KR102660197B1 - 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 4 ℃ 및 -20 ℃에서 수개월 동안 장기간 보관할 경우에도 엑소좀의 기능이 유지되는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 엑소좀의 보관 안정성이 향상되어 항노화 등과 관련된 미용 산업 및 피부 재생이 필요한 의료 산업에서 엑소좀 기반의 치료제 및 화장품 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물 {Composition for longterm storage of exosome comprising exosome derived from stem cell and biocompatible polymer}

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 관한 것이다.

엑소좀은 세포로부터 분비되는 50-200 nm 크기를 가지는 막 소포체로서 혈액, 소변 등을 포함한 체액에서 대부분 존재하고, 기원 세포(공여세포) 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA, DNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등을 포함한다.

엑소좀의 지질이중층은 기원 세포(공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 생리 활성 물질을 수용세포에 전달하여 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등 세포의 기능을 조절하는 신호전달 중개자 역할을 수행한다.

특히, 줄기세포에서 분비되는 ‘줄기세포 유래 엑소좀’은 여러 생리 활성 인자 및 유전물질들을 함유하고 있어 세포 거동 조절, 줄기세포 분화, 및 조직 재생을 제어할 수 있다고 알려져 있다. 이에, 줄기세포 유래 엑소좀은 체내 주입된 세포들의 낮은 생존율 및 분화율, 조직의 석회화 등 기존 줄기세포 기반 치료제의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 치료법의 패러다임을 형성할 것으로 기대되고 있다.

최근 줄기세포 자체를 사용하지 않고 줄기세포가 분비하는 엑소좀을 이용하여 다양한 질환의 치료 효과에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 줄기세포 유래 엑소좀은 피부층의 주요 세포인 섬유아세포(fibroblast)의 기능과 관련된 유전자 발현을 조절하는 생리 활성 인자를 다량 함유하여 피부 내 콜라겐 생성을 효과적으로 유도할 수 있는 신개념의 항노화 기능성 물질로 미용 및 의료 시장에서 각광 받고 있다.

그러나, 엑소좀은 보관 시 온도 및 보관 기간에 따라 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고 엑소좀의 유효한 생리 활성 물질들의 활성이 저하될 수 있는 문제점이 있다. 이에, 엑소좀을 미용 및 의료 산업에서 효과적으로 사용하기 위해서는 엑소좀을 안정적으로 유지 및 보관할 수 있는 제형의 개발이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 생체적합성 고분자에 줄기세포 유래 엑소좀을 함유하여 장기간 보관 가능한 엑소좀 함유 제제를 개발함으로써 엑소좀의 유효한 생리활성 물질의 활성을 유지하면서 엑소좀의 사용 편의성을 증대하고자 하였다.

한국등록특허 제10-2232670호

본 발명자들은 엑소좀 보관 시 온도 및 기간에 따라 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고 엑소좀의 유효한 생리 활성 물질들의 활성이 저하되는 문제점을 해결하고자, 줄기세포 유래 엑소좀을 생체적합성 고분자에 봉입하여 엑소좀을 함유한 고분자 기반 제제를 제조하였으며, 이를 장기간 보관 후에도 엑소좀의 기능이 유지되는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산을 유효성분으로 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 유래 엑소좀에 히알루론산을 추가하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 있어서,

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물로서, 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 의해 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산을 포함하는 용해성 마이크로니들에 있어서,

상기 마이크로니들은 상처치유 또는 피부재생용; 또는 주름개선용이고, 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 마이크로니들을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀에 생체적합성 고분자를 추가하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법으로서,

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 히알루론산은 줄기세포 유래 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 생체적합성 고분자를 포함하지 않는 조성물에 비해 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 전체 조성물 1mL 당 1 x 10⁹개 내지 1 x 10¹²개의 줄기세포 유래 엑소좀을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물의 제형은 마이크로니들, 젤, 고체, 필름, 패치, 연고, 로션, 크림, 주사, 용액, 캡슐, 점안액, 및 점비액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 인간 진피 섬유아세포의 이동 및 증식을 촉진시켜 상처치유 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 콜라겐 생성 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 0 ℃ 내지 10 ℃ 또는 -30 ℃ 내지 -10 ℃에서 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 1개월 내지 6개월 동안 보관이 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 4 ℃ 및 -20 ℃에서 수개월 동안 장기간 보관할 경우에도 엑소좀의 기능이 유지되는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 엑소좀의 보관 안정성이 향상되어 항노화 등과 관련된 미용 산업 및 피부 재생이 필요한 의료 산업에서 엑소좀 기반의 치료제 및 화장품 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀이 잘 분리되었는지 엑소좀 마커의 발현을 통해 확인한 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 마이크로니들의 3개월 보관 후 크기 및 형태를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 보관 2주 후 AchE의 활성 변화를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서의 엑소좀에 의한 가용성 콜라겐 생성 효과를 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 전 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 전 엑소좀에 의한 세포 증식 효과를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 1개월 후 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 1개월 후 히알루론산 농도에 따른 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제를 서로 다른 온도에서 1개월 보관 후 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 2개월 후 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 3개월 후 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 6개월 후 엑소좀에 의한 상처치유 효과를 확인한 도면이다.
도 8b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 6개월 후 엑소좀에 의한 세포 증식 효과를 확인한 도면이다.
도 8c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 6개월 후 엑소좀에 의한 콜라겐 생성 효과를 확인한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 보관 기간별 엑소좀의 농도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 보관 전 및 보관 3개월 후 고분자 종류별 엑소좀의 농도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 보관 기간별 엑소좀의 생체 활성을 상처치유 영역을 통해 확인한 도면이다.
도 11b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 동결 및 해동 주기에 따른 엑소좀의 생체 활성을 상처치유 영역을 통해 확인한 도면이다.
도 12a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 기계적 강도를 확인한 도면이다.
도 12b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 피부 침투 효과를 파라필름에서 확인한 도면이다.
도 12c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 피부 침투 효과를 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 확인한 도면이다.
도 12d는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들을 피부에 적용하기 전후의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 12e는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들을 피부에 처리하였을 때 엑소좀의 전달을 피부의 깊이에 따라 확인한 도면이다(스케일 바=500 μm).
도 13a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 및 엑소좀의 피내 투여 후 엑소좀의 생체 내 분포를 모니터링한 결과를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 13b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 및 엑소좀의 피내 투여 후 생체 내 엑소좀의 상대적인 형광 강도를 비교하여 나타낸 도면이다(n=4).
도 13c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 및 엑소좀의 피내 투여 20분 및 2일 후 피부 조직에서의 엑소좀의 분포를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 14a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 진피 두께를 확인한 도면이다.
도 14b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 콜라겐 층의 두께를 확인한 도면이다.
도 14c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 피부 조직에서 콜라겐 타입 1의 발현을 확인한 도면이다.
도 14d는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 탄성 섬유의 발현을 확인한 도면이다.
도 14e는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 섬유아세포 마커 ER-TR7의 발현을 확인한 도면이다.
도 14f는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들 처리 후 노화 섬유아세포 바이오마커 p16^INK4A의 발현을 확인한 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 여러 가지 활용 예시를 나타낸 도면이다.
(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ****p<0.001, n.s.는 유의미한 차이가 없음을 의미함)

본 발명의 일 실험예에서는 엑소좀이 함유된 히알루론산(HA) 기반의 마이크로니들을 제조하고, 3개월 보관 후 이의 크기 및 형태를 확인한 결과, 3개월 보관 후에도 엑소좀이 함유된 HA 기반의 마이크로니들(Exo@HA)의 크기 및 형태에 거의 변화가 없이 안정하게 유지되는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 제제에서 엑소좀의 막단백질 중 하나인 AchE의 효소 활성을 평가한 결과, Exo@HA를 4 ℃ 및 -20 ℃에서 2주 동안 보관하였을 때 엑소좀의 효소 활성이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 제제에서 엑소좀의 활성이 유지되는지 확인하기 위해, in vitro 상에서 인간 진피 섬유아세포(HDF)에 의한 콜라겐 생성을 확인한 결과, Exo@HA 그룹은 fresh 엑소좀 그룹과 유사하게 콜라겐 수준을 증가시키는 것을 확인하였다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 제제의 보관 기간에 따른 엑소좀의 안정성을 확인한 결과, 1~6개월 보관 시 4 ℃ 및 -20 ℃의 온도에서 재생에 필수적인 세포 이동 능력 및 증식 효과가 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였고, 6개월 보관 시 콜라겐 생성 활성이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 엑소좀이 함유된 히알루론산 제제는 줄기세포 유래 엑소좀 고유의 특성 및 활성을 유지하면서 장기간 보관에도 뛰어난 안정성을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 제제의 보관 기간에 따른 엑소좀의 농도를 확인한 결과, Exo@HA의 경우 보관 6개월 후에도 엑소좀의 농도가 유지되는 것을 확인하였다(실험예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 HA 대신 다른 고분자 종류에 따른 엑소좀의 농도를 확인한 결과, HA를 대신하여 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 또는 카르복실메틸덱스트란을 사용한 경우 보관 3개월 후에도 엑소좀의 농도가 유지되는 것을 확인하여, 이들 또한 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 사용할 수 있음을 확인하였다(실험예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 기간에 따른 엑소좀의 생체 활성을 확인하기 위해 상처치유 영역을 통해 인간 진피 섬유아세포(HDF) 이동을 관찰한 결과, Exo@HA의 엑소좀은 6개월의 보관 기간 동안 계속 HDF 이동 유도능이 보관 전과 거의 동일하게 유지되었으며, 동결 및 해동 주기에 따른 엑소좀의 생체 활성을 확인하기 위해 여러 동결 및 해동 주기 후에 상처치유 영역을 확인한 결과, Exo@HA의 엑소좀은 10회의 동결 및 해동 주기 후에도 80 % 이상의 기능을 유지하는 것을 확인하였다(실험예 7 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 강도 및 피부 침투력을 확인한 결과, Exo@HA의 하중-변위 곡선은 빈 마이크로니들(MN)과 큰 차이가 없음을 보여 엑소좀의 하중이 마이크로니들의 기계적 강도에 영향을 미치지 않음을 확인하였고, Exo@HA가 피부를 시뮬레이션하는데 사용되는 다층 파라필름(parafilm)을 뚫는 능력을 평가한 결과, 바늘(needle)이 250-375 μm 깊이에 도달할 수 있음을 확인하였다. 또한, 생체 내(in vivo) 피부 침투 결과, Exo@HA가 마우스 피부에 균일한 구멍을 유도하고, 이는 24시간 후에 상당히 복구되어 안전성을 가지는 것을 보여주었으며, 마우스 피부에서 Exo@HA의 용해 및 엑소좀 방출 능력을 조사한 결과, Exo@HA가 성공적으로 지층에 침투하여 엑소좀을 진피층에 정확하게 전달하는 것을 확인하였다(실험예 8 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀의 생체 내 분포를 확인한 결과, 피내 주사(ID)를 통해 투여된 엑소좀은 4일째에 모든 신호를 거의 상실하는 반면, Exo@HA로 처리된 마우스의 생체 내에서 엑소좀이 지속적으로 방출되는 것을 확인하였는 바, 엑소좀을 함유한 고분자 기반의 제제를 피내 주사 하는 경우 등과 비교하여 마이크로니들 제형으로 사용할 경우 엑소좀을 효과적이고 정확하게 진피로 전달이 가능한 것을 알 수 있었다(실험예 9 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 노화 예방 또는 치료 효과를 확인한 결과, 진피층 및 콜라겐 층의 평균 두께가 Exo@HA 처리 후 증가하고, 콜라겐 타입 I(Col I)의 발현이 Exo@HA를 처리한 등쪽 피부에서 가장 높게 증가하였으며, 탄성 섬유의 발현도 Exo@HA 처리에 의해 유의하게 증가한 반면, 피내 주사(ID) 또는 국소 투여군(Topi)은 Exo@HA군에 비해 미미한 효과를 나타내었다. 또한, Exo@HA를 처리한 피부에서 섬유아세포 마커(ER-TR7)는 증가하였으며 노화 섬유아세포 마커(p16^INK4A) 발현은 효과적으로 감소한 것을 확인하였다(실험예 10 참조).

이로부터, 본 발명에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 장기간 탑재된 엑소좀의 생물학적 기능을 적절하게 유지하며, 엑소좀 함유 HA 기반의 용해성 마이크로니들 제형을 통한 엑소좀의 경피 투여는 피내 투여 또는 국소 투여에 비해 엑소좀을 더 안정적이고 효과적으로 전달하여 엑소좀의 콜라겐 생성 등 피부 노화 예방 또는 치료 활성을 안정적으로 유지하는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 있어서,

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “줄기세포(stem cell)”란 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말하며, 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency) 뿐만 아니라 다분화능(multipotency), 단일분화능(unipotency)을 모두 포함한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 수정 후 14일이 안된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 제대혈, 골수, 지방, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로서 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 생식세포란, 생식을 통해서 유전 정보를 다음 세대로 전달하는 세포로서, 인간에게는 정자와 난자가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 줄기세포는 클론을 형성하여 세포의 군집을 이루는 과정에서 자기 복제를 하여 군집 내에 새로운 하나의 줄기세포를 유지할 수 있으며, 분화를 통해 한 가지 이상의 특징적인 세포 형태를 형성할 수 있는 능력이 있는 세포이다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 유래 지방 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “지방 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)”란 골, 근육, 지방 및 제대혈 등 다양한 유래의 성체줄기세포 중에서 지방에서 추출되는 줄기세포를 말한다. 다분화능을 가진 지방줄기세포(ASC)는 지방세포, 골모세포, 연골모세포 및 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있다.

본 발명에 있어서, “엑소좀(exosome)”이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 말한다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.

상기 엑소좀은 비만세포, 림프구, 성상세포, 혈소판, 신경세포, 내피세포, 상피세포 등 모든 동물 세포에서 배출될 수 있으며, 혈액, 소변, 점액, 타액, 담즙액, 복수액, 뇌척수액 등의 다양한 체액에서 발견된다. 엑소좀은 뇌혈관 장벽(Blood-Brain Barrier, BBB)도 통과할 수 있으며, 표피 세포와 내피세포의 세포막 투과가 가능할 정도로 선택적 투과성이 높아 특정 약물의 나노캐리어(nanocarrier)인 DDS(drug delivery system) 개발에도 활용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 직경이 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 250 nm, 10 nm 내지 200 nm, 10 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 150 nm, 또는 80 nm 내지 140 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물 1mL 당 1 x 10⁹개 내지 1 x 10¹²개, 5 x 10⁹개 내지 5 x 10¹²개, 1 x 10⁹개 내지 1 x 10¹¹개, 5 x 10⁹개 내지 5 x 10¹¹개, 1 x 10⁹개 내지 5 x 10¹⁰개, 5 x 10⁹개 내지 1 x 10¹¹개, 또는 1 x 10¹⁰개 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 투여했을 때 인체에 독성을 나타내지 않는 분자량이 대략 10,000 이상인 큰 분자 물질을 의미한다.

상기 생체적합성 고분자는 예컨대 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 덱스트란(dextran), 카르복실메틸덱스트란(carboxylmethyldextran), 키토산(chitosan), 및 카복시메틸셀룰로스나트륨(sodium carboxymethyl cellulose)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “히알루론산(hyaluronic acid, HA)”이란 글루코사민글라이칸(glycosaminoglycan)의 하나로서, N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine) 및 글루쿠론산(Glucuronic acid)으로 이루어지는데, 세포외 기질에 존재하고 조직의 수분유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여하며, 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 히알루론산은 줄기세포 유래 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 있어서, 상기 생체적합성 고분자로 히알루론산이 포함될 경우, 상기 히알루론산은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물 1mL 당 1 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 400 mg, 10 mg 내지 350 mg, 10 mg 내지 300 mg, 50 mg 내지 500 mg, 50 mg 내지 400 mg, 50 mg 내지 350 mg, 50 mg 내지 300 mg, 100 mg 내지 500 mg, 100 mg 내지 400 mg, 100 mg 내지 350 mg, 100 mg 내지 300 mg, 100 mg 내지 200 mg, 50 mg 내지 150 mg, 150 mg 내지 250 mg, 또는 250 mg 내지 350 mg의 히알루론산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 있어서, 상기 생체적합성 고분자로 히알루론산이 포함될 경우, 상기 엑소좀에 대한 히알루론산의 건조중량은 엑소좀 10¹⁰개 당 100 내지 500 mg, 100 내지 450 mg, 100 내지 400 mg, 100 내지 350 mg, 100 내지 300 mg, 150 내지 300 mg, 200 내지 300 mg, 또는 250 내지 300 mg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 생체적합성 고분자를 포함하지 않는 조성물에 비해 줄기세포 유래 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “엑소좀의 안정성”이란 엑소좀을 정해진 기간 동안 보관할 경우 엑소좀의 구조, 기능, 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 정도를 의미한다. 본 발명의 일 실험예에 따르면 상기 엑소좀 안정성은 장기간 보관 후에도 엑소좀의 인간 진피 섬유아세포의 이동 및 증식 효과; 엑소좀의 콜라겐 생성 효과; 또는 엑소좀의 막단백질 중 하나인 아세틸콜린에스터라아제(Acethylcholineesterase, AchE)의 효소 활성이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는지 여부를 통해 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성이 유지되는지 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “안정성이 향상된”이란 용어는 엑소좀에 생체적합성 고분자를 첨가함으로써 일정 기간 보관 후에도 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 유지되어 엑소좀 안정성의 지속 기간이 증가 또는 연장되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, “유지”란 엑소좀의 안정성이 그대로 보존되거나 계속해서 존재하는 상태를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 0 ℃ 내지 10 ℃ 또는 -30 ℃ 내지 -10 ℃; 0 ℃ 내지 8 ℃ 또는 -30 ℃ 내지 -15 ℃; 0 ℃ 내지 6 ℃ 또는 -30 ℃ 내지 -18 ℃; 2 ℃ 내지 10 ℃ 또는 -25 ℃ 내지 -10 ℃; 2 ℃ 내지 8 ℃ 또는 -25 ℃ 내지 -15 ℃; 2 ℃ 내지 6 ℃ 또는 -25 ℃ 내지 -18 ℃; 3 ℃ 내지 10 ℃ 또는 -22 ℃ 내지 -10 ℃; 3 ℃ 내지 8 ℃ 또는 -22 ℃ 내지 -15 ℃; 3 ℃ 내지 5 ℃ 또는 -22 ℃ 내지 -18 ℃; 또는 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “장기 보관”이란 예컨대 2주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 수년 동안 보관하는 것을 의미하며, 본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면, 상기 조성물은 1개월 내지 6개월 동안 보관이 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물로서, 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 의해 엑소좀의 보관 안정성; 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공하며, 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 엑소좀의 안정성을 향상시키는 유효성분으로 포함될 수 있고, 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물에서는 엑소좀의 안정성을 향상시키기 위한 보조제로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물에 있어서, 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물은 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 자체를 위한 목적이 아니라 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시키는 목적으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “유효성분”은 직접 또는 간접으로 그 성분 자체가 가지고 있는 약리작용이 제제의 효능·효과로 기대되는 물질 또는 물질군으로서, 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자가 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 엑소좀의 안정성을 향상시키는 유효성분으로 포함될 경우, 상기 유효성분은 전체 조성물의 건조중량에 대하여 5 중량% 이상, 10 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상 포함될 수 있으며, 예컨대 5 중량% 내지 100 중량%, 10 중량% 내지 100 중량%, 20 중량% 내지 100 중량%, 30 중량% 내지 100 중량%, 40 중량% 내지 100 중량%, 50 중량% 내지 100 중량%, 60 중량% 내지 100 중량%, 70 중량% 내지 100 중량%, 80 중량% 내지 100 중량%, 90 중량% 내지 100 중량%, 10 중량% 내지 80 중량%, 20 중량% 내지 80 중량%, 30 중량% 내지 80 중량%, 40 중량% 내지 80 중량%, 50 중량% 내지 80 중량%, 60 중량% 내지 80 중량%, 또는 70 중량% 내지 80 중량% 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자가 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물에 엑소좀의 안정성을 향상시키기 위한 보조제로 포함될 경우, 상기 보조제는 전체 조성물의 건조중량에 대하여 5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 또는 2 중량% 미만 포함될 수 있으며, 예컨대 0.0001 중량% 내지 4.99 중량%, 0.001 중량% 내지 4.99 중량%, 0.001 중량% 내지 3 중량%, 0.001 중량% 내지 1 중량%, 0.01 중량% 내지 4.99 중량%, 0.01 중량% 내지 3 중량%, 0.01 중량% 내지 1 중량%, 0.1 중량% 내지 4.99 중량%, 0.1 중량% 내지 3 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.5 중량% 내지 3 중량%, 또는 0.5 중량% 내지 1 중량% 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “상처치유”란 상처의 치료를 촉진 또는 개선시키는 모든 측면을 포함하는 것으로서, 본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면 상기 상처치유는 피부의 진피 섬유아세포의 이동 및 증식으로 인해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “피부재생”이란 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미한다.

본 발명에 따른 엑소좀의 장기 보관용 조성물 또는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 마이크로니들, 젤, 고체, 필름, 패치, 연고, 크림, 점안액, 점비액, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 일 실험예에 따르면 마이크로니들로 제형화하여 사용될 경우 안정적이고 정확하게 엑소좀을 전달하여 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 마이크로니들을 통한 경피 투여, 경구 복용, 피하 주사, 피내 주사, 국소 투여, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면 마이크로니들을 통한 경피 투여 시 피내 주사 또는 국소 투여하는 경우 등에 비해 엑소좀을 안정적이고 정확하게 전달하는 것을 확인하여, 마이크로니들을 통한 경피 투여가 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 상처치유 또는 피부재생용 식품 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 식품 조성물 또는 화장료 조성물은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 의해 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 마이크로입자는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 미스트, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 핸드로션, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 클렌징오일, 클렌징밤, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 및 스핑고 지질로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 더 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 예를 들어 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

본 발명의 제형이 로션, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산을 포함하는 용해성 마이크로니들에 있어서,

상기 마이크로니들은 상처치유 또는 피부재생용; 또는 주름개선용이고, 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 마이크로니들을 제공한다.

본 발명에 있어서, “마이크로니들”이란 볼록 형상 구조물로서 넓은 의미에서의 바늘 형상 또는 바늘 형상을 포함하는 구조물을 의미하고, 원뿔 형상 구조의 경우, 통상 그 기저에 있어서의 직경은 50 내지 300 μm 정도이며 길이는 200 내지 700 μm 정도이다. 또한, 마이크로니들은 첨예한 선단을 갖는 좁은 의미에서의 바늘 형상인 것으로 한정되는 것은 아니며, 미시적으로는 끝이 뾰족하지 않은 형상도 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀에 생체적합성 고분자를 추가하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법으로서,

상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고; 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 엑소좀의 장기 보관용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 있어서, “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 재료

HA(30-50 kDa)는 Bloomage Biotechnology Corp., Ltd.(Jinan, 중국)에서 구입하였다. 물은 AquaMax-Ultra 정수 시스템(Younglin Co., 안양, 한국)을 사용하여 정제되었다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었고 추가 정제 없이 사용되었다. 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지는 Hyclone Laboratories Inc.(City, IL, USA)에서 구입하였으며, 항생제-항진균제(AA) 용액, DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline), 및 트립신-EDTA는 WelGENE(경산, 한국)에서 공급받아 사용하였다.

실시예 2. 세포 배양

일차 인간 지방 줄기 세포(hASC)(38세, 여성, 70E21-062)는 Cefobio Inc.(서울, 한국)에서 제공받았으며, 인간 진피 섬유아세포(HDF)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 제공받았다. 세포는 37 ℃의 5 % CO₂ 함유 배양기(Vision Bionex, 경기도, 한국)에서 10 % FBS 및 1% AA(Antibiotic-Antimycotic (100X) solution)를 함유하는 DMEM으로 별도로 배양하였다.

실시예 3. 엑소좀 분리

상기 실시예 2의 세포 수확 후, hASC의 조건 배지(CM)를 원심분리(1500 rpm, 20분, 4 ℃)한 다음 0.22 μm 멤브레인을 통해 여과하여 세포 단편을 제거하였다. 다음 단계에서, hASC-유래 엑소좀(hASC-Exo)은 접선 흐름 여과 캡슐(TFF, 500-kDa MWCO 한외여과막 필터, Pall Corporation, Port Washington, 뉴욕, 미국) 사용을 통해 PBS 용액에 최종 부피 10 mL로 응축 및 분산되었다.

실시예 4. 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis, NTA)

나노입자 추적 분석 시스템 (NanoSight LM10; Malvern Instruments, Malvern, 영국)을 사용하여 엑소좀의 농도를 확인하였다. 나노입자 추적 분석 측정의 캡처 및 분석 설정은 캡처 기간: 30초, 셔터 속도: 30 ms, 점도: 1.0 cP, 카메라 레벨: 16, 검출 임계값: 5, 스크린 이득: 10으로 설정하였다.

실시예 5. 엑소좀 함유 고분자의 고체 제형 제조

엑소좀 함유 고분자(Exo@polymers)의 고체 제형을 만들기 위해, 파우더 형태의 HA를 hASC-Exo(1.0 x 10¹⁰ 입자/mL)를 포함하는 100 μL의 DPBS에 직접 첨가하여 다양한 HA 농도(0 내지 300 mg/mL)의 DPBS 용액 100 μL를 만들고, 유리 슬라이드 상에 도포하여 침착하였다. 그런 다음 상기 샘플을 25 ℃의 깨끗한 벤치에서 5시간 동안 건조하여 필름 형태의 고체 제형(Exo@polymers)이 되도록 하였다. 제조된 Exo@polymers는 실리콘 몰드에서 분리되어 멸균된 plastic bag에 포장되고 여러 농도에서 안정성 평가를 진행하였다.

실시예 6. 엑소좀 함유 고분자 기반의 마이크로니들의 형태 확인

엑소좀 함유 고분자 기반의 마이크로니들의 형태는 30 kV에서 SEM(Hitachi, S-4300)을 사용하여 분석하였다. 상세하게는 마이크로니들이 손상 없이 팁이 포함된 작은 부분으로 분할되었다. 그런 다음 상기 작은 부분을 SEM 장치의 샘플 챔버에 직접 배치한 다음 이미지를 촬영하였다.

실시예 7. 스크래치 분석

세포를 DFA(10 % FBS) 배지에 분산시키고 5 × 10⁴개 세포/웰의 밀도로 시드하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에 보관하였다. 그 후, DFA(1 % FBS)를 사용하여 이전 배지를 제거하고 변경한 다음 노란색 파이펫(pipet) 팁을 사용하여 각 웰에 스크래치를 만들었다. 그 후, 상기 샘플은 0시간, 24시간에서 다른 웰에 추가되었다. 0시간, 24시간 및 48시간에서 카메라에 연결하는 현미경을 사용하여 치유 영역을 확인하였다.

실시예 8. 세포 증식

세포를 DFA(10 % FBS) 배지에 분산시키고 96-웰 세포 배양 플레이트에서 10⁴ 세포/웰의 밀도로 시드하고 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, DA(기초 배지(Basal media) DMEM 및 AA를 포함하는 무혈청 배지)를 사용하여 이전 배지를 제거하고 변경하였다. 12시간 후, 상기 배지는 샘플을 포함하는 DFA(1 % FBS)로 변경되고 이를 0시간, 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면, 500 μg/mL MTT 시약을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. MTT 함유 상층액을 제거한 후, 100 μL 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여 바이올렛 포르마잔 결정을 용해시키고, 각 웰의 광학 밀도를 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(reader)로 평가하였다. 0시간에 세포를 샘플로 처리하여 24시간 후 증식의 변화를 측정하였다.

실시예 9. 체외 가용성 콜라겐 생성

세포를 5 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 기존 배지를 샘플이 포함된 DA 배지로 교체하고 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 컨디셔닝된 배지를 사용하여 Sircol 콜라겐 키트(S1000, Biocolor Ltd, 영국)로 가용성 콜라겐을 확인하였다.

실시예 10. 웨스턴 블롯

전기영동은 6 % 또는 12 % 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔을 사용하여 단백질을 분리하였다. 항-CD9항체(1:1000), 항-CD63항체(1:250), 항-칼넥신항체(1:1000), 항-GM130항체(1:1000), 항-TSG101항체(1:1000), 항-β-액틴 항체(1:2000) 및 항-콜라겐 1 항체(1:1000)를 1차 항체로 사용하였으며, 2차 항체로 HRP-conjugated 항-토끼 IgG(1:5000) 또는 HRP-conjugated 항-마우스 IgG(1:5000)를 사용하였다. 막은 LAS-3000(Fuji Photo Film, 일본)으로 촬영하였으며, 단백질의 분자량은 단백질 래더(ladder)(Precision Plus Protein Dual Color Standards; BIO-RAD, USA)로 구별하였다.

실시예 11. 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase) 활성 측정

Amplite Colorimetric Acetylcholinesterase Assay Kit(AAT Bioquest, CA, 미국)를 사용하여 엑소좀 아세틸콜린에스테라아제(AchE)의 농도를 측정하였다. 구체적으로, 3 × 10⁸ hASC-Exo를 96-웰 플레이트에 첨가한 후 50 μL의 작용액(working solution)을 첨가한 다음 빛을 차단하고 상온에서 30분간 배양하였다. 다음 단계로, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 410 nm 파장에서 흡광도 신호를 관찰하였다. 효소 농도는 AchE 표준 용액(0-100 mU/mL)을 사용하여 얻은 표준 곡선을 기반으로 계산되었다.

실시예 12. 엑소좀 함유 고분자 기반의 마이크로니들의 기계적 강도

마이크로니들 패치의 기계적 강도는 100N 로드셀이 있는 변위력 테스트 스테이션(Comtech QC-508E 만능 시험기)을 사용하여 측정하였다. 즉, 단일 패치가 수직으로 위치한 단단한 스테인리스강 플랫폼에 부착되었다(마이크로니들이 위를 향함). 테스트 스테이션 센서 프로브는 0.1 mm/s의 속도로 마이크로니들 아래로 수직으로 이동되었다. 센서와 마이크로니들 팁 사이의 초기 거리는 1 cm였고, 변위 및 힘 측정은 센서가 마이크로니들 팁에 닿은 직후 시작되어 스테이션 센서 프로브가 600 μm 이동한 후에 완료되었다.

실시예 13. 파라필름 침투

파라필름(Parafilm) M1(PF) 필름은 피부 모사체(simulant)로 사용되었다. 파라필름 시트를 접어서 8층 필름(두께 1 mm)을 얻었으며, Exo@HA는 8층 파라필름 필름에 삽입되었다. 그 후, Exo@HA를 제거하고, 필름을 층별로 분해하였다. Exo@HA에 의해 만들어진 구멍의 수를 측정하기 위해 현미경으로 모든 층을 관찰하고 구멍을 카운트 하였다.

실시예 14. 동물 모델

살아있는 동물을 대상으로 하는 모든 실험은 성균관대학교 동물관리이용위원회의 두 가지 관련 법률 및 기관 가이드라인의 승인을 받았으며 이를 준수하였다. 모든 동물 실험은 6주령 수컷 SKH1 마우스(Orient Bio, 한국)를 사용하였다.

실시예 15. 피부 침투 테스트

Exo@HA의 피부 침투를 연구하기 위해 엑소좀을 Flamma 675 NHS와 결합한 다음 마이크로니들에 로드하여 F675-표지된 Exo@HA를 준비하였다. 그런 다음, 마이크로니들에 로드된 F675-표지 엑소좀 함유 HA(Exo@HA) 처리, F675-표지 엑소좀 용액의 피내 주사 또는 HA 용액에 분산된 F675-표지 엑소좀의 국소 투여 후 20분에 마우스 피부를 동일한 수의 엑소좀(2 × 10⁷ 입자)과 함께 채취하였다. 절제된 피부를 탈이온수로 세척하고 4 % 포르말린 용액으로 고정한 후, 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM, TCS 3 SP8 HyVolution, Leica Microsystems CMS GmbH, 독일)으로 이미지화 하였다.

실시예 16. 전신 및 피부 조직에서 엑소좀의 생체 내(in vivo) 분포

F675-표지 Exo@HA 처리 또는 F675-표지 엑소좀의 피내 투여 후, 전신 형광 이미지를 IVIS 이미징 시스템(IVIS Lumina XR, PerkinElmer, Waltham, 미국)을 사용하여 8일 동안 매일 모니터링 하였다. Living Image 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)에서 형광 강도를 평가하였으며, 각 처리 직후 또는 2일 후의 피부 조직을 채취하여 CLSM을 통해 생체외(ex vivo) 형광 이미지를 모니터링 하였다.

실시예 17. 주름개선 실험

마우스를 5개 그룹(n=4)으로 나누었다: 무처리(NT), 엑소좀 함유 HA 기반의 마이크로니들(Exo@HA), 엑소좀 미함유 HA 기반의 마이크로니들(MN), 피내 주사(ID, Exo@HA에서 검출된 것과 동일한 엑소좀 및 HA 용량), 국소 투여(Topi, Exo@HA에서 검출된 것과 동일한 엑소좀 및 HA 용량). 마우스는 0, 3, 6, 9, 12일에 5회 처리되었다. 마우스는 19일째에 희생되었고, 이들의 피부는 Masson's Trichrome(MT) 염색, 웨스턴 블롯 및 면역조직형광을 포함한 추가 분석을 위해 채취하였다. 진피 또는 콜라겐 층의 두께는 H&E 또는 MT 염색 이미지로부터ImageJ를 사용하여 분석하였다. 또한, 콜라겐 제I형은 웨스턴 블롯을 이용하여 분석하였으며, 섬유아세포 증식 및 젊음/노화 세포의 비율을 면역조직형광법으로 테스트 하였다.

실시예 18. H&E, MT 및 elastic 염색

조직학적 분석을 위해 마우스를 희생시킨 후 피부 조직을 절제하였다. 상기 조직을 4 % 포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매하였으며, 파라핀이 포매된 조직을 5 μm 조각으로 절단하고, H&E로 염색하고 슬라이드 스캐너(Axio scan. Z1, Zeiss, Oberkochen, 독일)를 사용하여 이미지화 하였다. 피부 절편은 MT 염색용 Masson's trichrome 키트로 염색한 후 슬라이드 스캐너를 사용하여 관찰하였다. 엘라스틴의 조직학적 염색을 위해 Elastic(Connective Tissue Stain) 키트(ab150667)를 사용하여 피부 절편을 염색하고 탄성 섬유(검정에서 파랑/검정 색상)를 염색한 다음 슬라이드 스캐너로 스캔하였다.

실시예 19. 면역조직형광

Alexa Fluor^®594-결합된 ER-TR7 항체(Santa Cruz, sc-73355 AF594, 1:100 희석)를 사용하여 진피 섬유아세포를 시각화 하였다. 즉, 피부 조직의 파라핀 절편을 탈파라핀화하고 차단한 다음, 밤새 ER-TR7 항체와 함께 배양하였다. 그 후, 핵을 DAPI 용액으로 염색하였다. Alexa Fluor^®647-결합된 p16^INK4A 항체(Santa Cruz, sc-1661 AF647, 1:50 희석)를 염색하기 위해 동일한 절차를 수행하였으며, CLSM을 사용하여 염색된 절편의 이미지를 관찰하였다.

[실험예]

실험예 1. 엑소좀 함유 고분자 기반의 마이크로니들 제조 및 이의 분석

엑소좀이 잘 분리되었는지 확인하기 위해, 전형적인 엑소좀 마커인 CD9 및 CD63의 발현을 확인한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 CD9 및 CD63이 hASC 유래 엑소좀에 존재하는 반면, 비소형 엑소좀 마커인 GM130, TSG101, 및 칼넥신(Calnexin)은 존재하지 않는 것을 확인하였다. 이로부터, hASC에서 엑소좀이 잘 분리된 것을 알 수 있었다.

그런 다음, 엑소좀이 함유된 고분자 기반의 마이크로니들을 제조하고, 이를 3개월 보관 후 모폴로지를 확인하였다.

구체적으로, 마이크로니들 몰드(15 × 15 arrays, H600 B200 P500, Micropoint Technologies Pte Ltd (Singapore))를 사용하여 엑소좀이 함유된 고분자 기반의 마이크로니들을 제조하였다. 파우더 형태의 HA를 hASC-Exo(1.0 x 10¹⁰ 입자/mL)를 포함하는 50 μL의 DPBS에 직접 첨가하여 다양한 HA 농도(0 내지 300 mg/mL)의 DPBS 용액 100 μL를 만들고, 몰드에 주입한 후 진공에서 20분간 밀착시켰다. 그 후 잔여 용액을 제거하고 HA를 DPBS에 첨가한 용액을 채워 넣고 상기 샘플을 25 ℃의 깨끗한 벤치에서 건조하여 마이크로니들 형태의 고체 제형(Exo@HA)이 되도록 하였다. 제조된 Exo@HA는 실리콘 몰드에서 분리되어 멸균된 plastic bag에 포장되어 향후 실험에 사용되었다.

상기 엑소좀이 함유된 히알루론산(HA) 기반의 마이크로니들의 크기 및 형태는 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 엑소좀이 함유된 HA 기반의 마이크로니들(Exo@HA-MN(=Exo@HA))과 엑소좀이 함유되지 않은 HA기반의 마이크로니들(HA-MN(=HA))을 SEM을 이용하여 관찰하고, 4 ℃ 및 -20 ℃에서 각각의 제형을 3개월 동안 보관한 후 다시 SEM을 이용하여 크기 및 형태를 관찰하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 3개월 보관 후에도 엑소좀이 함유된 HA 기반의 마이크로니들(Exo@HA-MN)의 형태에 거의 변화가 없이 안정하게 유지되는 것을 확인하였다.

실험예 2. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 엑소좀 막단백질의 효소 활성 확인

상기 실험예 1에서 제조된 엑소좀 함유 히알루론산 기반 제제에서 엑소좀의 막단백질 중 하나인 아세틸콜린에스터라아제(Acethylcholineesterase, AchE)의 효소 활성을 평가하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 엑소좀을 함유한 PBS 용액(대조군)의 경우에는 2주 동안 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 보관하였을 때 보관 전의 효소 활성에 비해 50 % 가량 감소하였으나, 엑소좀을 함유한 히알루론산(Exo@HA) 기반 제제를 4 ℃ 및 -20 ℃에서 보관하였을 때 엑소좀의 효소 활성이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.

또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이 4 ℃에서 시간에 따른 AchE 활성은 엑소좀이 Exo@HA에 로드될 때 안정적으로 유지하는 반면, PBS 용액에 보관하는 동안은 엑소좀이 지속적으로 생체 활성을 잃는 것으로 나타났다.

실험예 3. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 엑소좀의 콜라겐 생성 활성 확인

엑소좀을 함유한 HA 기반 제제에서 엑소좀의 활성이 유지되는지 확인하기 위해, 가용성 콜라겐 키트를 사용하여 in vitro 상에서 인간 진피 섬유아세포(HDF)에 의한 콜라겐 생성을 확인하였다.

각 그룹의 처리 24시간 후 가용성 콜라겐 수준을 확인한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 신선한 엑소좀 및 Exo@HA 그룹은 모두 음성 대조군이나 MN 그룹보다 가용성 콜라겐 수준을 현저하게 증가시켰으며, 신선한 엑소좀 및 Exo@HA 그룹 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

실험예 4. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 기간에 따른 엑소좀의 안정성 확인

엑소좀의 안정성을 평가하기 위하여 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)를 배양하고, 상처치유 시험방법(scratch wound healing assay)을 통하여 엑소좀을 함유한 히알루론산 기반 제제의 보관 전/후, 보관 기간에 따라 엑소좀을 처리한 섬유아세포의 이동 및 증식에 어떤 변화가 나타나는지 관찰하였다.

4-1. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 전 상처치유 효과 및 세포 증식 확인

엑소좀을 함유한 히알루론산 기반 제제의 보관 전에는 PBS에 분산되어 있는 엑소좀(Exo@PBS) 및 히알루론산에 함유된 엑소좀(Exo@HA) 각각을 24시간 배양했을 때 엑소좀을 처리한 인간 진피 섬유아세포의 상처치유 효과 및 세포 증식을 확인한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 줄기세포 유래 엑소좀에 의해 상처치유 영역이 증가하고, 도 4b에 나타낸 바와 같이 세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다.

4-2. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 1개월 후 상처치유 효과 확인

4 ℃ 및 -20 ℃의 온도에서 Exo@PBS 및 Exo@HA를 1개월 동안 보관한 후 인간 진피 섬유아세포에 처리하여 상처치유 효과를 확인한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 4 ℃ 및 -20 ℃에서 1개월 보관한 Exo@PBS를 처리한 그룹의 상처치유 영역이 보관 전에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 반면, Exo@HA를 처리한 경우 1개월 보관 후에도 상처치유 영역이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.

또한, Exo@HA의 보관 1개월 후 히알루론산의 농도에 따른 엑소좀의 상처치유 효과를 확인한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 히알루론산의 농도가 100 mg/mL 이상일 경우 상처치유 영역이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 서로 다른 온도 조건에서 Exo@HA의 보관 1개월 후 엑소좀의 상처치유 효과를 확인한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 25 ℃ 또는 40 ℃에서 보관한 경우에 비해 -20 ℃ 또는 4 ℃에서 보관한 경우 상처치유 영역이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.

4-3. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 장기간 보관 후 상처치유 효과, 세포 증식, 및 콜라겐 생성 확인

4 ℃ 및 -20 ℃의 온도에서 Exo@PBS 및 Exo@HA를 2개월, 3개월, 및 6개월 동안 보관한 후 인간 진피 섬유아세포에 처리하여 상처치유 효과를 확인한 결과, 도 6(2개월), 도 7(3개월), 및 도 8a(6개월)에 나타낸 바와 같이 4 ℃ 및 -20 ℃에서 각각 2개월, 3개월, 및 6개월 보관한 Exo@PBS를 처리한 그룹의 상처치유 영역이 보관 전에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 반면, Exo@HA를 처리한 경우에는 2개월, 3개월 및 6개월의 장기 보관 후에도 상처치유 영역이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.

또한, 엑소좀을 함유한 히알루론산 기반 제제의 보관 6개월 후 PBS에 분산되어 있는 엑소좀(Exo@PBS) 및 히알루론산에 함유된 엑소좀(Exo@HA) 각각을 24시간, 48시간 배양했을 때 엑소좀을 처리한 인간 진피 섬유아세포의 세포 증식을 확인한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 6개월 동안 보관한 후에도 줄기세포 유래 엑소좀의 세포 증식 증가 효과가 보관 전과 거의 동일하게 나타나는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 엑소좀을 함유한 히알루론산 기반 제제의 보관 6개월 후 PBS에 분산되어 있는 엑소좀(Exo@PBS) 및 히알루론산에 함유된 엑소좀(Exo@HA)을 처리한 후 가용성 콜라겐 수준을 확인한 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 신선한 엑소좀 및 Exo@HA 처리군에서는 모두 음성 대조군에 비해 콜라겐 수준이 현저하게 증가되었으며, Exo@PBS 처리군에서는 콜라겐 수준이 음성 대조군과 유의한 차이가 없는 것을 확인하였다.

이를 통해, Exo@HA의 경우 6개월 동안 보관한 후에도 줄기세포 유래 엑소좀의 콜라겐 생성 활성이 유지되는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 히알루론산 제제를 1~6개월 보관 시 4 ℃ 및 -20 ℃의 온도에서 재생에 필수적인 세포 이동 능력 및 증식 효과, 및 콜라겐 생성 활성이 보관 전과 유사한 수준으로 유지되는 것을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 엑소좀이 함유된 히알루론산 제제는 줄기세포 유래 엑소좀 고유의 특성 및 활성을 유지하면서 장기간 보관에도 뛰어난 안정성을 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 5. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 기간에 따른 엑소좀의 농도 확인

나노입자 추적 분석 시스템(NanoSight LM10; Malvern Instruments, Malvern, 영국)을 사용하여 엑소좀의 농도를 확인한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 Exo@PBS의 경우 보관 1개월 이후부터 엑소좀의 농도가 크게 감소하였으나, Exo@HA의 경우 6개월 후에도 엑소좀의 농도가 유지되는 것을 확인하였다.

실험예 6. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제에서 고분자 종류에 따른 엑소좀의 농도 확인

고분자로서 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란(DEX), 또는 카르복실메틸덱스트란(CMD)를 사용하여 엑소좀 함유 고분자 기반 제제를 제조한 후, 보관 전 및 3개월 보관 후의 엑소좀 농도를 상기 실험예 5의 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 Exo@PBS의 경우 보관 3개월 후 엑소좀의 농도가 크게 감소하였으나, Exo@PEG, Exo@DEX, 및 Exo@CMD의 경우 모두 3개월 후에도 엑소좀의 농도가 유지되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명에 따른 엑소좀 함유 고분자 기반 제제는 히알루론산을 대신하여 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 또는 카르복실메틸덱스트란 또한 고분자로 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 7. 엑소좀 함유 고분자 기반 제제의 보관 기간 및 동결 및 해동 주기에 따른 엑소좀의 생체 활성 확인

상처치유 영역을 통해 인간 진피 섬유아세포(HDF) 이동을 관찰하여 Exo@HA에서 엑소좀의 시간에 따른 생체 활성을 확인한 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 4 ℃에서 PBS에 보관된 엑소좀은 2개월 내에 상대적인 HDF 이동 유도능이 모두 상실된 반면, Exo@HA의 엑소좀은 6개월의 보관 기간 동안 HDF 이동 유도능이 보관 전과 거의 동일하게 유지되는 것을 확인하였다.

또한, 동결 및 해동 주기가 엑소좀의 활동 손실을 초래한다고 보고되었기 때문에, 여러 동결 및 해동 주기 후에 상처치유 영역을 확인함으로써 엑소좀의 안정성을 테스트 하였다. 그 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이 Exo@PBS는 단 1회의 동결 및 해동 주기 후에 엑소좀의 50 % 생물학적 기능을 상실한 반면, Exo@HA의 엑소좀은 10회의 동결 및 해동 주기 후에도 80 % 이상의 기능을 유지하는 것을 확인하였다.

이로부터, 엑소좀 함유 HA 기반의 용해 마이크로니들은 6개월 이상 탑재된 엑소좀의 생물학적 기능을 적절하게 유지할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 8. 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 강도 및 피부 침투력 확인

마이크로니들은 약물, 인슐린, 펩타이드 또는 단백질의 효과적인 전달을 위한 의료 기기로 개발되었다. 충분한 기계적 강도는 마이크로니들 용해를 통한 효과적인 경피 전달의 전제 조건이므로, 변위-힘 테스트 스테이션에 의해 엑소좀 함유 HA 기반의 마이크로니들(Exo@HA)의 기계적 강도를 평가하였다. 그 결과, 도 12a에 나타낸 바와 같이 Exo@HA의 하중-변위 곡선은 빈 마이크로니들(MN)과 큰 차이가 없음을 보여 엑소좀의 하중이 마이크로니들의 기계적 강도에 영향을 미치지 않음을 나타내었다.

빈 마이크로니들이 피부 침투에 충분한 기계적 강도를 가지고 있다고 보고되었기 때문에 Exo@HA가 각질층을 성공적으로 뚫을 수 있다고 가정하였으며, 이를 확인하기 위해 먼저 피부를 시뮬레이션하는데 사용되는 다층 파라필름(parafilm)을 뚫는 능력을 평가하였다. 그 결과, 도 12b에 나타낸 바와 같이 바늘(needle)은 두 개의 파라필름 층을 완전히 관통하고 부분적으로 세 번째 층을 관통할 수 있어, 바늘이 250-375 μm 깊이에 도달할 수 있음을 나타내었다. 빈 마이크로니들과 Exo@HA 사이의 침투 깊이에는 큰 차이가 없었으며, 이는 엑소좀이 마이크로니들의 기계적 특성에 영향을 미치지 않음을 시사한다.

또한, 생체 내(in vivo) 피부 침투 결과, 도 12c에 나타낸 바와 같이 Exo@HA가 마우스 피부에 균일한 구멍을 유도했음을 확인하였고, Exo@HA 처리로 인한 이러한 최소 침습은 24시간 후에 상당히 복구되었으며, 상기 방법이 안전성을 가지는 것을 보여주었다.

다음으로, 마우스 피부에서 Exo@HA의 용해 및 엑소좀 방출 능력을 조사하였다. 다양한 기간(0, 10, 20분) 동안 Exo@HA를 처리한 후 남은 Exo@HA를 수확하고 SEM 이미지로 관찰하였다. 그 결과, 도 12d에 나타낸 바와 같이 바늘의 작은 잔류물은 Exo@HA의 팁(tip)이 10-20분 내에 완전히 용해된다는 것을 의미한다. 추가 생체 내 실험을 위해 Exo@HA를 20분 동안 적용하는 최적의 조건을 설정하여 균일한 침투 능력과 완전한 용해성을 허용하였다.

아울러, 도 12e에 나타낸 바와 같이 Exo@HA는 치료 후 피부에 로드된 형광 표지 엑소좀(F675-Exo)을 적절하게 방출하였다. 최대 형광 강도는 진피층 범위에 속하는 피부 표면 아래 96-192 μm에서 나타났다. 이와 같은 결과는 Exo@HA가 성공적으로 지층에 침투하여 엑소좀을 진피층에 정확하게 전달했음을 의미한다.

실험예 9. 엑소좀의 생체 내 분포 확인

Exo@HA 처리 후, IVIS를 통해 실시간 형광 신호를 확인하여 형광 표지된 엑소좀의 생체 분포를 모니터링 하였다. 그 결과, 도 13a에 나타낸 바와 같이 Exo@HA로 처리된 마우스의 경우, 주사 부위에서 강한 NIR 형광 신호가 관찰되었고, 신호는 7일 동안 가시적으로 유지되어 생체 내에서 엑소좀이 지속적으로 방출되는 것을 확인하였다. 이에 비해 피내 주사(ID)를 통해 투여된 엑소좀은 4일째에 모든 신호를 거의 상실하는 것을 확인하였다.

또한, 시간에 따른 주사 부위에서의 상대 형광 강도를 확인한 결과, 도 13b에 나타낸 바와 같이 Exo@HA 처리 시 형광 반감기는 3.1일인 반면 피내 주사의 반감기는 1.2일에 불과하였다. 이러한 결과는 Exo@HA를 통한 주사 부위에서의 엑소좀의 생체 내 체류가 피내 주사를 통한 것보다 유의적으로 더 길다는 것을 보여주었다. 임상적으로 치료제의 반감기는 일반적으로 최적화된 투여 간격으로 간주되며, 이에 상기 결과는 노화 예방을 위한 적용에서 Exo@HA의 사용 빈도를 줄일 수 있음을 나타낸다.

이에 더하여, 피부층에서 엑소좀의 분포를 확인하기 위해 20분 및 2일 후 형광 현미경을 사용하여 절단된 피부 조직의 냉동절단 슬라이스에서 형광을 관찰하였다. 그 결과, 도 13c에 나타낸 바와 같이 Exo@HA 및 ID 그룹 모두 처리 20분 후에 전체 진피 조직에서 강한 형광을 나타내었다. 특히, 쐐기(wedge) 모양의 구멍에서 강한 형광 영역이 관찰되었는데, 이는 마이크로니들 침투에 의해 만들어진 구멍으로 간주되며, 강한 형광은 집중된 엑소좀이 HA 폴리머 사슬에 의해 진피층에 갇혔다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도 Exo@HA로 처리한 피부 조직에서는 이 제형으로부터 지속 방출로 인해 강한 형광이 여전히 유지되었지만, ID 그룹에서는 형광 수준이 거의 감지할 수 없을 정도로 감소하였다. 이러한 결과는 도 13a 및 13b에 나타낸 시간에 따른 엑소좀의 생체 분포 데이터와 잘 일치하며, 이는 Exo@HA가 엑소좀을 진피층에 효과적으로 전달하고 엑소좀을 해당 위치에 유지할 수 있음을 시사한다.

상기로부터, 전반적으로 마이크로니들의 사용으로 인해 엑소좀을 효과적이고 정확하게 진피로 전달이 가능한 것을 알 수 있었으며, 이는 사용자 친화적인 편의성으로 인해 의료 또는 에스테틱 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

실험예 10. 엑소좀 함유 HA 기반 마이크로니들의 노화 예방 또는 치료에 대한 적용

엑소좀은 피부과(예: 아토피 피부염, 전신 경화증 및 건선) 또는 의료 미용(예: 흉터 제거, 피부 안티에이징 및 모발 성장) 분야에서 새로운 치료 옵션을 제공한다.

본 발명에서는 Exo@HA가 엑소좀을 진피층까지 정확하게 전달하여 피부 질환 치료 또는 의료 미용 분야에서 높은 잠재력을 가질 수 있음을 입증하였다. 이에, Exo@HA의 임상적 응용 가능성을 평가하기 위해 의료 미용 분야의 대표적인 예인 생체 내 노화 예방 효과를 조사하였다.

노화된 피부의 전형적인 특징은 진피 두께 감소, 섬유아세포에 의해 하향 조절된 콜라겐 및 탄성 섬유 생성, 및 진피 내 섬유아세포의 증식 감소이다. SKH1 마우스의 등쪽 피부를 엑소좀 미함유 HA 기반의 마이크로니들(MN), Exo@HA 또는 엑소좀으로 3일마다 5회 다른 투여 경로를 통해 처리하였다. 그런 다음, 피부를 채취하고 조직학적 분석을 수행하여 피부 구조, 콜라겐 침착 수준 및 기타 노화 관련 바이오마커 발현을 평가하였다.

그 결과, 도 14a에 나타낸 바와 같이 H&E 염색 결과 진피층의 평균 두께는 Exo@HA 처리 후 510 ± 47 μm에서 715 ± 35 μm로 크게 증가하였다. 대조적으로, 빈 MN 그룹은 대조군과 유의한 차이를 보이지 않으며, 이는 마이크로니들에 로드된 엑소좀이 진피층 두께 변화를 매개함을 나타낸다. 또한, 피내 주사(ID) 또는 국소 투여군(Topi)은 Exo@HA군에 비해 미미한 효과를 나타내어, 마이크로니들 기반 투여의 우수한 엑소좀 전달 효율을 확인할 수 있었다.

또한, Masson's trichrome 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 피부의 콜라겐 발현을 조사한 결과, 도 14b에 나타낸 바와 같이 Exo@HA 처리 시 피부의 콜라겐 층(도 14b의 파란색 영역)은 대조군 및 다른 모든 그룹보다 훨씬 두꺼운 것을 확인하였으며, 도 14c에 나타낸 바와 같이 피부 내 콜라겐의 80~90 %를 차지하는 콜라겐 타입 I(Col I)의 발현이 Exo@HA를 처리한 등쪽 피부에서 가장 높게 증가하는 것을 확인하였다. 동시에 다른 그룹들은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 유사하게, 도 14d에 나타낸 바와 같이 나이가 들어감에 따라 감소하는 탄성 섬유의 발현도 Exo@HA 처리에 의해 유의하게 증가하였다.

이에 더하여, 섬유아세포 마커(ER-TR7) 및 노화 섬유아세포 마커(p16^INK4A)를 사용하여 면역조직화학(IHC)을 통해 Exo@HA가 섬유아세포에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 14e에 나타낸 바와 같이 ER-TR7 수준(빨간색으로 염색됨)은 Exo@HA를 처리한 피부에서 유의적이고 보편적으로 향상되었으며, 조직의 세포 밀도(핵이 파란색으로 염색됨)도 현저하게 증가하여, Exo@HA가 피부에서 섬유아세포의 수뿐만 아니라 밀도를 증가시킨다는 것을 확인하였다. MN 및 ID그룹에서도 ER-TR7 발현이 약간 증가했지만, 이러한 증가는 일반적인 현상보다는 주로 여러 개별 세포에 집중되어 있어, 상기 MN 및 ID 그룹의 한계를 시사한다. Topi 그룹은 대조군과 차이가 없어 전달 효율이 낮은 것을 알 수 있었다. 또한, 노화 섬유아세포에서 상향 조절되는 노화 섬유아세포 바이오마커 p16^INK4A를 검출하여 피부의 섬유아세포 표현형을 조사한 결과, 도 14f에 나타낸 바와 같이 Exo@HA는 피부에서 ID 및 Topi 그룹에 비해 p16^INK4A 발현을 효과적으로 감소시켰으며, 이를 통해 Exo@HA가 노화 과정을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

종합적으로, 상기와 같은 실험을 통해 Exo@HA가 콜라겐 합성 및 섬유아세포 증식을 촉진함으로써 강력한 노화 예방 또는 치료 효과를 발휘함을 입증하였으며, 마이크로니들 제형을 통한 효과적인 엑소좀 전달 방법은 화장품뿐 아니라 염증성 피부질환 치료 등의 분야에도 적용이 가능할 것임을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (14)

1. 줄기세포 유래 엑소좀 및 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 엑소좀의 장기 보관용 조성물에 있어서,
   상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이고,
   상기 히알루론산은 1 mL 당 100 내지 500 mg의 농도로 포함하는 것인, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 히알루론산은 줄기세포 유래 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 생체적합성 고분자를 포함하지 않는 조성물에 비해 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 전체 조성물 1 mL 당 1 x 10⁹개 내지 1 x 10¹²개의 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물의 제형은 마이크로니들, 젤, 고체, 필름, 패치, 연고, 로션, 크림, 주사, 용액, 캡슐, 점안액, 및 점비액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 인간 진피 섬유아세포의 이동 및 증식을 촉진시켜 상처치유 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 콜라겐 생성 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 0 ℃ 내지 10 ℃ 또는 -30 ℃ 내지 -10 ℃에서 엑소좀의 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 1개월 내지 6개월 동안 보관이 가능한 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 장기 보관용 조성물.
    
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 상처치유 또는 피부재생용 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물에 의해 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
12. 줄기세포 유래 엑소좀 및 히알루론산을 포함하는 용해성 마이크로니들에 있어서,
    상기 마이크로니들은 상처치유 또는 피부재생용; 또는 주름개선용이고, 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성이 향상된 것이고,
    상기 히알루론산은 1 mL 당 100 내지 500 mg의 농도로 포함하는 것인, 마이크로니들.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 마이크로니들.
    
14. 줄기세포 유래 엑소좀에 생체적합성 고분자를 추가하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 안정성 증진 방법으로서,
    상기 생체적합성 고분자는 히알루론산, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란 및 카르복실메틸덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 보관 안정성; 또는 상처치유, 피부재생, 또는 콜라겐 생성 활성을 유지하기 위한 안정성을 향상시키는 것이고,
    상기 히알루론산은 1 mL 당 100 내지 500 mg의 농도로 포함하는 것인, 엑소좀의 안정성 증진 방법.