＢＳ、５μΛ）が与えられた第１の対照群、病変が誘発されるが処置が適用されず、したがって変形性関節症（ＯＡ）を維持する第２の対照群、最後に病変が誘発され、本発明の処置が適用された群の３つに細分化した。損傷を誘導するために、５μＬのＶＩＩ型コラゲナーゼ、１Ｕ／５μＬを、損傷のみ（ＯＡ）の群及びその後に処置された群について、実験開始時及び実験２日目に関節に注射した。その後、第３の群の動物に、２×１０８個の量のエキソソームを適用するために調整された本発明の組成物を処置として与え、この処置は、実験開始から７日目及び１４日目に２回、５μＬの体積で適用した。
インビボ試験が完了した後、プラセボ、病変単独、又は処置のいずれかで、処置された関節の分析を行った。関節の状態を分析するために、２つの技術を用い、第１には、骨密度の結果をもたらすマイクロＣＴ装置による画像の試験を用いた。使用した第２の選択肢は、変形性関節症のマウスモデルの臨床徴候の指標に対応するＯＡ組織学スコアが確立された処置膝関節の組織学的分析を行うことであった（Ｃｏｓｅｎｚａ，Ｓ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｍａｕｍｕｓ，Ｍ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｃ．＆Ｎｏｅｌ，Ｄ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１８，（２０１７））。
示されたように本発明者らは３つのインビボ試験を行ったが、その実験の概要を以下の表４に示す。インビボ１では、結果は組織学的分析によって分析され、インビボ２及び３では、結果はマイクロＣＴ分析を使用して評価されたことに留意されたい。
結果
インビボ試験番号１に関して、結果を図１に示す。本発明の組成物による処置が病変に効果を及ぼすこと、すなわち、関節のＯＡスコアが処置なしの対照に対して減少し（図１Ａ）、それぞれ軟骨代謝回転及び／又は軟骨再生を示すことが観察され、これはインビボモデルが機能していること、ならびにエキソソームが予防活性及び／又は再生活性を示すことの両方を立証するものである。
インビボ試験番号１に関して、結果を図１に示す。本発明の組成物による処置が病変に効果を及ぼすこと、すなわち、関節のＯＡスコアが処置なしの対照に対して減少し（図１Ａ）、それぞれ軟骨代謝回転及び／又は軟骨再生を示すことが観察され、これはインビボモデルが機能していること、ならびにエキソソームが予防活性及び／又は再生活性を示すことの両方を立証するものである。
このインビボ試験が分離された実験に対応することを理解した上で、このデータは、その結果がマイクロＣＴによって分析された他の試験でも再確認された。
インビボ試験２（図２）に関して、マイクロＣＴ分析によれば、本発明者らによって生成された本発明の組成物又はエキソソームは、病変のみを有する対照よりも骨密度ＢＭＤ（図２Ａ）の数値が少ないことから、変形性関節症によって生じる損傷を防ぐことに成功し、プラセボで処置された健康な関節の値と同様の値を得たことが分かる。具体的には、骨密度の画像化分析（図２Ｂ）は、このエキソソームが再生効果を生じさせることができるにもかかわらず、使用した誘導モデルが有意な損傷を生じさせることを示した。
最後のインビボ試験である試験３では、図３に見られるように、本発明の組成物又はＵＣ－ＭＳＣ細胞の実施例１に従って得られたｓＥＶと病変（ＯＡ）との間に有意な効果があることが観察され得る。以前のインビボと同様に、本発明による組成物が変形性関節症の疾患に対する予防効果及び／又は再生効果を有することが認められる。
これらの結果は、変形性関節症などの骨関節病変への本発明の組成物の適用が、組織学的試験及びＯＡスコアで見られる病変の程度、ならびに関節の骨密度の両方にプラスの効果を有することを実証している。
例３：本発明の組成物を用いた免疫抑制アッセイ。
末梢血から単核細胞を単離し、これをＰＨＡ（２０μｇ／ｍＬ）で活性化し、ＣＴＶ（１：１０００）で染色して増殖を評価した。ａ）１０μＬのＰＢＳ対照、及びｂ）１０μＬのビヒクルに溶解した２×１０８の総粒子量を有する単回用量の本発明の組成物（ｓＥＶ）での処置後の、２つの実験群を検討した。両方の群において、ヘルパーＴリンパ球細胞の増殖（Ｔｈと略記；ＣＤ４＋）及び制御性Ｔ細胞のパーセンテージ（Ｔｒｅｇと略される；ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）を示す。図４は、培養３日目（図４ａ）及び培養５日目（図４ｂ）のＴｈリンパ球細胞の増殖パーセンテージを示し、本発明の組成物での処置が増殖をあまりもたらさなかったことが観察される。図５は、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを示し、本発明の組成物（ｓＥＶ）での処置が培養３日目にこの集団のパーセンテージを増加させたことを示す。
末梢血から単核細胞を単離し、これをＰＨＡ（２０μｇ／ｍＬ）で活性化し、ＣＴＶ（１：１０００）で染色して増殖を評価した。ａ）１０μＬのＰＢＳ対照、及びｂ）１０μＬのビヒクルに溶解した２×１０８の総粒子量を有する単回用量の本発明の組成物（ｓＥＶ）での処置後の、２つの実験群を検討した。両方の群において、ヘルパーＴリンパ球細胞の増殖（Ｔｈと略記；ＣＤ４＋）及び制御性Ｔ細胞のパーセンテージ（Ｔｒｅｇと略される；ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）を示す。図４は、培養３日目（図４ａ）及び培養５日目（図４ｂ）のＴｈリンパ球細胞の増殖パーセンテージを示し、本発明の組成物での処置が増殖をあまりもたらさなかったことが観察される。図５は、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージを示し、本発明の組成物（ｓＥＶ）での処置が培養３日目にこの集団のパーセンテージを増加させたことを示す。
Ｔｈ細胞は、適応免疫応答において重要な役割を果たす細胞集団に相当する。これらの細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７に分裂する。それらは全て、サイトカインを分泌して免疫応答に関与する細胞の増殖及び分化を刺激する。ＯＡを有する器官では、健常対照よりもＴ細胞が多く存在するという証拠がある。一方、Ｔｒｅｇは、免疫系内の恒常性及び寛容を維持し、他のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにおそらくＢリンパ球及び樹状細胞も制御又は抑制する、ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇ細胞は、ＴＦＧ－β、ＩＬ－１０、及びアデノシンなどの免疫抑制機能を有する分子を産生することができる。
例４：本発明の組成物を用いたマクロファージ偏光アッセイ
末梢血から単核球を単離し、次いで、ネガティブ選択キットを使用して、存在する単球を得た。これらの単球を培養し、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ因子を用いてマクロファージに分化させた。６日間の培養後、ａ）対照及びｂ）１×１０９の総粒子量で本発明のｓＥＶ組成物の単回用量での処置後の、２つの実験群を確立した。
末梢血から単核球を単離し、次いで、ネガティブ選択キットを使用して、存在する単球を得た。これらの単球を培養し、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ因子を用いてマクロファージに分化させた。６日間の培養後、ａ）対照及びｂ）１×１０９の総粒子量で本発明のｓＥＶ組成物の単回用量での処置後の、２つの実験群を確立した。
刺激の２４時間後、フローサイトメトリーを使用して、炎症促進性マクロファージ（Ｍ１と呼ばれる；ＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）及び抗炎症性（Ｍ２と呼ばれる；ＣＤ２０６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋）のパーセンテージを評価した。図６は、Ｍ１マーカー（図６ａ）及びＭ２マーカー（図６ｂ）に対する二重陽性細胞のパーセンテージを示す。
結果は、ｓＥＶ処置がＭ１マクロファージの集団を減少させ、Ｍ２マクロファージの集団を増加させることを示すものである。
Claims (17)
- 臍帯間葉系細胞の細胞外小胞（ＥＶ）が濃縮された組成物であって、以下からなることを特徴とする、組成物：
-ＥＶのセットとして、
１０個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８０ｂ－５ｐを含有し、及び
さらに、１００個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、以下のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐ、のうちの少なくとも５個を含有し、及び
表面マーカーＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣＤ９を有するＥＶのセット；
ならびに
-２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨを有する、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクル。 - 小胞が、１００個の最も豊富なｍｉＲＮＡのうち、以下のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７４１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－５ｐ及び／又はｈｓａ－ｍｉＲ－６７８２－５ｐの少なくとも８個を含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 小胞が、表面マーカーＮ－カドヘリン及び／又はＣＤ９０及び／又はＣＤ４４をさらに有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 小胞が、５×１０７～１×１０１３総粒子／ｍＬの濃度であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 小胞のサイズが、３０～３００ｎｍの範囲であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
- ３０ｎｍ～３００ｎｍのＥＶが、インビトロで増殖させた臍帯間葉系細胞の培養物の上清から単離され、そのような細胞は、表面マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０のうちの少なくとも２つを発現し、動物及びタンパク質成分を含まない培地又はビヒクル中に、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで再懸濁されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物を得る方法。
- ＥＶが、限外濾過、濾過、超遠心分離及び／又は遠心分離によって上清から単離され、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクルで、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで少なくとも２回洗浄され、最後に、動物成分及びタンパク質を含まない培地又はビヒクル中に、２５０～３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度及び６．０～８．０のｐＨで再懸濁されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
- 臍帯間葉系細胞が、表面マーカーＮ－カドヘリン、ＣＤ４４、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ１０５、ＣＤ５６及び／又はＣＤ９０のうちの少なくとも３つを発現することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 骨関節疾患及び自己免疫疾患の処置に有用な医薬品を調製するために使用されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物の使用。
- 組成物が、軟骨再生を促進するのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、軟骨の劣化を防止するのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、骨関節疾患における骨密度を低下させるのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を減少させるのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を増加させるのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、Ｍ２マクロファージもしくはＣＤ２０６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋抗炎症性マクロファージを増加させるため、及び／又はＭ１もしくは炎症促進性もしくはＣＤ８６＋ＨＬＡ－ＤＲ＋マクロファージを減少させるのに有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、変形性関節症、関節症、変形性関節症の処置に有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
- 組成物が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、乾癬、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、シェーグレン症候群、悪性疾患貧血、セリアック病又は移植片対宿主病の処置に有用であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
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