CN113134014A - 囊泡在制备血友病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种囊泡在制备治疗出血性疾病的药物中的应用。本发明提供了囊泡在制备治疗出血性疾病的药物中的应用，所述囊泡是诱导性囊泡。本发明所述的诱导性囊泡能够在体外发挥显著的促凝作用，体内注射后能够显著改善出血倾向，可用于改善凝血因子匮乏、血小板数量减少和/或功能缺陷导致的出血，例如用于改善血友病、红斑狼疮性出血倾向和契‑东综合征的治疗，且所述囊泡可以通过皮肤和毛发排出，在体内具有安全性，具有良好的应用前景。

Description

囊泡在制备血友病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及囊泡在制备血友病药物中的应用。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载 体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发 挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作 用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。目前该领域的研究主要集中在外泌体 (exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有RNA、脂质和蛋白质等成 分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今 为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研 究发现MSCs来源的外泌体能模拟MSCs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面 发挥了重要的调控作用。因此，近年来以MSCs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发 展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过 程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治 疗的临床转化和应用。
血友病(hemophilia)为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成 障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。 2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，血友病被收录其 中。血友病主要分为三类，即血友病A，血友病B和血友病C。血友病A，即因子Ⅷ促凝成分(Ⅷ： C)缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。血友病B，即因子Ⅸ(FIX)缺乏症，亦 为性联隐性遗传，其发病数量较血友病A少。血友病C，即因子Ⅺ(FⅪ)缺乏症，为常染色体不完全隐 性遗传，是一种罕见的血友病。发病率以血友病A最多占80％-85％，血友病B占15％-20％，血友病C 很少见。长期以来，针对血友病的治疗，临床上以注射外源性凝血因子做为主要干预措施，但该方法存 在治疗成本高、治疗有效期短、易产生自身抗体等各种问题，无法成为切实有效的治疗手段。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了囊泡在血友病中的应用。其中的囊泡为诱导性囊泡。
一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡在制备治疗出血性疾病的药物中的应用，所述囊泡是诱导 性囊泡。
一些实施方案中，将所述囊泡用于疾病治疗的过程中，可以将所述囊泡任选地通过选自由静脉内注 射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。例如，作为 例子，对于静脉注射，可以通过尾静脉注射。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子， 胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。
作为例子，对于胃肠腔输注中腹腔注射，与尾静脉注射相比，腹腔注射也可以获得同等良好的治疗 效果。腹腔注射的安全性和可操作性要优于尾静脉注射。
一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而 产生的囊泡。
一些实施例中，所述细胞可以为体细胞或干细胞。
一些实施例中，所述细胞可以是原代培养的细胞，也可以是已有的或已确立的细胞系。
一些实施例中，所述细胞可以是确立细胞株。
一些实施例中，所述细胞系指的是是指永生化的细胞培养物，在适当的新鲜培养基和空间下可以无 限增殖。
一些实施例中，所述的体细胞包括成骨细胞系。
一些实施例中，所述的细胞可以为间充质干细胞或诱导性多能干细胞。
一些实施例中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌素诱导间充质干细胞凋亡产生。
一些实施例中，公开了一种制备囊泡的方法，所述方法为通过添加凋亡诱导剂诱导间充质干细胞产 生所述囊泡。
一些实施例中，所述方法包括步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上 清；(3)从步骤(32)中的培养基上清中分离出囊泡。
一些实施例中，所述步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细 胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。
一些实施例中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。
一些实施例中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一 次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到 到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
一些实施例中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟。一些实施例中，所述第一次离心为 500-1000g离心5-20分钟。一些实施例中，所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。一些实施例 中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟。一些实施例中，所述第二次离心为1500-2500g离心 5-20分钟。一些实施例中，所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。一些实施例中，所述第三次 离心为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施例中，所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分 钟。一些实施例中，所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。一些实施例中，所述第四次离心 为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施例中，所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟。一 些实施例中，所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
一些实施例中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。
一些实施例中，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，但又不限于此。
一些实施例中，所述哺乳动物选自人或鼠，但又不限于此。
一些实施例中，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组 合。
一些实施例中，所述间充质干细胞来源选自骨髓、脂肪、脐带和口腔中的一种或多种。
一些实施例中，所述间充质干细胞来源于骨髓。
一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为1-10000nM。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度 为100-10000nM。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-10000nM。一些实施例中，所述星形 孢菌素的浓度为500-1000nM。一些实施例中，所述星形孢菌素的浓度为500-900。一些实施例中，所述 星形孢菌素的浓度为500-800。
一些实施例中，所述诱导性囊泡具有标志物Syntaxin 4。
一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Syntaxin 4。
一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Syntaxin 4的表达高于MSC或外泌体。
一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达 量的3-6倍。
一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达 量的3.5-5倍。
一些实施例中，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达 量的4.45倍。
一些实施例中，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5中的一种或 多种。
一些实施例中，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的 组合。
一些实施例中，所述诱导性囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin11、Integrin alpha 5。
一些实施例中，所述诱导性囊泡对标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表 达量高于MSC或外泌体。
一些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin11、Integrin alpha 5的 表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍。一 些实施例中，所述诱导性囊泡中的标志物AnnexinV、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量 分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍。
一些实施例中，所述囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量 分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍。
一些实施例中，所述诱导性囊泡还表达CD29、CD44、CD73、CD166；且不表达CD34、CD45。
一些实施例中，所述诱导性囊泡还表达CD9、CD63、CD81和C1q中的一个或多个。
一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径为0.03-6μM。一些实施例中，所述诱导性囊泡的直径为0.03- 4.5μM。
一些实施例中，所述出血性疾病包括凝血因子匮乏、血小板数量减少和/或功能缺陷导致的出血。
一些实施例中，所述出血性疾病包括血友病、狼疮性出血或契-东综合征。
一些实施例中，所述血友病包括血友病A、血友病B和血友病C。
一些实施例中，所述血友病为血友病A。
附图说明
图1A-1E为分离的BMMSCs的表面标志物的流式检测结果。
图2为实施例2的操作流程图。
图3为用流式细胞分析技术分析的MSCs(106个MSCs)产生的IEVs数量统计结果。
图4A-图4F为IEVs颗粒的直径检测：图4A为流式检测IEVs的颗粒直径分布图；图4B为侧向散射 光(SSC)分析IEVs的散射光强，显示IEVs颗粒直径分布；图4C为以BangsLaboratories公司生产的标 准化小颗粒微球分析IEVs的散射光强，显示IEVs的颗粒直径分布；图4D为透射电镜(TEM)观察的 IEVs，显示IEVs的颗粒直径分布；图4E为纳米粒子跟踪分析(NTA)，显示IEVs颗粒直径分布；图4F 为纳米流式检测技术对IEVs进行单囊泡水平的粒径检测，显示IEVs的颗粒直径分布。
图5A-图5K为流式细胞技术IEVs的表面膜蛋白进行分析结果。
图6A-图6D为IEVs的内容物分析：图6A为DIA定量技术对MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs 蛋白组学定量分析结果；图6B为筛选IEVs特异性高表达的蛋白绘制的热图；图6C为差异蛋白的GO富 集分析IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrinalpha 5和Syntaxin 4分子的结果；图6D 为western blot验证MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs表达Annexin V,Flotillin-1，Cadherin 11， Integrin alpha 5和Syntaxin 4的结果。
图7为IEVs在血友病A小鼠的体内促凝作用。
图8A-图8D为给血友病A小鼠注射IEVs之后各种凝血因子水平的变化情况：图8A为凝血因子VIII 的变化情况；图8B为vWF因子的变化情况；图8C为组织因子(TF)的变化情况；图8D为凝血酶原的 变化情况。
图9A-图9B为血友病A小鼠模型中，IEVs分别进行PS和TF的封闭之后对IEVs的体内治疗效果的 影响情况。
图10为对lpr小鼠进行IEVs注射治疗后能够显著改善lpr小鼠的出血倾向。
图11为对CHS小鼠进行IEVs注射治疗后显著改善CHS小鼠的出血倾向。
图12为同种MSC来源的IEVs和Exosomes对血友病A小鼠治疗效果对比。
注：其中WT为野生型小鼠；HA组为血友病A小鼠模型；HA+IEVs为血友病A小鼠模型给予IEVs 治疗；HA+PS-IEVs为血友病A小鼠模型给予PS阴性IEVs；HA+TF-IEVs为血友病A小鼠模型给予TF 阴性IEVs；HA+Exosomes为血友病A小鼠模型给予Exosomes治疗；lpr+IEVs组为lpr小鼠模型给予 IEVs治疗；lpr为lpr小鼠模型组；CHS+IEVs组为CHS小鼠模型给予IEVs治疗；CHS为CHS小鼠模型 组。
图13A-13C显示IEVs可经皮肤和毛发排出：图13A为IEVs在皮肤表面的动态代谢示意图。图13B 显示随着时间推移，IEVs逐渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。图13C显示第7天时在小鼠体表拔下的 毛发中发现毛囊中存在PKH26-IEVs。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限 制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的IEVs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡 (Induced extracellular vesicles,IEVs)。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常 存活时，被干预或诱导，使其凋亡产生的一类亚细胞产物。通常这一类亚细胞产物，具有膜结构，表达 凋亡性标志物，部分包含有遗传物质DNA。发明人发现诱导性细胞外囊泡是区分于细胞和常规细胞外囊 泡(如外泌体等)的一类物质。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、 非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出 现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80- 100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所 述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正 常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
本发明中的“IEVs”同“IEV”。本发明中的STS为星形孢菌素。本发明中Exosomes指的是外泌体。
“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用 于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要 素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新 颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些 过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
如本文所用，术语“高表达”等旨在包括将核酸或蛋白质的表达增加至高于现有技术囊泡(例如外泌 体)所含有的水平。
本发明中，相应的试剂来源如下：青霉素/链霉素溶液(BIOSOURCE；P303-100)；谷氨酰胺 (BIOSOURCE；P300-100)；地塞米松磷酸钠(Sigma；D-8893)；α-MEM(Gibco；12571-063)2-ME(GIBCO； 21985-023)。
实施例1 MSCs的分离培养
依据动物伦理委员会的指导用过量CO2处死小鼠，在无菌条件下，取下胫骨和股骨，剥净附着在其 上的肌肉和结缔组织，进一步分离干骺端、暴露骨髓腔，用10mL无菌注射器抽取喊体积分数为10％胎 牛血清的PBS反复冲洗骨髓腔，70μm孔径细胞滤网过滤后，500g离心5min，去除上清液后收集底部 的细胞沉淀，PBS重悬，再次500g离心5min，收集最终的细胞沉淀。而后对细胞进行流式分选，以 CD34-和CD90+为分选标准，分选出BMMSCs。最后以Dex(-)培养液重悬细胞并接种于10cm直径细胞 培养皿，37℃、5％CO2培养。24h后，吸除上清液未贴壁细胞，PBS清洗后，加入Dex(-)培养液继续培 养。1周后加入等量Dex(+)培养液，再1周后可见密集的原代BMMSCs集落。采用胰蛋白酶37℃孵育消 化BMMSCs并传代扩增，之后每3日换Dex(+)培养液，长满后传代。使用P2代BMMSCs进行后续实 验。
其中，Dex(-)培养液成分如表1所示，Dex(+)培养液成分如表2所示：
表1 Dex(-)培养液成分表
Figure BDA0002907534020000051
表2 Dex(+)培养液配方表
Figure BDA0002907534020000052
采用流式细胞术分析表面标志物的方法来评估分离的BMMSCs的纯度。对于表面标志鉴定，胰蛋白 酶消化收集P2代BMMSCs后，PBS清洗1次，以5×105/mL密度重悬细胞于含3％FBS的PBS中，加入 1μL PE荧光偶联的CD29、CD44、CD90、CD45和CD34抗体，空白组不加。4℃避光孵育30min，PBS 清洗2遍后，上机检测。流式检测结果如图1A-1E所示，可知，分离的细胞为BMMSCs(骨髓间充质干 细胞)。
实施例2诱导性囊泡的获得
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs)，用实施例1中的培养基(Dex(+)培养液) 继续培养至细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入含500nM STS的无血清培养基(α-MEM培养 基)诱导凋亡，37℃孵育24h，收集细胞上清液，用于分离和提取IEVs。
从收集的培养基上清中进行IEVs的分离与提取，操作流程如图2所示，具体步骤包括：800g离心 10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心30分钟—移除上清液，无菌PBS 重悬IEVs—16000g离心30分钟—移除上清液，300-500ul无菌PBS重悬IEVs。
对比例1同种MSC来源的外泌体分离和提取
将实施例1中培养至第2代的MSCs(骨髓来源的MSCs)，用实施例1中的培养基继续培养至细胞汇 合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入无血清培养基，37℃孵育48h，收集细胞上清液，用于分离和提 取Exosomes。
提取步骤包括：800g离心10分钟—收集上清液—2000g离心10分钟—收集上清液—16000g离心 30分钟—收集上清液—120000g离心90分钟—移除上清液，无菌PBS重悬沉淀—120000g再次离心90 分钟，移除上清，收集底部的Exosomes，无菌PBS重悬。
实施例3 IEVs的分析
(1)IEVs的定量和膜蛋白的分析
利用流式细胞技术对实施例2获得的IEVs进行定量分析，测量时间点为第1h、第4h、第8h、第 16h和第24h，结果显示106个MSCs在诱导至第1h、第4h、第8h、第16h和第24h后分别可以产出 0.76×108个、1.29×108个、1.95×108个、2.48×108个、3.14×108个IEVs，从中可以看出，诱导至24h后， 单个MSC可以产出300个IEVs(图3)。
此外，流式检测发现IEVs的颗粒直径分布都集中在1μm以下，占94.97％(图4A)。
侧向散射光(SSC)分析结果同样显示IEVs散射光强集中在1μm以下范围(图4B)。
进一步的，通过Bangs Laboratories公司生产的标准化小颗粒微球(0.2μm，0.5μm，1μm)分析 IEVs的散射光强，结果显示IEVs的颗粒直径都在0.2μm以下(图4C)。
透射电镜(TEM)观察的结果与流式检测结果相似，大部分囊泡的直径都在200nm及200nm以下 (图4D)。
纳米粒子跟踪分析(NTA)结果与透射电镜观察结果相符，IEVs颗粒直径平均为169nm(图4E)。
利用最先进的纳米流式检测技术进行单囊泡水平的粒径检测，结果也显示IEVs的平均颗粒直径在 100.63nm(图4F)。
利用流式细胞技术对实施例3提取的IEVs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，MSCs来源的IEVs能 够表达和MSCs相似的表面蛋白，即CD29，CD44，CD73，CD166阳性，CD34，CD45阴性。同时， IEVs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白CD9,CD63,CD81和C1q(如图5A-5K)。
(2)IEVs的内容物分析
利用蛋白DIA定量技术完成MSCs，MSCs-Exosomes(对比例1提取的)，MSCs-IEVs(实施例2获 得的)的蛋白组学定量分析。结果显示，MSCs-Exosomes和MSCs-IEVs的蛋白内容物表达与母细胞具有 较高的重叠性，170种蛋白在IEVs中特异性高表达(图6A)。通过生物信息学分析，筛选IEVs特异性高 表达的蛋白，绘制热图(图6B)，进一步结合差异蛋白的GO富集分析结果，明确IEVs能特异性高表达 Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrinalpha 5和Syntaxin 4分子(图6C)。与同种MSCs来源的 Exosomes相比，IEVs的5种特征性分子的表达量均显著上调，具体为：IEVs中的标志物Annexin V、 Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5和Syntaxin 4相对于Exosomes中相应标记物的表达量分别为1.76 倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。最后利用western blot技术再次进行验证，结果与DIA定量分 析结果相符(图6D)。
MSCs-Exosomes：指的是来源于MSCs的外泌体。
MSCs-IEVs：指的是来源于MSCs的IEVs。
其中所述的内容物分析中的MSCs和与提取Exosomes和IEVs的MSCs为同一细胞株。
(3)IEVs治疗血友病小鼠的应用
利用体外凝血实验检测实施例2获得的IEVs和对比例1提取Exosomes的体外促凝效果。结果如表1 显示，IEVs能显著缩短大部分血浆的体外凝固时间，促凝效果好于Exosomes。但对于因子II，V，X缺 乏的血浆，IEVs无法发挥体外促凝作用，说明IEVs的体外促凝作用更多集中于凝血共同途径的上游。
表1
Figure BDA0002907534020000071
利用血友病A小鼠(凝血因子VIII缺乏)为模型，通过尾静脉注射9×108个IEVs，观察IEVs的体 内促凝作用。结果如图7显示，IEVs治疗后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳 定地维持14天。
实验结果表明，IEVs能够在体外发挥显著的促凝作用。且体内注射后能够显著改善出血倾向，可用 于改善血友病A导致的出血倾向。同时检测小鼠血浆中各种凝血因子的水平，发现凝血因子VIII、vWF 因子、组织因子(tissue factor，TF)和凝血酶原(prothrombin)均没有发生显著变化(图8A，图8B， 图8C，图8D)。
在血友病A小鼠模型中，分别注射正常IEVs，PS阴性IEVs和TF阴性IEVs，7天后进行剪尾实 验，结果如图9A和图9B显示，PS和TF的封闭并没有影响IEVs的体内治疗效果，初步说明IEVs治疗 血友病小鼠的机制与PS和TF无关。以往文献报道中，细胞外囊泡发挥促凝作用都高度依赖于其表面的 PS和TF，而IEVs的体内实验结果与以往研究不一致，这提示在体内环境下，IEVs可能有新的作用机制 发挥促凝作用。
(4)IEVs治疗狼疮性出血小鼠的应用
在临床上，系统性红斑狼疮(SLE)的病人往往存在出血倾向，目前具体机制不明，现有的文献报道 多认为是与SLE伴发的血小板减少等因素有关。在治疗措施上，多采用输血或输血小板的方法，效果不 甚理想。
本发明对lpr小鼠进行IEVs(实施例2提取的)注射，7天后进行剪尾实验。结果显示，IEVs治疗后 能够显著改善lpr小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持7天(图10)。其中lpr小鼠是SLE的 代表性动物模型。
实验结果表明，IEVs可以用于改善红斑狼疮性出血倾向。
(5)IEVs治疗契-东综合征小鼠的应用
契-东综合征(CHS syndrome)是常染色体隐性遗传性疾病，多见于近亲结婚的后代。致病基因为溶 酶体运输调节因子基因(LYST)。LYST基因的突变常导致异常LYST蛋白的生成，进而引起血小板功能 障碍。患者在临床上会表现为明显的出血倾向，目前没有有效的预防和治疗措施。
本发明对CHS小鼠进行IEVs(实施例2获得的)注射，10天后进行剪尾实验。结果显示，IEVs治 疗后能够显著改善CHS小鼠的出血倾向，治疗作用可以持续稳定地维持10天(图11)。
实验结果表明，IEVs可用于改善契-东综合征小鼠的出血倾向。
对比例2
对血友病A小鼠模型，分别进行同种MSC来源的IEVs(实施例2获得的)和Exosomes(对比例1 提取的)的注射治疗(9×108个)，结果显示，IEVs能够显著纠正小鼠的出血倾向，而Exosomes没有明 显的治疗效果(图12)。
实施例4 IEVs可经皮肤和毛发排出
取4×106的实施例2制备的IEVs用DIR标记，200微升PBS重悬，通过尾静脉系统性注射于裸鼠 BALB/c-nu/nu体内，观察1，3，7天后用活体成像仪器检测IEVs在皮肤表面的分布，结果如图13A-13C 所示。
图13A显示IEVs可到达皮肤表面，在第3天时数量最多，第7天基本消失，显示IEVs在皮肤表面 的动态代谢过程(图13A)。免疫荧光结果显示PKH26-IEV系统性注射C57小鼠后，随着时间推移，逐 渐从皮下组织向真皮层和表皮移动。第7天在皮肤表面角质层观测到IEVs大量存在，提示系统性注射的 IEVs可以随着皮肤角质层的脱落而排泄出去(图13B)。同时，第7天时在小鼠体表拔下的毛发中发现毛 囊中存在PKH26-IEV，说明系统性注射的IEVs还可随着毛发的脱落而代谢出去(图13C)。
本实施例表明IEVs可以通过皮肤和毛发排出，说明注射或增加IEVs在体内的含量具有安全性。

Claims (10)

1.囊泡在制备治疗出血性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述囊泡是诱导性囊泡。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡；
优选地，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞来源于哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物选自人或鼠；
优选地，所述干细胞为间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞来源包括：骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或其组合；
更为优选地，所述间充质干细胞来源选自骨髓、脂肪、脐带和口腔中的一种或多种；
最为优选地，所述间充质干细胞来源于骨髓。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述星形孢菌素的浓度为1-10000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为100-10000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-10000nM；
所述星形孢菌素的浓度为500-1000nM；
优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-900nM；
进一步优选地，所述星形孢菌素的浓度为500-800nM。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡具有标志物Syntaxin 4；
优选地，所述诱导性囊泡高表达标志物Syntaxin 4；
进一步优选地，所述诱导性囊泡对标志物Syntaxin 4的表达高于MSC或外泌体；
进一步优选地，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3-6倍；
更为优选地，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的3.5-5倍；
更进一步优选地，所述标志物Syntaxin 4的表达量为来源于间充质干细胞的外泌体中Syntaxin 4的表达量的4.45倍。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物还包括Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物为Syntaxin 4、Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11和Integrin alpha 5的组合。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述诱导性囊泡高表达标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5；
优选地，所述诱导性囊泡对标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrinalpha 5的表达量高于MSC或外泌体；
或优选地，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍和3-4倍；
更为优选地，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍和3.5-4倍；
更进一步优选地，所述诱导性囊泡中的标志物Annexin V、Flotillin-1、Cadherin 11、Integrin alpha 5相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68 倍；
或优选地，所述诱导性囊泡还表达CD29、CD44、CD73、CD166；且不表达CD34、CD45；
或优选地，所述诱导性囊泡还表达CD9、CD63、CD81和C1q中的一个或多个。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述囊泡的直径为0.03-10μM；
优选地，所述诱导性囊泡的直径为0.03-6μM；
进一步优选地，所述诱导性囊泡的直径为0.03-4.5μM。
10.如权利要求1-9任一所述的应用，其特征在于，所述出血性疾病包括凝血因子匮乏、血小板数量减少和/或功能缺陷导致的出血；
优选地，所述出血性疾病包括血友病、狼疮性出血或契-东综合征；；
更为优选地，所述血友病包括血友病A、血友病B或血友病C；
更进一步优选地，所述血友病为血友病A。
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