KR102439866B1 - 생산성 향상 및 생리활성 강화를 위한 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용 - Google Patents

생산성 향상 및 생리활성 강화를 위한 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성장배지에서 세포를 증식하는 단계가 아닌 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서 동물 유래 세포를 혈소판 용해물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 것을 특징으로 하는 생산성 향상 및 생리활성 강화를 위한 엑소좀의 생산방법을 제공한다.

Description

생산성 향상 및 생리활성 강화를 위한 엑소좀의 생산방법 및 이의 응용 {Manufacturing method of exosomes for increasing their productivity and bioactivity and its application}
본 발명은 엑소좀의 생산방법에 관한 것으로서, 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고/있거나 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀의 생산성 향상 방법 및 생리활성 강화 방법, 그리고 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 생산방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀의 응용에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome) 또는 세포외 소포체(extracellular vesicle)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀을 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.
그러나, 전술한 바와 같이 다양한 엑소좀 분리방법이 제안되고 있음에도 불구하고 다른 기술분야와 마찬가지로 엑소좀의 생산과 관련한 기술분야에서도 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다. 예를 들어, 세포배양액 (또는 단위 세포) 당 엑소좀의 생산량을 향상시키고 엑소좀의 생리활성 인자들과 관련된 효능을 향상시킬 수 있는 새로운 엑소좀 생산기술의 제공이 필요하다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1985941호 (2019.06.04)
본 발명의 목적은 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고/있거나 생리활성이 강화된 엑소좀의 생산방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 생산성 향상 방법 및 생리활성 강화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 생산방법에 의해 수득된 생리활성이 강화된 엑소좀의 다양한 응용을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있고 효능이 강화된 엑소좀의 생산방법에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 성장배지에서 세포를 증식하는 단계가 아닌 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 회수 단계(소위, "conditioning" 단계)에 있어서 동물 유래 세포를 혈소판 용해물이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리할 경우 단위 배양액(또는 단위 세포) 당 엑소좀의 생산량이 증대하고 생산된 엑소좀의 생리활성이 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 생산성과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 동물 유래 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 엑소좀이 유래하는 동물 유래 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포 또는 상기 면역세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포 또는 인간 유래 면역세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 예를 들어, HEK 293 세포나 HEK 293T 세포의 사용도 가능하다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 지방줄기세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "무혈청 배지" 또는 "SFM"이란 예를 들어 기본배지(Basal medium)에 FBS(Fetal Bovine Serum)와 같은 혈청이 첨가되지 않은 배양배지(선택적으로 항생제 및/또는 항진균제 포함)를 의미하고, "EDM"이란 기본배지에 혈소판 용해물, 바람직하게는 인간 혈소판 용해물, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물이 첨가된 배양배지(선택적으로 항생제 및/또는 항진균제 포함)를 의미한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 기본배지는 α-MEM, DMEM, DMEM F12, 199 배지, RPMI-1640, L-15, Hum F-10, Hum F-12, DM-160, DM-170 등일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항염"이란 염증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증, 궤양성 대장염, 관절염, 류머티스성 관절염, 간염, 신장염 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 창상은 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생산성 향상 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법은, (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 무혈청 배지는 상기 혈소판 용해물 약 0.01 부피% 내지 20 부피%를 포함할 수 있고, 예를 들어 약 0.25 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 배양은 약 24시간 내지 72시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생산성 향상 방법에 있어서, 상기 생산성은 상기 배양액 mL 당 엑소좀 입자수 또는 엑소좀 단백질량으로 정의될 수 있다.
본 발명은 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는 엑소좀의 생리활성 강화 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법은, (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 무혈청 배지는 상기 혈소판 용해물 약 0.01 부피% 내지 20 부피%를 포함할 수 있고, 예를 들어 약 0.25 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 배양은 약 24시간 내지 72시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 생리활성 강화 방법에 있어서, 상기 생리활성 강화는 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능 강화일 수 있다. 또한, 상기 생리활성 강화는 콜라겐 합성 증가일 수 있고, 예를 들어 피부탄력개선 강화 또는 주름개선 강화 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 세포를 증식하는 단계가 아닌 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 수집 단계에서 사용되는 무혈청 배지로서, 혈소판 용해물이 첨가된 것을 특징으로 하는 동물세포 유래의 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지를 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지는 동물세포 유래의 엑소좀의 생산성 향상용 무혈청 배지 또는 동물세포 유래의 엑소좀의 생리활성 강화용 무혈청 배지일 수 있다. 상기 생리활성 강화는 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능 강화일 수 있다. 또한, 상기 생리활성 강화는 콜라겐 합성 증가일 수 있고, 예를 들어 피부탄력개선 강화 또는 주름개선 강화 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 동물세포 유래의 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지는 상기 혈소판 용해물 약 0.01 부피% 내지 20 부피%를 포함할 수 있고, 예를 들어 약 0.25 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 동물세포 유래의 엑소좀 생산을 위한 무혈청 배지에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 분리된, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 조성물은, (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 수행하여 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 상기 혈소판 용해물 약 0.01 부피% 내지 20 부피%를 포함할 수 있고, 예를 들어 약 0.25 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 배양은 약 24시간 내지 72시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있고, 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다. 또한, 상기 기능성 화장료 조성물은, 예를 들어, 로션이나 크림일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염, 상처 치유, 및/또는 상처 치유 촉진 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여 수득된 콜라겐 합성 증가 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 예를 들어 피부탄력개선 또는 주름개선용 조성물일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 조성물은, (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 수행하여 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 무혈청 배지는 상기 혈소판 용해물 약 0.01 부피% 내지 20 부피%를 포함할 수 있고, 예를 들어 약 0.25 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 바람직하게는 인간 혈소판 용해물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 혈소판 용해물(platelet lysate) 유래 엑소좀 및 세포외 소포체를 제거한 인간 혈소판 용해물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 배양은 약 24시간 내지 72시간 동안 수행될 수 있고, 예를 들어 24시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물일 수 있다. 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 로션이나 크림일 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물, 또는 피부탄력개선 또는 주름개선용 조성물이 의약 외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 의약 외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 생리활성이 강화된 엑소좀 이외에, 그 작용(예를 들어, 항염, 창상 치료, 창상 치료 촉진, 피부탄력개선 및/또는 주름개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 항염제, 소염제, 창상 치료제, 피부탄력개선제, 주름방지제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생리활성이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 기능성 화장료 조성물은 항염, 창상 치료 촉진, 창상 개선, 피부탄력개선 및/또는 주름개선 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 기능성 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하거나, 창상을 치료하거나, 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 방법은, 상기 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 조성물을 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 포유동물에 투여 또는 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법은, 상기 조성물이 처리된 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스를 수행하는 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 염증 부위 및/또는 상처 부위에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포배양액으로부터 분리되는 엑소좀의 생산성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 엑소좀의 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능 내지는 콜라겐 합성과 같은 생리활성을 강화시킬 수 있는 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀의 생산방법은 상업적 및/또는 임상적으로 유용한 생리활성이 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있고, 이와 같이 생산된 생리활성이 강화된 엑소좀은 약학 조성물, 의약 외품, 피부 외용제, 또는 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 혈소판 용해물로부터 엑소좀을 제거하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2a 내지 도 2c는 실시예 1에서 준비된 ED-hPL(인간 혈소판 용해물에서 엑소좀이 제거된 TFF 투과액)과 EC-hPL (인간 혈소판 용해물의 TFF 농축액)에서 엑소좀 특이적인 표면 마커 단백질인 CD9, CD63 및 CD81에 대한 분석결과를 도시한 그래프로서, ED-hPL에는 엑소좀 표면 마커 단백질인 CD9, CD63 및 CD81이 존재하지 않음을 나타낸다.
도 3은 혈청을 함유하는 성장배지에서 세포를 배양하여 증식시키는 과정과, 증식된 세포를 SFM 배지 또는 EDM 배지에서 배양하여 분비 내지 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액을 수득하는 과정(엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 회수 과정)을 나타내는 모식도이다.
도 4a는 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서 SFM 배지에서 세포를 배양하고 배양액을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 분리된 엑소좀(이하, "SFM 엑소좀"이라 함)의 NTA 결과이고, 도 4b는 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서 EDM 배지에서 세포를 배양하고 배양액을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 분리된 엑소좀(이하, "EDM 엑소좀"이라 함)의 NTA 결과이다. 도 4a 및 도 4b에서는 EDM 엑소좀의 생산성이 SFM 엑소좀의 생산성에 비해 현저하게 높은 것이 확인된다.
도 5a는 EDM 엑소좀의 생산성(배양액 mL 당 엑소좀 입자수)이 SFM 엑소좀의 생산성에 비해 현저하게 높은 것을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 EDM 엑소좀의 생산성(배양액 mL 당 단백질량)이 SFM 엑소좀의 생산성에 비해 현저하게 높은 것을 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과를 도시한 그래프로서, EDM 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 대해 처리한 경우 SFM 엑소좀을 처리한 경우와 비교하여 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IFN-β 및 IL-27이 현저하게 감소하는 것을 나타낸다.
도 7은 EDM 엑소좀과 SFM 엑소좀의 콜라겐 합성 증가 효능을 분석한 결과를 도시한 그래프로서, EDM 엑소좀이 SFM 엑소좀에 비해 인간 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 현저하게 증가시키는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 엑소좀이 제거된 혈소판 용해물의 제조
인간 혈소판 용해물(human platelet lysate; hPL)에서 세포외 소포체 및 엑소좀을 제거하기 위하여 접선 흐름 여과법(tangential flow filtration; TFF)을 사용하였다(도 1 참조). TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있는데, 세포외 소포체 및 엑소좀이 제거된 인간 혈소판 용해물을 수득하기 위해 MWCO 100 kDa ~ 750 kDa의 TFF 필터를 사용하였다. 도 1에 도시된 바와 같이 TFF 필터를 통과하지 못한 농축액(concentrate)은 EC-hPL(Exosome-concentrated hPL)로 명명하고, 필터를 통과한 투과액(permeate)은 ED-hPL(Exosome-depleted hPL)로 명명하였다.
한편, 인간 혈소판 용해물로부터 세포외 소포체 및 엑소좀을 제거하는 방법으로는 전술한 바와 같은 방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포체 및 엑소좀의 제거를 위해, 초미세여과법(ultrafiltration), 초원심분리법(ultracentrifuagation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 그러나 세포외 소포체 및 엑소좀의 제거방법은 전술한 바와 같은 방법들에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법이 채택가능한 것임은 물론이다.
실시예 2: ED-hPL 내 엑소좀 제거 검증
ED-hPL에서 엑소좀이 제거되었음을 확인하기 위하여, 엑소좀 특이적 표지인자인 CD9, CD63 및 CD81에 대한 ED-hPL과 EC-hPL의 정량값을 비교 평가하였다. EC-hPL 또는 ED-hPL에 존재하는 CD9, CD63 및 CD81의 정량을 위해, EC-hPL 또는 ED-hPL과 엑소좀-휴먼 CD9/CD63/CD81 플로우 검출 시약(Exosome-Human CD9/CD63/CD81 Flow Detection Reagent)(Invitrogen™) 각각을 하룻밤 동안(overnight) 혼합 후 각각의 플로우 검출시약에 대응하는 PE 마우스 항-인간 CD9/CD63/CD81 (Mouse anti-Human CD9/CD63/CD81)(BD Pharmigen™) 항체와 각각 반응시키고 유세포분석(flow cytometry)을 이용하여 PE 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity; MFI)를 측정하였다. CD9, CD63 및 CD81의 정량값에 대해 비교가 되는 대조군으로 IgG 이소타입이 선택되었고, PE 마우스 동형 대조군(IgG isotype control) 항체가 IgG 이소타입 대조군에 대한 PE 평균 형광 강도 분석을 위해 사용되었다. 상기와 같이 측정된 CD9, CD63 및 CD81의 MFI와 대조군인 IgG 이소타입의 MFI를 비교하여, EC-hPL 또는 ED-hPL 각각에 포함된 CD9, CD63 및 CD81을 정량하였다.
그 결과, EC-hPL은 CD9, CD63 및 CD81을 함유하고 있는 것이 확인되는 반면, ED-hPL에서는 CD9, CD63 및 CD81의 PE 평균 형광 강도가 IgG 이소타입 대조군의 PE 평균 형광 강도와 거의 동일하여 엑소좀이 완전히 제거되었음을 확인할 수 있었다(도 2a, 도 2b 및 도 2c 참조). 따라서, 실시예 1의 분리방법에 따르면 인간 혈소판 용해물(human platelet lysates; hPL)에서 효율적으로 엑소좀을 제거할 수 있다.
실시예 3: 세포의 배양 및 배양액의 생산
인간 지방 유래 줄기세포를 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 100유닛(Units)/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배양 배지에 현탁시킨 후, 셀팩토리(Cell Factory) 플라스크에 6,000 세포/cm2 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다(도 3의 "1.세포증식단계" 참조). 80% 이상의 세포 밀집도(confluency)에 도달하면, 배양배지를 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지 (이하, "Serum-free media" 또는 "SFM"이라 함), 또는 실시예 1에서 준비된 ED-hPL (0.25 부피%), 100 유닛/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 포함된 α-MEM 배지(이하, "Exosome depleted media" 또는 "EDM"이라 함)로 교체해 주었다. SFM 배지 또는 EDM 배지로 교체한 후 24시간 배양하고 배지를 수거하였다(도 3의 "2.엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수" 참조). 배지수거가 완료된 세포는 세포 계수기를 이용해 세포수를 측정하였으며 기본배지에 대한 ED-hPL 첨가에 의한 세포수 변화가 없음을 확인하였다. 회수한 배양액은 세포 및 세포 잔해물(debirs)을 제거하기 위하여 0.2 μm 필터로 여과하였다.
실시예 4: 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 3에서 0.2 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환 (diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다.
한편, 줄기세포를 포함한 동물 유래 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법으로는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀의 분리를 위해, 초미세여과법(ultrafiltration), 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 공지의 분리방법을 사용할 수 있다. 그러나 엑소좀의 분리방법은 전술한 바와 같은 방법들에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법이 채택가능한 것임은 물론이다.
실시예 5: 분리된 엑소좀의 특성 및 생산성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였으며, 마이크로 BCA 어세이 키트(Micro BCA assay kit)(ThermoFisher에서 구입)로도 총 단백질량을 측정하였다.
엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서, 실시예 3에 따라 SFM 배지에서 줄기세포를 배양하고 배양액을 회수한 후 회수한 배양액으로부터 실시예 4의 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀(이하, "SFM 엑소좀"이라 함)의 NTA 결과는 도 4a에 도시하였다. 또한, 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서, 실시예 3에 따라 EDM 배지에서 줄기세포를 배양하고 배양액을 회수한 후 회수한 배양액으로부터 실시예 4의 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀(이하, "EDM 엑소좀"이라 함)의 NTA 결과는 도 4b에 도시하였다. 그리고, SFM 엑소좀과 EDM 엑소좀의 총 단백질량 분석도 수행하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, NTA 결과로부터 입자수를 비교하면 EDM 엑소좀의 생산성(즉, 배양액 mL 당 엑소좀 입자수)이 SFM 엑소좀의 생산성에 비해 대략 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 5b에 도시된 바와 같이 단백질량을 비교하면 EDM 엑소좀의 생산성(즉, 배양액 mL 당 단백질량)이 SFM 엑소좀의 생산성에 비해 대략 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있다. 따라서, 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 단계에 있어서, EDM 배지에서 줄기세포를 배양하고 배양액을 회수한 후 회수한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하면 엑소좀 생산성(배양액 mL 당 엑소좀 입자수 및 단백질량)을 현저히 향상시킬 수 있다.
실시예 6: 엑소좀의 항염 효능 평가
엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정(도 3 참조)에서 SFM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "SFM 엑소좀"이라 함)과 EDM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "EDM 엑소좀"이라 함)의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과를 다음과 같이 확인하였다. 단, SFM 엑소좀 및 EDM 엑소좀 모두 실시예 4에 따라 분리하였다. 이를 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성 대조군(control): RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되지 않은 실험군;
(2) LPS: RAW 264.7 세포에 LPS만 처리된 실험군;
(3) 양성대조군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 덱사메타손이 처리된 실험군 (도 6a 내지 도 6c에서 "DEX"로 표시);
(4) SFM 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 SFM 엑소좀이 6×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 6a 내지 도 6c에서 "SFM"으로 표시);
(5) EDM 엑소좀 처리군: RAW 264.7 세포에 LPS가 처리되기 전에 EDM 엑소좀이 6×1010 입자/mL의 농도로 처리된 실험군 (도 6a 내지 도 6c에서 "EDM"으로 표시).
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서, SFM 엑소좀 또는 EDM 엑소좀의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과를 다음과 같이 확인하였다.
RAW 264.7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 96웰 플레이트에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 접종하였고, 상기 실험군 (1)~(5) 각각의 조건에 따라 RAW 264.7 세포를 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 100 ng/mL의 LPS(Sigma에서 구입)를 처리하였고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 RAW 264.7 세포의 활성화를 유도하였다.
배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 상등액(culture supernatant)을 수거하였고, 배양 상등액 내의 IL-6, IFN-β 및 IL-27의 생성량을 LEGENDplexTM 비드-기반 면역 측정법(bead-based immnnoassay)을 위한 마우스 염증 패널(mouse inflammation panel)(Biolegend에서 구입)과, 노보사이트 유세포 분석기(NovoCyte Flow Cytometer)(ACEA에서 구입)를 이용하여 측정하여 항염증 효과를 확인하였다.
도 6a 내지 도 6c에 도시된 바와 같이, 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대한 LPS 처리 전에 EDM 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 미리 처리한 실험군 (5)는 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IFN-β 및 IL-27의 생성량이 현저히 감소하였다. 특히 RAW 264.7 세포에 대한 LPS 처리 전에 SFM 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 미리 처리한 실험군 (4)는 IL-6와 IFN-β의 생성량을 감소시키지 못하거나, EDM 엑소좀 처리 실험군 (5)에 비해 IL-27의 생성량 감소 정도가 낮은 것을 확인하였다.
이러한 결과로부터 본 발명에 따라 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정에서 EDM 배지를 사용하여 생산된 EDM 엑소좀은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능을 강화시키는 측면에서 SFM 엑소좀 보다 우수하다는 것을 알 수 있다. 즉, EDM 엑소좀은 SFM 엑소좀 보다도 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 우수하고, 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 보다 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있어 상업적 및/또는 임상적으로 유용하다.
따라서, 본 발명의 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효능이 더욱 강화된 EDM 엑소좀은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물, 의약 외품, 피부 외용제, 또는 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 7: 엑소좀의 콜라겐 합성 증가 효능 평가
엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정(도 3 참조)에서 SFM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "SFM 엑소좀"이라 함)과 EDM 배지를 사용하여 생산된 엑소좀(이하, "EDM 엑소좀"이라 함)의 콜라겐 합성 증가 효능을 다음과 같이 확인하였다. 단, SFM 엑소좀 및 EDM 엑소좀 모두 실시예 4에 따라 분리하였다. 이를 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성 대조군(Negative control): 인간 섬유아세포에 엑소좀이 처리되지 않은 실험군 (도 7에서 "Negative control"로 표시);
(2) 양성 대조군(Positive control): 인간 섬유아세포에 10% 성장 보충 물질(growth supplement)(대한민국 서울시 소재의 주식회사 세포바이오에서 구입)이 처리된 실험군 (도 7에서 "Positive control"로 표시);
(3) SFM 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 SFM 엑소좀이 5×109 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 7에서 "SFM"으로 표시);
(4) EDM 엑소좀 처리군: 인간 섬유아세포에 EDM 엑소좀이 5×109 입자/mL의 농도로 처리된 실험군(도 7에서 "EDM"으로 표시).
인간 섬유아세포(Human dermal fibroblast, HDF)에서 SFM 엑소좀 또는 EDM 엑소좀의 콜라겐 합성 증가 효능을 다음과 같이 확인하였다.
인간 섬유아세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 HDF 성장배지 (대한민국 서울시 소재의 주식회사 세포바이오에서 구입)에 현탁시킨 후 웰 플레이트에 접종하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
그 후, 상기 실험군 (1)~(4)의 조건에 따라 인간 섬유아세포를 처리하고, 인간 섬유아세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 인간 섬유아세포의 배양 상등액(culture supernatant)을 수거하여 원심분리 후, 원심분리된 배양액을 준비하였다. 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트(Takara에서 구입)를 이용하여 제조사의 권고 방법에 따라 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다. 측정된 콜라겐 합성량은 MTT 어세이 키트(Sigma에서 구입)로 측정된 최종 인간 섬유아세포의 세포수로 나누어 정규화하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, EDM 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (4)의 경우, SFM 엑소좀을 인간 섬유아세포에 처리한 실험군 (3)에 비해 콜라겐 합성을 현저히 증가시켰다.
이러한 결과로부터 본 발명에 따라 엑소좀 생산을 위한 배양 및 배양액 회수 과정에서 EDM 배지를 사용하여 생산된 EDM 엑소좀은 콜라겐 합성 증가 효능 측면에서 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 따라서, EDM 엑소좀은 SFM 엑소좀 보다도 콜라겐 합성 증가와 관련된 생리활성 강화, 예를 들어 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화 효능이 우수하고, 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 항노화 효능이 더욱 강화된 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 생산할 수 있어 상업적 및/또는 임상적으로 유용하다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (13)

  1. 세포를 증식하는 단계가 아닌 엑소좀 생산을 위한 세포 배양 및 배양액 수집 단계에서 사용되는 무혈청 배지로서, 혈소판 용해물이 첨가된 것을 특징으로 하는, 동물세포 유래의 엑소좀의 항염 효능 강화용 또는 콜라겐 합성 증가 효능 강화용 무혈청 배지.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 수행하여 수득된 콜라겐 합성 증가 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 콜라겐 합성 증가용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는, 콜라겐 합성 증가용 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 배양은 24시간 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 콜라겐 합성 증가용 화장료 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    피부탄력개선 효능 또는 주름개선 효능 중 적어도 하나를 강화하는, 콜라겐 합성 증가용 화장료 조성물.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    로션이나 크림인, 콜라겐 합성 증가용 화장료 조성물.
  9. (a) 동물 유래 세포를 성장 배지에서 배양하여 세포를 증식시키는 단계와, (b) 상기 동물 유래 세포를 혈소판 용해물(platelet lysate)이 첨가된 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 동물 유래 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 배양액(conditioned media)을 수집한 후 수집한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 수행하여 수득된, 항염 효능이 강화된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 항염용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 상기 성장배지에는 혈소판 용해물이 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는, 항염용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 배양은 24시간 내지 72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 항염용 약학 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리되는, 항염용 약학 조성물.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 하는, 항염용 약학 조성물.
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