JP2004129549A

JP2004129549A - 脂肪由来細胞群からの間葉系幹細胞の選択的増殖方法

Info

Publication number: JP2004129549A
Application number: JP2002296502A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kitagawa; 北川　泰雄; Takamichi Miyazaki; 宮崎　隆道; Shuhei Torii; 鳥居　修平; Kazuhiro Toriyama; 鳥山　和宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2004-04-30

Abstract

【課題】間葉系組織の再建医療に必要な症例当たり１０^８個以上の間葉系幹細胞を患者に負担をかけることなく得ることができ、選択的に間葉系幹細胞を増殖させることができる手段を提供することである。また、間葉系幹細胞の分離手段および増殖技術の効率化が可能な手段を提供することである。
【解決手段】ヒトから採取した少量の脂肪片を酵素処理して得られる細胞型の混合集団から、遠心分離によって浮遊性の脂肪細胞集団を分離し、これを培養液を満たした培養器の天井面に接触させた状態で静置した時に下床面に沈降して増殖する線維芽様細胞で、継代培養によって増殖し、少なくとも骨、軟骨、脂肪の細胞に分化できる間葉系幹細胞を得る方法を提供する。
【選択図】図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪細胞集団から分化能の異なる間葉系幹細胞を選択的に得る方法またはその方法により得た間葉系幹細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（産業上の利用分野）
「医薬」に依存してきた医療に代わって、人体内の複雑系を人体外で量産し、障害や機能不全に陥った複雑系と置換する再生医療の時代が始まっている。これからは、「医薬」が「医療材料」に主役を謙り、「医療材料」を生産する産業が製薬産業と肩を並べる時代になる。このような「医療材料」の中で、最も重要視されるのが幹細胞である。最近、高い増殖性と多分化能を持つ多くの幹細胞が各国で発見されて、これを人体から分離して増殖させたり、人体の部分構造を形成させる技術開発が活発に進められている。このような幹細胞には、人体のあらゆる細胞に分化する胚性幹細胞（万能細胞）、血球系細胞を生み出す血球系幹細胞、パーキンソン病などの中枢神経系の障害の治療に利用できる神経系幹細胞などがある。人体の骨組みを形成している骨、軟骨、骨格筋、心筋、平滑筋、および脂肪などの間葉系組織の細胞に分化できる間葉系幹細胞も発見されている。この間葉系幹細胞を患者から簡便かつ安全に分離して体外で大量に増殖させる技術が開発されれば、失われたり機能低下した間葉系組織を補強、修復、および再生させる医療分野に根底的な改革をもたらすものと期待される。
【０００３】
（従来の技術）
白血病、再生不良性貧血、およびリンパ腫などの血球系細胞の異常による疾病を治療するために、健常者の骨髄から採取した血球系幹細胞を含む細胞集団を患者に移植する骨髄移植法が確立されている。この骨髄移植法では、組織適合性の不一致による拒絶反応を回避するために、骨髄バンクという公的システムを発達させて多数の登録者の中から患者と組織適合性が一致する供与者を検索し、血縁者間だけでなく他人間で移植できる体制が整備されている。この骨髄移植法では、採取した骨髄液に何の操作も加えず患者に移植しており、幹細胞を体外で増殖培養させることはなかった。
【０００４】
重度の熱傷、糖尿病患者の慢性皮膚潰瘍、高齢者の床ずれ、色素性母斑等の治療に用いることを目的にした培養皮膚が開発されている。これには培養真皮と培養表皮があるが、何れの場合にも、用いられている細胞が線維芽細胞または表皮角化細胞にしか分化せず、多分化能を持つ間葉系幹細胞を利用していない。また、救急治療に用いることを目的に、培養皮膚では組織適合性が一致しない個人間の移植も想定されている。
【０００５】
多様な間葉系組織の細胞に分化する能力を持っている間葉系幹細胞が骨髄液に潜在することが数年前に発見され、これを分離する方法が開発されている。この間葉系幹細胞は骨髄液に含まれる細胞の０．０１から０．００１％に過ぎず、間葉系組織の再生治療に必要となる１０^８個以上の細胞数を準備するには、１００から１０００リットルもの骨髄液が必要になる。臨床現場の研究者が患者の骨髄液から分離したこの種の細胞を培養操作を加えずに自家移植する治療を試みているが、大量の骨髄液の採取は患者に大きな負担を与えるだけでなく危険を伴う。
【０００６】
多分化能を持つ幹細胞が結合組織に内在していることを我々は１９９８年に発見している（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　１９９８；　９５：　１０６２　−１０６６）が、カリフォルニア大学ロスアンジェルス校のＭａｒｃ　Ｈ．　Ｈｅｄｒｉｃｋらはこの幹細胞の分離を目指して、肥満患者から吸引採取した大量の脂肪組織を遠心分離して、沈降画分（ＳＶＦ）の細胞集団に間葉幹細胞が含まれることを発表した（Ｚｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　２００１；　７，　２１１−２２８）。しかし、彼らのＳＶＦは血管内皮細胞や周細胞などが混在する細胞集団なので、間葉系幹細胞の取得効率は極めて低い。事実、彼らは３３０　ｍｌもの吸引脂肪を用いてはじめて間葉系幹細胞の分離に成功したが、このように大量の脂肪を採取できる肥満患者は少ないので実用性に乏しい。
【０００７】
加野浩一郎ら（特開２０００−８３６５６）は、動物の単胞性脂肪細胞由来の前駆脂肪細胞株を天井培養によって樹立する方法を開示しているが、この細胞は脂肪にのみ分化する細胞であって、それ以外に分化する間葉系幹細胞を開示するものではない。また、性質の異なる間葉系幹細胞を分離する方法を開示するものでもない。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−８３６５６号公報
【非特許文献１】
スギハラら（Ｓｕｇｉｈａｒａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．），ディファレンシエイション（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ），第３１巻，１９８６年，ｐ．４２−４９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
失われたり、機能不全に陥った骨、軟骨、骨格筋、心筋および脂肪等の間葉系組織を、患者自身または組織適合性が一致する他者から採取した間葉系幹細胞を移植することにより補強、修復および再建する治療が為されている。かかる治療には、症例当たり１０^８個以上の間葉系幹細胞が必要である。
【００１０】
ところが、この種の間葉系幹細胞を分離する従来技術では、大量の骨髄液または脂肪組織が必要であり、その採取のために患者には大きな負担をかけ、また患者を危険にさらすことさえある。また、この種の間葉系幹細胞の移植治療が普及するには、間葉系幹細胞の分離法と増殖技術の効率化が必要である。
【００１１】
従って、患者には大きな負担をかけずに症例当たり１０^８個以上の分化能を持つ間葉系幹細胞を得ることができる手段、または移植に用いる間葉系幹細胞の分離および効率的な増殖を可能とする手段の提供が期待されている。
【００１２】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、間葉系組織の再生医療に必要な症例当たり１０^８個以上の分化能を持つ間葉系幹細胞を患者に負担をかけることなく得ることができる手段、または移植に必要な間葉系幹細胞を選択的に増殖させることができる手段を提供することである。また、移植に用いる間葉系幹細胞の分離手段および増殖技術の効率化が可能な手段を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく、鋭意研究の結果、発明者らは、
▲１▼増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法、
▲２▼増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法、ならびに
▲３▼増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とを分離してそれぞれ得るための方法、
を発明した。
【００１４】
本明細書では、発明の第一の態様として、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法を提供する。
【００１５】
すなわち、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法を提供する。
【００１６】
特に、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
１）脂肪片を採取すること、
２）１）の脂肪片を酵素処理し、細胞型混合集団を得ること、
３）２）の細胞型混合集団を遠心分離し、脂肪細胞集団を得ること、
４）培養液で完全に満たした培養器中で３）の脂肪細胞集団を培養器の天井面（培養器の内側上面）に接触させて培養すること、
５）当該培養器の下床面（培養器の内側下面）上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法を提供する。なお、ステップ１）〜３）は本発明の本質的部分ではなく、脂肪細胞集団を得ることができるならば、当該ステップ１）〜３）以外の任意のステップでもよい。
【００１７】
本明細書において、間葉系幹細胞とは、骨、軟骨、骨格筋、心筋、脂肪、腱および靱帯の細胞、および間質細胞に分化する能力を有する幹細胞をいい、少なくとも骨、軟骨、脂肪の細胞に分化する能力を有する幹細胞をいう。なお、本明細書において、「細胞に分化する」と記載した場合には、当該細胞とは断定できないものの、少なくとも当該細胞の特徴を持つ細胞に分化する場合も含まれる。
【００１８】
本明細書において、酵素処理とは、ステップ１）により採取した脂肪片を細切した後に細胞型混合集団を分散させ、そして当該集団を得る処理のことをいい、当該脂肪片の細切物をコラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、ディスパーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼのいずれかを用い消化することにより行う。当該処理は、当業者に既知の手法および条件により可能である（Ｒ．　Ｉ．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ａ　ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　Ａｏｎｅｓ　Ｉｎｃ．，　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。例えば、実施例に記載の手法および条件により行うこともできる。
【００１９】
かかる酵素処理、すなわち、脂肪片の酵素処理は、細胞型混合集団を得ることを目的としている。従って、かかる目的を達成できるならば、ステップ２）以外の任意のステップでもよい。ここで、得られた当該細胞型混合集団には、２種類以上の異種性の細胞が含まれ、例えば、少なくとも２種類の間葉系幹細胞、様々な成熟段階にある脂肪細胞集団、内皮細胞、周細胞、間質細胞、および様々な血球系細胞などが含まれている。
【００２０】
また、本明細書において、脂肪細胞集団とは、ステップ３）において、ステップ２）により得られた細胞型混合集団を遠心分離することにより得られる細胞集団をいい、当該脂肪細胞集団には、少なくとも２種類の間葉系幹細胞、様々な成熟段階にある脂肪細胞集団などが含まれている。かかる脂肪細胞集団は、細胞中に多少の脂肪油滴を有する脂肪細胞であるか、当該脂肪細胞に結合している。そのため比重が軽く、培養液中で浮遊し、遠心分離による分離が容易である。なお、上述のように、ステップ３）は本発明の本質的部分ではなく、脂肪細胞集団を得ることができるならば、当該ステップ３）以外の任意のステップでもよい。
【００２１】
更に、本明細書において、「培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養する」と述べているのは、いわゆる「天井培養」を行うことを明確に示すためである。簡単に述べると、天井培養とは、脂肪細胞などが培養液中を浮遊する性質を利用して行う培養方法であって、培養器中の天井面に脂肪細胞などを接触させて培養する方法（Ｓｕｇｉｈａｒａ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，　３１：　４２−４９，　１９８６）をいう。
【００２２】
「天井培養」後、増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を次ステップで継代培養する。本明細書において、「線維芽様」なる用語は、細胞が線維芽のごとき形状を呈することをいう。従って、「線維芽様の間葉系幹細胞」とは、線維芽のごとき形状を呈する間葉系幹細胞をいい、また、間葉系幹細胞に限らず、単に「線維芽様細胞」とあれば、線維芽細胞のごとき形状を呈する細胞をいう。
【００２３】
ステップ４）における「天井培養」を行うことにより、天井面では、脂肪細胞に結合していた線維芽様の間葉系幹細胞が増殖し、一部は天井面でコンフルエント状態に達する。同時に、脂肪細胞との結合が弱かった線維芽様の間葉系幹細胞は培養液中で沈降し、下床面上において増殖してコンフルエント状態に達する。上記本発明の方法では、下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養する。そうすると、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得ることができる。これは、単に「天井培養」を行ったのみでは得られない発明の効果であり、また、特開２０００−８３６５６に開示の発明では得られない発明の効果である。
【００２４】
本発明の第二の態様として、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法を提供する。
【００２５】
すなわち、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法を提供する。
【００２６】
特に、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
１）脂肪片を採取すること、
２）１）の脂肪片を酵素処理し、細胞型混合集団を得ること、
３）２）の細胞型混合集団を遠心分離し、脂肪細胞集団を得ること、
４）培養液で完全に満たした培養器中で３）の脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
５）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法を提供する。なお、ステップ１）〜３）は本発明の本質的部分ではなく、脂肪細胞集団を得ることができるならば、当該ステップ１）〜３）以外の任意のステップでもよい。
【００２７】
本発明において、「間葉系幹細胞」、「酵素処理」、「細胞型混合集団」、「脂肪細胞集団」、「天井培養」および「線維芽様の間葉系幹細胞」なる用語などの定義または意義は、上記のとおりである。
【００２８】
本発明の第二の態様の方法においても上記の「天井培養」を行う。かかる「天井培養」後のステップでは、発明の第一の態様とは異なり、培養器の天井面に接着して増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養する。すなわち、本明細書の記載の発明の第一の態様では、培養器の下床面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養したが、発明の第二の態様では、培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養する。その結果、発明の第一の態様の方法により得られる骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とは性質の異なる脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞が得られる。
【００２９】
また、本明細書において、「脂肪細胞に分化しやすい」とは、脂肪への分化誘導処理によって脂肪滴を蓄積する細胞が高い効率で出現することをいい、「骨芽細胞に分化しやすい」とは、骨芽細胞への分化誘導処理によってより強い骨細胞の指標（例えば、アルカリフォスファターゼ反応およびＶｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色）を示す細胞が高い効率で出現することをいう。
【００３０】
従って、第二の態様の発明を実施することにより、増殖させた、「脂肪細胞に分化しやすい」間葉系幹細胞を得ることができるが、これは、単に「天井培養」を行ったのみでは得られない発明の効果であり、また、特開２０００−８３６５６に開示の発明では得られない発明の効果である。
【００３１】
上記二態様の方法の発明によって得られる線維芽様の間葉系幹細胞はいずれも高い増殖活性を持つので、継代培養によって効率よく増殖させることができる。このため、間葉系組織の再生医療に必要な症例当たり１０^８個以上の間葉系幹細胞を得ることができる。その結果、患者の負担は軽減されることになる。
【００３２】
また、上記二態様の方法の発明は、同時に実施することができる。「天井培養」によって、性質の異なる間葉系幹細胞（骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞、ならびに脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞）が同一培養器内の下床面および天井面において同時に個別に増殖するが、かかる下床面および天井面は物理的に分離していることから、相互に混合することはないためである。単に当該二発明の同時実施が可能ということにとどまらず、むしろ、積極的に同時に実施すれば、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞との分離および増殖が効率よく行うことができる。
【００３３】
そこで、本発明の第三の態様として、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とを分離してそれぞれ得るための方法を提供する。
【００３４】
すなわち、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とを分離してそれぞれ得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞、および当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ別々に得ること、
ｉｉｉ）ｉｉ）により得られた線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ継代培養すること、のステップを含む当該方法を提供する。
【００３５】
特に、増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とを分離してそれぞれ得る方法であって、
１）脂肪片を採取すること、
２）１）の脂肪片を酵素処理し、細胞型混合集団を得ること、
３）２）の細胞型混合集団を遠心分離し、脂肪細胞集団を得ること、
４）培養液で完全に満たした培養器中で３）の脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
５）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞、および当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ別々に得ること、
６）５）により得られた線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ継代培養すること、
のステップを含む当該方法を提供する。なお、ステップ１）〜３）は本発明の本質的部分ではなく、脂肪細胞集団を得ることができるならば、当該ステップ１）〜３）以外の任意のステップでもよい。
【００３６】
本発明において、「間葉系幹細胞」、「酵素処理」、「細胞型混合集団」、「脂肪細胞集団」、「天井培養」および「線維芽様の間葉系幹細胞」なる用語などの定義または意義は、上記のとおりである。
【００３７】
上記第三の態様の方法の発明を実施すれば、当然、間葉系組織の再生医療に必要な症例当たり１０^８個以上の間葉系幹細胞を得ることができる。更には、再生しようとする間葉系組織の種類に応じた間葉系幹細胞を選択的に得ることができる。上述のように、異なる種類の間葉系組織に応じた細胞が下床面および天井面において個別に増殖するためである。また、再生医療に用いる間葉系幹細胞の分離手段および増殖技術の効率化も可能となる。性質の異なる間葉系幹細胞の分離および増殖を同時に行うことができるからである。これは、単に「天井培養」を行ったのみでは得られない発明の効果であり、また、特開２０００−８３６５６に開示の発明では得られない発明の効果である。
【００３８】
上記三態様の方法の発明のいずれの場合においても、ステップ１）で脂肪細胞集団の源である脂肪片を採取している。ところが、本発明では、脂肪細胞集団が得られるならば、当該源は脂肪片に限られず、任意の源であってもよい。
【００３９】
また、脂肪細胞集団の源が脂肪片である場合、ステップ２）および３）を経て、脂肪細胞集団を得ることができるものであれば、生体内のいずれの組織または器官由来の脂肪であってもよい。例えば、皮下脂肪、腸間膜や腎臓周囲の内臓脂肪、精巣上体脂肪、および筋肉組織内脂肪が挙げられる。より好ましくは、皮下脂肪および内蔵脂肪が挙げられる。更には、当該ステップ２）および３）を経て、脂肪細胞集団を得ることができるものであれば、いずれの生物種由来の脂肪であってもよい。例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、およびニワトリが挙げられる。より好ましくは、ヒトおよびマウスが挙げられる。なお、採取される生物種がヒトの場合、当該ヒトの負担を考えれば、採取する脂肪片は、０．５ｇ以内とすべきである。
【００４０】
また、更なる本発明の態様として、上記のいずれかの方法により得た間葉系幹細胞、すなわち、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞および脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞も本発明として提供する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
局部麻酔を施した被験者（患者または組織適合性が一致する供与者）の体表面を幅１ｃｍと長さ２ｃｍの範囲で紡錘状に０．５ｃｍの深さで切り込んで得られる皮膚と皮下脂肪を含む標本から少量の脂肪片を採取する（図１）。
【００４２】
得られた脂肪片を細切した後にコラゲナーゼ処理によって細胞外マトリックスを部分消化して細胞型の混合集団の分散液を得る（図２）。
【００４３】
この細胞分散液を遠心分離して、間質細胞、血管内皮細胞、および血球系細胞の混合集団　（ＳＶＦ）　を沈降画分として、脂肪滴を持つために浮遊する成熟脂肪細胞を主に含む脂肪細胞集団を上層画分として得る（図２）。
【００４４】
得られた成熟脂肪細胞を主に含む画分を培地で満たしたＴフラスコ中に移し、成熟脂肪細胞がＴフラスコの天井面に接触した状態で培養する（図２）。
【００４５】
この状態で２週間静置すると、天井面に弱く接着した成熟脂肪細胞の間隙に線維芽様細胞が増殖してコンフルエント状態に達する（図３）。これらの線維芽様細胞は、脂肪細胞が脱分化したものか、あるいは、成熟脂肪細胞に強く結合していた間葉系幹細胞が天井面に接着して増殖したものと考えられる。
【００４６】
この時、下床面にも線維芽様細胞が旺盛に増殖する（図３）。これらの細胞は、成熟脂肪細胞に弱く結合していた間葉系幹細胞が増殖状態に入るとともに成熟脂肪細胞との結合力が弱まって沈降し、下床面で増殖したものと考えられる。
【００４７】
下床面および天井面で増殖した線維芽様細胞を個別に剥離して常法で継代培養すると、それぞれに特徴的な形態を維持しながら旺盛に増殖する（図４）。
【００４８】
２歳男児の大腿部から得た０．４６グラムの皮下脂肪片を用いた例では、初代培養終了時に下床面の線維芽様細胞数と天井面の細胞数は８ｘ１０^５個と　４ｘ１０^５個であったものが、９回または８回にわたる継代培養の後に、それぞれ、１０^１３個と１０^１２個にまで増殖したと計算された（図５）。この高い増殖能は、これらの細胞が平均２４回以上の分裂増力を持つことを示す。
【００４９】
平均１０回分裂増殖したそれぞれの線維芽様細胞集団に対して、脂肪細胞への分化誘導処理を施すと、初代培養時に天井面で増殖した細胞は高い効率で脂肪様細胞に分化する間葉系幹細胞の特徴を示したが、下床面で増殖した細胞は低い脂肪様細胞への分化能しか示さなかった（図６）。
【００５０】
初代培養時に２週間静置する代わりに、２日目ごとに天地を逆転させて天井面に弱く接触している成熟脂肪細胞を倒立顕微鏡で検鏡する操作を加えると、天井面で増殖する間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化確率は減少し、下床面で増殖する線維芽様の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化確率は増加した（図７）。このことは、天井面と下床面で増殖する線維芽様細胞の分化能力は異なっており、前者が脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞であるのに対して、後者は骨、軟骨にも分化できる間葉系幹細胞であったものが、天地を逆転させる操作によって混合したことを示している。
【００５１】
平均１０回分裂増殖した天井面と下床面の線維芽様細胞に対して、骨芽細胞への分化誘導処理を施すと、初代培養時に天井面で増殖した細胞は低い確率で脂肪様細胞に分化したが、下床面で増殖した細胞は高い分化能を示した（図８）。
【００５２】
同様の細胞に細胞塊を形成させた後に軟骨への分化誘導培地中に置くと、天井面と下床面で増殖した細胞は共に軟骨特異的なグルコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸）に対する陽性反応を示した。これらの結果は、下床面で増殖した線維芽様細胞がより広範囲の多分化能を持つ幹細胞であるのに対して、天井面で増殖した線維芽様細胞は脂肪細胞への分化段階に踏み込んだ幹細胞であることを示した。
【００５３】
参照として並行的に培養したＳＶＦ画分の細胞は、培養当初は高い増殖能を示した後に緩やかな増殖曲線を示した（図５）。また、ＳＶＦ画分から増殖する細胞集団の脂肪様細胞への分化確率は低いが（図６）軟骨には分化できることが判明した（図８）。このＳＶＦ画分の細胞集団の顕微鏡像は分離当初から不揃いな形態を示したが（図４）、その不均一性は骨芽細胞への分化能力でも明らかであった。すなわち、ＳＶＦ画分から増殖する細胞集団には骨芽細胞に分化する細胞も含まれていたが、骨芽細胞には分化しない細胞も含まれていた（図１０）。
【００５４】
マウスの脂肪組織に対して同様の分離操作を施すことによって、同じく天井面と下床面で増殖し、継代培養が繰り返せる高い増殖能と脂肪、骨芽細胞、筋芽細胞等への分化能を示す間葉系幹細胞が得られた。
【００５５】
以上のように、生体から採取した少量の脂肪組織片から分散させた細胞集団を天井培養することによって、すでに樹立法が発明されている前駆脂肪細胞株（特開２０００−８３６５６）だけでなく、骨、軟骨、脂肪に分化できる間葉系幹細胞を下床面で増殖する線維芽様細胞として取得する方法を新たに発明した。この方法によれば、０．５グラム以内の脂肪組織片から、少なくとも、移植による間葉系組織の補強、修復、再建に利用するに十分な量の間葉系幹細胞を得ることが可能である。
【００５６】
【実施例】
［実施例１］
細胞培養培地の調製
ヒト脂肪組織由来細胞集団、ヒト線維芽様細胞の培養、および細胞分離にはウシ胎児血清（ＵＩＮ：５３１４１　Ｌｏｔ：Ｂ０１２４９−５００、ＴＲＡＣＥ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ　ＬＴＤ）を２０％含む、ハムＦ１２培地（ｃｏｄｅ：０５９１０日水製薬社）とダルベッコ変法イーグル培地（ｃｏｄｅ：０５９１９日水製薬社）高グルコース組成の等倍量混合液に５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン（明治製薬社）と５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製薬社）を加えた合成培地（培地１）を用いた。培地１は使用前に予め３７℃で５時間、５％ＣＯ_２／９５％空気のもとで飽和処理した。
【００５７】
［実施例２］
ヒト成熟脂肪細胞画分の分離
２歳男児の下腹部から皮下脂肪組織片０．９８ｇ（これから得られた脂肪細胞集団を実施例３で２分割したので、実験例当たりでは０．４９４９ｇに相当する。）を採取した後、３０ｍｌの培地１で三度洗浄し、脂肪組織を直径１０ｃｍペトリディッシュ（ＮＵＮＣ社）に移した。尖刃刀を用いて脂肪組織片を２ｍｍ角片以内に細切した後、５０ｍＬ容の遠心管に移した。１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液（ＣＯＬＬＡＧＥＮＡＳＥ　ＴＹＰＥ１　２７４ｕ／ｍｇ　Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）を切片重量の約二倍量にあたる２ｍｌ加え、３７℃で１時間振盪しながら細胞外マトリックスを消化した。新たに培地１を２０ｍｌ添加してピペッティングで分散した細胞を、金属篩を通して別の遠心管に入れ、卓上遠心機（ｈｉｍａｃ　ＣＴ　６Ｄ　日立製作所社）を用いて室温下１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後、成熟脂肪細胞を主に含む液面の画分を採取し、別の遠心管に移して新たに培地１を約２０ｍｌ加えて洗浄した。この洗浄操作を更に二度繰り返した後、少量の細胞分散液を等量のチュルク液（ｃｏｄｅ：３７２−１２　ナカライテスク社）で二分間染色して、油滴を持つ有核細胞数を測定し脂肪細胞集団の分離数とした。
【００５８】
［実施例３］
ヒト脂肪細胞集団の播種
４×１０^５細胞の脂肪細胞集団を培養面積２５ｃｍ^２のＴフラスコ（全容量７０ｍｌ　Ｎｕｎｃイージーフラスコ　カタログＮｏ．１５６３４０　ＮＵＮＣ社）二つにそれぞれ播種した。０．５μｇ／ｍｌ　になるようにＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（ｃｏｄｅ：１５２９０−０１８　ＧＩＢＣＯ社）を加え、培地１でフラスコを完全に満たした後に密栓し、浮かび上がる脂肪細胞集団がフラスコの非コーティング面側に接触するようにフラスコを静置し、３７℃で培養した。
【００５９】
［実施例４］
ヒト間質−血管系（ＳＶＦ）画分の分離
脂肪細胞集団の分離と同時に、細胞分散液を卓上遠心機で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離して底に沈んだ細胞を間質−血管系画分（ＳＶＦ）とした。ＳＶＦを別の遠心管に移し、２０ｍｌの培地１を加えてピペッティングした後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた沈殿画分を、２０ｍｌの培地１で同様の洗浄操作を更に二回繰り返した。細胞分散液を等量のチュルク液で二分間染色し、有核細胞数を測定してＳＶＦの細胞数とした。
【００６０】
［実施例５］
ヒト間質−血管系画分の播種
２．３×１０^５細胞のＳＶＦを７ｍｌの培地１に懸濁し、培養面積２５ｃｍ^２のＴフラスコに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和下で培養した。
【００６１】
［実施例６］
ヒト脂肪細胞集団の初代培養
作製した二つのフラスコを、一方は一週間完全に静置した後にフラスコを天地逆転させて観察を始め、もう一方は播種二日目以後からフラスコを天地逆転させて毎日観察した。観察には倒立型システム顕微鏡（ＩＭＴ−２　ＯＬＹＭＰＵＳ社）を用い、適宜に細胞の形態をＡＥ一眼レフカメラ（１６７ＭＴ　ＣＯＮＴＡＸ社）で撮影した。脂肪細胞集団の分離から天井培養までの流れを図２にまとめた。播種から４日目から線維芽様細胞がフラスコの天井側と下床側に付着して分裂増殖し始めた。播種から９日目には脂肪細胞集団が天井面に接着を示すとともに多胞性脂肪細胞が出現した。線維芽様細胞はその後活発な増殖を示し、播種から２週間後には天井、下床面の両方ともコンフルエント状態に達した。播種から２週間までは培地の交換を行わなかった。播種から７日目の天井面と下床面で増殖しはじめた線維芽様細胞の形態を図３に示す。
【００６２】
［実施例７］
初代培養中に現れたヒト線維芽様細胞の分離
播種から二週間後に天井面と下床面で増殖した線維芽様細胞をそれぞれ別に剥離させた。初めに下床面で増殖した線維芽様細胞のみを剥離させ、次に天井面で増殖した細胞を剥離させた。下床側を５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液（ｃｏｄｅ：３４５−０８１６５Ｗａｋｏ社）で３０秒間浸した後、０．２５％トリプシン溶液（Ｔ−４７９９　シグマ社）を培養面が浸る量だけ加え、３７℃で２分間静置した。その後、６ｍｌの培地１を加えてピペッティングにより細胞を分散させ、別のフラスコに移した。次に同様に天井側を５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液で３０秒間浸した後、０．２５％トリプシン溶液を培養面が浸る量を加え、３７℃で２分間静置した。その後、６ｍｌの培地１を加えてピペッティングにより細胞を分散させ、別のフラスコに移した。それぞれ分散液の細胞数を数え、４分の１量（１〜２×１０^５細胞）を新しい培養面積２５ｃｍ^２　Ｔフラスコに播種し、７ｍｌの培地１で満たした。３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和飽和下で培養し、播種から２４時間後に、培地を新しい培地１と交換した。分離した天井面と下床面で増殖した線維芽様細胞の形態を図４に示す。
【００６３】
［実施例８］
天井面と下床面で増殖したヒト線維芽様細胞の継代培養
天井面と下床面で増殖した線維芽様細胞はそれぞれ播種から４日後にコンフルエント状態に達した。コンフルエント状態になる直前に細胞継代を行った。すなわち、培地を除去した後に５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液で３０秒間洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液を培養面が浸る量だけ加え、３７℃で２分間静置した。８ｍｌの培地１を加えピペッティングにより細胞を分散させた後、細胞数を計測して約４分の１量（１〜２×１０^５細胞）を新しいＴフラスコに播種し、７ｍｌの培地１で満たした。細胞は３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下で培養し、２４時間後に培地を新しい試料１と交換した。培地の交換は二日毎に行った。
【００６４】
［実施例９］
ヒト間質−血管系（ＳＶＦ）画分の継代培養
播種から約４日後にコンフルエント状態に達したので、４日毎に細胞を希釈して継代培養を行った。培地を除去した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液（Ｗａｋｏ社）で３０秒間浸した後、０．２５％トリプシン溶液を培養面が浸る程度に加え、３７℃で２分間静置した。８ｍｌの試料１を加えてピペッティングにより細胞を分散させた後、細胞数を計測して約４分の１量を新しいＴフラスコに播種した。試料１を７ｍｌに満たし、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下で培養した。播種から２４時間後に培地を新しい培地１に交換した。
【００６５】
［実施例１０］
脂肪細胞への分化誘導
ＳＶＦ、天井面で増殖した線維芽様細胞と下床面で増殖した線維芽様細胞、また早期にフラスコを天地逆転させる検鏡操作を加えた場合に天井面で増殖した線維芽様細胞と下床面で増殖した線維芽様細胞のそれぞれを、２５ｃｍ^２Ｔフラスコ上で培養し、コンフルエントの直前に脂肪細胞誘導培地（ダルベッコ変法イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、０．５ｍＭ　３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｌ−６７６８　シグマ社）、１μＭ　デキサメサゾン（Ｄ−１７５６　シグマ社）、１０μＭ　インシュリン（Ｉ−５５００　シグマ社））を７ｍｌ加えて、３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下４日間培養し、その後は１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地中で３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下、３週間培養した。培地は４日毎に新鮮な培地に交換した。脂肪細胞特異的な形態変化を、倒立型システム顕微鏡を用いて観察し、ＡＥ一眼レフカメラで撮影した。誘導から３週間後の形態を図６と図７に示す。ＳＶＦは低い脂肪分化率を示したのに対し（図６（１））、天井面で増殖した線維芽様細胞は非常に高い脂肪分化効率を示した（図６（２））。逆に下床面で増殖した線維芽様細胞は低い分化効率を示した（図６（３））。早期にフラスコを天地逆転させた場合には、天井面と下床面の両者に脂肪誘導が見られた（図７（１））、（図７（２））。
【００６６】
［実施例１１］
骨芽細胞への分化誘導
ＳＶＦ、天井側線維芽様細胞、下床面側線維芽様細胞のそれぞれを２５ｃｍ^２のＴフラスコ上で培養し、コンフルエントの直前に骨芽細胞誘導培地（ダルベッコ変法イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、０．１μＭ　デキサメサゾン、５０μＭ　Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（ｃｏｄｅ：０１３−１２０６１　和光純薬社）、１０ｍＭ　β−グリセロリン酸（Ｇ−９８９１　シグマ社））を７ｍｌ加えて３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下で３週間培養した。培地は４日毎に新鮮な同骨芽細胞誘導培地に交換した。
【００６７】
［実施例１２］
アルカリフォスファターゼ反応とＶｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色（骨芽細胞分化の確認）
誘導を始めてから３週間後に培地を除き、冷リン酸緩衝液で一度洗浄した。冷１０％中性フォルムアルデヒド−リン酸緩衝液中に１５分間浸して細胞を固定した後、蒸留水で一度洗浄し、更に蒸留水に１５分間浸した。アルカリフォスファターゼ基質液（Ｎａｐｈｔｈｏｌ　ＡＳ　ＭＸ−ＰＯ＿（Ｎ−５０００　シグマ社）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ｃｏｄｅ：０４５−０２９１６　和光純薬社）、トリス緩衝液（ｐＨ８．３）、Ｒｅｄ　Ｖｉｏｌｅｔ　ＬＢ　ｓａｌｔ（Ｆ−１６２５　シグマ社）を加えて室温で４５分間反応させた後、蒸留水で３度洗浄した。２．５％硝酸銀水溶液を加え、室温で３０分間反応させ後、蒸留水で３度洗浄し、すぐに倒立型システム顕微鏡を用いて染色を観察し、ＡＥ一眼レフカメラで撮影した。染色の様子を図８に示す。下床面に増殖した線維芽様細胞は非常に高い骨芽細胞誘導率を示し（図８（２））、天井面に増殖した線維芽様細胞はやや高い骨芽細胞誘導率を示した（図８（３））。ＳＶＦは非常に高い骨芽細胞誘導を示す領域と骨芽細胞誘導を示さない領域が混在していた（図１０）。
【００６８】
［実施例１３］
軟骨細胞への分化誘導
ＳＶＦ、天井側線維芽様細胞、下床側線維芽様細胞のそれぞれを、１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液で３０秒間洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液を培養面が浸る程度に加えて３７℃で２分間静置して細胞を剥離させた。細胞数を測定した後、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上清を除いた。細胞懸濁液の濃度が８×１０^６細胞／ｍｌになるように培地１を加えて調整し、その１０μｌを直径６ｃｍディッシュ（ＮＵＮＣ社）中央に滴下した。３７℃で２時間、ＣＯ_２インキュベーター内で静置して細胞塊を作製した後、軟骨細胞誘導培地（ダルベッコ変法イーグル培地、１％ＦＢＳ、６．２５μｇ／ｍｌ　インシュリン、１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＧＦ−β１（カタログ＃：１００−２１Ｒ、ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ　ＥＣ　ＬＴＤ）、５０μＭ　Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）を重層した。これを２週間、培地交換を行わずに培養した。またＳＶＦを用いて、軟骨細胞誘導培地の代わりに培地１で培養した非誘導の検体を用意した。
【００６９】
［実施例１４］
Ａｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅ染色（軟骨細胞への分化の確認）
誘導を始めてから２週間後に培地を除き、冷リン酸緩衝液で一度洗浄した。冷１０％中性フォルムアルデヒド−リン酸緩衝液中に１５分間浸して細胞を固定した後、蒸留水で一度洗浄した。１％（ｗ／ｖ）　Ａｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅ（Ａ−５２６８，シグマ社）を０．１Ｎ塩酸（ｐＨ１．０）に溶解させた染色液を４ｍｌ加え、３０分間室温で保温した。過剰な染色を除くために０．１Ｎ塩酸（ｐＨ０．１）を４ｍｌ加えて５分間保温した後、蒸留水で一度洗浄した。すぐに倒立型システム顕微鏡を用いて染色を観察し、ＡＥ一眼レフカメラで撮影した。染色の様子を図９に示す。非誘導は全く染色されなかったが、分化誘導したＳＶＦ、天井側線維芽様細胞、下床側線維芽様細胞はいずれも軟骨特異的グルコサミノグリカンであるコンドロイチン硫酸陽性を示す緑青色に染色され、軟骨細胞への分化能力を示した。
【００７０】
［実施例１５］
マウス脂肪細胞集団の分離
マウスである（Ｃ５７ＢＬ／６）雄６月齢一匹を頚椎脱臼により殺し、大腿上部の脂肪組織０．５ｇを採取した。２０ｍｌのハンクス塩類緩衝液中で脂肪組織を洗浄した後、尖刃刀を用いて脂肪組織を２ｍｍ角片以内に細かく分散させた。５０ｍｌ容遠心管に移し、２ｍｌの１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液を加え、３７℃で１時間振盪しながら細胞外マトリックスの消化を行った。新たに培地１を１０ｍｌ添加してピペッティングした細胞分散液を、金属篩を通して別の遠心管に入れ、卓上遠心分離機を用いて室温下１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後、成熟脂肪細胞を主に含む液面の画分を採取して別の試験管に移し、培地１を約２０ｍｌ加えて洗浄した。この洗浄操作を更に二度繰り返した後、少量の細胞分散液を等量のチュルク液で二分間染色して、油滴を持つ有核細胞数を測定し脂肪細胞集団の分離数とした。
【００７１】
［実施例１６］
マウス脂肪細胞集団の初代培養
８．５×１０^５の成熟脂肪細胞を２５ｃｍ^２のＴフラスコ（全容量７０ｍｌ　ＮｕｎｃイージーフラスコカタログＮｏ．１５６３４０　ＮＵＮＣ社）に播種した。０．５μｇ／ｍｌ　Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅを加えた培地１でフラスコを完全に満たした後に密栓し、浮かび上がる成熟脂肪細胞がフラスコの非コーティング面側に接触するようにフラスコを静置し、３７℃で培養した。
【００７２】
［実施例１７］
天井面と下床面で増殖したマウス線維芽様細胞の継代培養
天井面と下床面で増殖した線維芽様細胞はそれぞれ播種から４日後にコンフルエント状態に達した。コンフルエント状態になる直前に細胞継代を行った。すなわち、培地を除去した後に５ｍｌの１ｍＭ　ＥＤＴＡリン酸緩衝液で３０秒間洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液を培養面が浸る量だけ加え、３７℃で２分間静置した。８ｍｌの培地１を加えピペッティングにより細胞を分散させた後、細胞数を計測して約４分の１量（１〜２×１０^５細胞）を新しいＴフラスコに播種し、７ｍｌの培地１で満たした。細胞は３７℃、５％ＣＯ_２／９５％空気の飽和条件下で培養し、２４時間後に培地を新しい試料１と交換した。培地の交換は二日毎に行った。これらの細胞は、少なくとも、６回の継代培養にわたって旺盛な増殖能を示し、脂肪および骨芽細胞への高い分化効率を示した。
【００７３】
【発明の効果】
本発明により、間葉系組織の再生医療に必要な症例当たり１０^８個以上の、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞ならびに脂肪脂肪に分化しやすい間葉系幹細胞を患者に負担をかけることなく得ることができる。また、本発明により、移植に必要な間葉系幹細胞を選択的に増殖させることができる。更には、本発明により、移植に用いる間葉系幹細胞の分離手段および増殖技術の効率化も可能となる。これらの発明の効果は、単に「天井培養」を行ったのみでは得られないものであり、また、特開２０００−８３６５６に開示の発明では得られない効果である。
【００７４】
更には、この発明によって、間葉系組織に分化できる患者自身の幹細胞が大量に準備できるようになるので、これを移植することによって、失われたり機能低下した骨、軟骨や脂肪組織などを再建する医療が可能になる。外傷や癌によって軟部組織を失った患者や、顔面の半側の皮下結合組織だけが萎縮する顔面半側萎縮症の患者などの治療には、患者自身の脂肪組織を必要とする部位に自家移植する方法が採用されてきが、移植後に吸収や瘢痕化が起こりやすく、移植した体積が失われる難点があった。これは移植脂肪の大半を占めていた成熟脂肪細胞が壊死するためと考えられるが、体外で選択的に増殖させた幹細胞を移植すればこの問題は解決できると期待される。このような軟部組織の再建術は、豊胸術などの美容外科分野への発展も期待される。この幹細胞の多分化能を活用すれば、開放骨折などで失われた骨格の大規模な再建も可能になる。この幹細胞が心筋細胞にも分化することが確かめられれば、働き盛りの中高年層を襲う心臓病の克服が期待できる。この発明が可能にした患者の幹細胞を大量に増殖させる技術は、このような新しい再生医療分野の開拓にもつながるので、その効果は計り知れない。安全かつ簡便に採取できる０．５グラム以下の脂肪から幹細胞が量産できるこのシステムを健常人に拡大すれば、「間葉系幹細胞バンク」の構築が可能になり、組織適合個体間の若年者から老人への移植も展望できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、皮下脂肪組織片の採取例を示す。
【図２】図２は、（１）実施例２、実施例３、実施例６における間葉系幹細胞の選択的増殖法のフローチャートおよび（２）その模式図を示す。
【図３】図３は、（１）実施例６における培養中に天井面に現れた線維芽様細胞、および（２）実施例６における培養中に下床面に現れた線維芽様細胞を示す。
【図４】図４は、（１）実施例５におけるＳＶＦの細胞の形態、（２）実施例７において下床面で増殖した線維芽様細胞の形態、および（３）実施例７において天井面で増殖した線維芽様細胞の形態を示す。
【図５】図５は、実施例８、実施例９におけるＳＶＦ、天井面で増殖した線維芽様細胞、下床面で増殖した線維芽様細胞のそれぞれの増殖曲線を示す。
【図６】図６は、（１）実施例１０におけるＳＶＦの脂肪誘導、（２）実施例１０における天井面で増殖した線維芽様細胞の脂肪誘導、および（３）実施例１０における下床面で増殖した線維芽様細胞の脂肪誘導を示す。
【図７】図７は、（１）実施例１０における天地逆転して毎日観察した際の天井面で増殖した線維芽様細胞の脂肪誘導、および（２）実施例１０における毎日観察した際の下床面で増殖した線維芽様細胞の脂肪誘導を示す。
【図８】図８は、（１）実施例１１における非誘導のＳＶＦ（コントロール実験）の骨誘導、（２）実施例１１における下床面で増殖した線維芽様細胞の骨誘導、および（３）実施例１１における天井面で増殖した線維芽様細胞の骨誘導を示す。
【図９】図９は、実施例１３における軟骨誘導で、（１）軟骨誘導培地に置かなかったＳＶＦ、（２）軟骨誘導培地に置いたＳＶＦ、（３）軟骨誘導培地に置いた下床面で増殖した線維芽様細胞、および（４）軟骨誘導培地に置いた天井面で増殖した線維芽様細胞のＡｌｃｉａｎ　Ｂｌｕｅによる染色像を示す。カラー撮影した画像から抽出した青色要素を黒色に変換して示した。
【図１０】図１０は、（１）〜（３）実施例１１におけるＳＶＦの骨誘導を示す。同一検体中の顕微鏡像の異なる視野を撮影した写真である。

Claims

増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法。
増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養すること、
のステップを含む当該方法。
増殖させた、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、増殖させた、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とを分離してそれぞれ得るための方法であって、
ｉ）培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養すること、
ｉｉ）当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞、および当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ別々に得ること、
ｉｉｉ）ｉｉ）により得られた線維芽様の間葉系幹細胞をそれぞれ継代培養すること、のステップを含む当該方法。
脂肪細胞集団がヒト由来である、請求項１から３のいずれかの方法。
脂肪細胞集団がマウス由来である、請求項１から３のいずれかの方法。
脂肪細胞集団が皮下脂肪由来である、請求項１から５のいずれかの方法。
脂肪細胞集団が内臓脂肪由来である、請求項１から５のいずれかの方法。
請求項１から７のいずれかの方法により得た間葉系幹細胞。