JP2003513648A

JP2003513648A - ヒト骨髄ストローマ細胞の単離および拡張

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Publication number: JP2003513648A
Application number: JP2001536164A
Authority: JP
Inventors: プロコプ，ダーウイン・ジエイ; コルター，デイビツド; デイジロラモ，カーラ
Original assignee: フイラデルフイア・ヘルス・アンド・エデユケーシヨン・コーポレーシヨン
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2003-04-15
Also published as: WO2001034167A1; EP1227825A4; HK1048596A1; CA2389488A1; US7374937B1; AU2617201A; AU781449B2; EP1227825A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、例えば遺伝子治療および移植の方法での使用のためのヒト骨髄ストローマ細胞の増殖を誘導するおよび高めるインビトロの方法を包含する。本発明はまた、ヒト骨髄ストローマ細胞の拡張可能性（すなわち増殖能力）の評価方法も包含する。加えて、本発明はヒト骨髄ストローマ細胞の増殖を高めるための馴化培地を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

成体動物中の大部分の細胞は終末的に分化しており、それらが異なる型の細胞
に通常はなることができないことを意味する。しかしながら、ある種の細胞（「
多能性」細胞）は、成体組織中でさえ、分化する（すなわちいくつかの型の１つ
の細胞になる）能力を保持する。

【０００２】骨髄は、非造血細胞（例えばＭＳＣ）、および多様な造血細胞になるよう分化
することができる幹細胞の前駆体を包含する、多様な型の多能性細胞を含有する
（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９７６、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍ
ａｔｏｌｏｇｙ４：２６７−２７４；Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａら、
１９８０、Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；ＭｅｔｓとＶｅｒｄｏｎｋ、１
９８１、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ．Ｄｅｖ．１６：８１−８９；Ｐｉｅｒｓｍａら
、１９８５、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ１３：２３７
−２４３；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９８７、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓ
ｓｕｅＫｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６３−２７２；Ｃａｐｌａｎ、１９９１、
Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４）。非造血細胞および組織の前駆体である骨
髄細胞は、それらが容易に培養皿に接着しかつ線維芽細胞様のコロニーを形成す
るために「プラスチック接着性細胞」もしくは「コロニー形成単位線維芽細胞」
と呼称されている（Ｐｉｅｒｓｍａら、１９８５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１
３：２３７−２４３；ＯｗｅｎとＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、Ｃｅｌ
ｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔ
ｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ中、ｐｐ．４２−６０、チバ財団シンポジウム（
ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ）、英国チチェスター）
。ＭＳＣは、多様な非造血細胞に分化するそれらの能力のために、なお他者（Ｃ
ａｐｌａｎ、１９９１、Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０）により
間葉性幹細胞もしくは間葉性前駆細胞と呼称される。加えて、これらの細胞は、
それらが骨髄で見出される支持構造から生じるようであるため、また、それらが
培養物中での造血幹細胞の成長のための供給体（ｆｅｅｄｅｒ）層として作用す
る可能性があるため、ＭＳＣと呼称されてきた（Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４；Ａｎｋｌｅｓａｒｉａ、１９８７、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７６８１−７６８５）。ＭＳ
Ｃはまた、造血幹細胞の濃縮された集団の培養物を得るための支持細胞層として
も使用されている（Ｋｉｅｆｅｒ、１９９１、Ｂｌｏｏｄ７８：２５７７−２
５８２）。

【０００３】ＭＳＣは最近、それらが非造血組織を再生息させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）
ことができる循環する前駆細胞を提供するようであるため（Ｐｅｒｅｉｒａら、
１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１４２−
１１４７；Ｆｅｒｒａｒｉら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：１４５６、
１５２８−１５３０）、ならびにそれらが細胞および遺伝子治療の有効なベヒク
ルとして潜在的にはたらく可能性があるため（Ｃａｐｌａｎ、１９９１、Ｊ．Ｏ
ｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２７６：７１−７４）、新たな興味を引きつけている。

【０００４】ＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎらによるＭＳＣの原著（１９７６、Ｅｘｐ．Ｈｅｍ
ａｏｌ．４：２６７−２７４）は徹底的に反復されており、そして他の研究者ら
（Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ５６：２８９
−３０１；ＭｅｔｓとＶｅｒｄｏｎｋ、１９８１、Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅ
ｖ．１６：８１−８９；Ｐｉｅｒｓｍａら、１９８５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ
．１３：２３７−２４３；Ｈｏｗｌｅｔｔら、１９８６、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ
．ａｎｄＲｅｌａｔｅｄＲｅｓ．２１３：２５１−２６３；Ａｎｋｌｅｓａ
ｒｉａら、１９８７、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５：６３６−６４４；Ｏｗｅ
ｎとＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅ
ｓ中、ｐｐ．４２−６０、チバ財団シンポジウム（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉ
ｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ）、英国チチェスター；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９
９２、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１０２：３４１−３５１；Ｃｈｅｎｇら、１９９
４、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３４：２７７−２８６；Ｒｉｃｋａｒｄら
、１９９４、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６１：２１８−２２８；ＣｌａｒｋとＫｅａ
ｔｉｎｇ、１９９５、Ａｎｎ．ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：
７０−７８）により拡大されてきた。それらの研究者らの結果は、組織培養のガ
ラスおよびプラスチック表面への接着により単離されるＭＳＣは、それらが骨芽
細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化することができるために多能性であること
を確立する。その後、この様式で単離されたＭＳＣが筋芽細胞および筋管に分化
することが立証された（Ｗａｋｉｔａｎｉら、１９９４、Ｍｕｓｃｌｅａｎｄ
Ｎｅｒｖｅ１８：１４１７−１４２６；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２７６：７１−７４）。

【０００５】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら（１９８７、ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅ
Ｋｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６４−２７２）は、ウサギから得られたＭＳＣを、
培養物中で２０ないし３０回の倍加を達成するように増幅することができること
、および、こうした細胞は、拡散チャンバー中での埋植後にインビボで骨を合成
することができたことを立証した。より最近、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら（１９９７
、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１２：１３３５−１３４７）は、ヒトド
ナーから得られた単一コロニー由来のＭＳＣの約６０％が、ヒドロキシアパタイ
トおよびリン酸三カルシウムセラミックマトリックスを含有する埋植ベヒクルを
使用して免疫不全マウスに埋植される場合に骨を形成することを立証した。Ｂｒ
ｕｄｅｒら（１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２７８−２９４
）は、骨髄吸引物由来のヒトＭＳＣが培養物中で３８±４回の倍加を受けるよう
誘導することができたこと、および、ＭＳＣがこうした倍加の後にインビトロで
骨芽細胞に分化することが可能であったことを報告した。

【０００６】ストローマ細胞は、インビボで骨髄内の微小環境に強く影響すると考えられて
いる。単離される場合、ＭＳＣは当初静止状態であるが、しかしついには分裂を
開始する。従って、ＭＳＣはインビトロで培養することができる。ＭＳＣは、適
切な条件下で培養物中で維持される場合に、線維芽細胞、脂肪細胞および骨形成
原細胞のコロニーを生じさせるのに使用されている。ＭＳＣはまた、軟骨細胞お
よび筋芽細胞に分化するようにすることもできる。プラスチックもしくはガラス
接着性のＭＳＣをヒドロコルチゾンもしくは他の選択条件の存在下で培養する場
合、造血前駆細胞もしくは骨形成原細胞について濃縮された細胞集団を得ること
ができる（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２、Ｂｌｏｏｄ７９：３５６−３６４およ
びＢｉｅｎｚｌｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳ
Ａ、９１：３５０−３５４）。

【０００７】細胞培養物中で多様な系統の細胞に分化するＭＳＣの潜在能力が記述されてい
る（例えば、Ｒｉｃｋａｒｄら、１９９６、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ
．１１：３１２−３２４；Ｓｔａｎｆｏｒｄら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７０：９４２０−９４２８；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら、１９９７、Ｊ．Ｂ
ｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１２：１３３５−１３４７；Ｋｅｌｌｙら、１９
９８、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３９：２６２２−２６２８；Ｌｅｃｋａ
−Ｃｚｅｒｎｉｋら、１９９９、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．７４：３５７
−３７１；Ｕｚａｗａら、１９９９、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４
：１２７２−１２８０）。他者もまた、ＭＳＣおよび骨髄から得られた関係する
細胞の、インビボで多細胞系統に分化する潜在能力を記述している。致死的に照
射されたマウスへのＭＳＣの注入は、骨、軟骨および肺組織を包含する多様な組
織中でＭＳＣの子孫のマウスでの出現をもたらした（Ｐｅｒｅｉｒａら、１９９
８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１４２−１１４
７）。子孫のＭＳＣは、骨（通常はタイプＩコラーゲンを含有する組織）中でマ
ーカーのタイプＩプロコラーゲン遺伝子を発現したが、しかし、コラーゲン（通
常はタイプＩコラーゲンを含有しない組織）中で同一遺伝子を発現しなかった。
照射された雌性マウスへの雄性ＭＳＣの注入は、多数の異なる組織由来の線維芽
細胞の一次培養物中でのＹ染色体を含有する細胞の存在につながった。Ｎｉｌｓ
ｓｏｎら（１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７２９−７３４）は、多数
のＭＳＣが注入されたがしかし骨髄除去を受けなかったマウスにおいて、ドナー
の印をつけられた細胞の骨芽細胞および骨細胞としての存在を立証した。Ｈｏｕ
ら（１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ９６：７２９
４−７２９９）は、致死的に照射されたマウスの骨において、ドナーのＭＳＣを
骨芽細胞および骨細胞として検出した。それらのＭＳＣでは、マーカーのＣＡＴ
遺伝子の発現がオステオカルシンプロモーターにより駆動された。

【０００８】筋へのＭＳＣもしくは関係する骨髄由来細胞の外植が報告されている。Ｆｅｒ
ｒａｒｉら（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：１４５６、１５２８−１５３
０）は、局所注入もしくは全身注入のいずれか後の筋へのドナーＭＳＣの外植を
報告した。Ｇｕｓｓｏｎｉら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ４０１：３９０−３９
３）は、「副集団（ｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）」（ＳＰ）細胞と定義さ
れる稀な骨髄細胞の筋中への取込みを検査した。ＳＰ細胞は、元は、大きさが小
さく、かつ、それらが大量の多剤耐性タンパク質を含有するため一連の標識色素
を迅速に分泌する稀な細胞として、Ｇｏｏｄｅｌｌら（１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅ
ｄ．１２：１３３７−１３４５）により骨髄中で同定された。ＳＰ細胞はＣＤ３
４陰性であるが、しかし、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞および他の造血細胞の前駆
細胞である。Ｇｕｓｓｏｎｉらは、ジストロフィン遺伝子中に突然変異を有する
致死的に照射されたｍｄｘマウスに少数のＳＰ細胞を注入した。これらの研究者
らは、ｍｄｘマウス中の筋線維の約４％がドナー細胞由来のジストロフィンを含
有したことを観察した。加えて、筋のＳＰ細胞をｍｄｘマウスの骨格筋から単離
することができ、そしてこれらの細胞を、骨髄を再生息させかつ骨髄除去からマ
ウスを救済するのに使用することができた。

【０００９】これらおよび他の報告は、骨髄除去されたマウスへのＭＳＣの全身投与が、骨
髄、肺、肝、骨、軟骨および筋組織におけるＭＳＣの子孫の出現につながること
を立証する。これらの結果は、ＭＳＣが多様な系統の細胞に分化することができ
、そして従ってＭＳＣの全身もしくは局所投与により多様な型の組織を補完する
のに使用することができることを示す。従って、ＭＳＣ（すなわち、ドナーから
得られた、もしくはＭＳＣの患者自身の補足物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から拡
張されたＭＳＣ）は、病気の組織を置き換えるもしくは補完することにより、少
なくとも骨髄、肺、肝、骨、軟骨および筋組織の疾患を治療するのに使用するこ
とができる。さらに、組換え的に構築されたＭＳＣ（すなわち、外因性遺伝子も
しくは正常な遺伝子をもつ）を使用して、これらの組織のいずれかに遺伝子産物
を送達させる（例えばジストロフィンを筋組織に送達させる）ことができる。

【００１０】中枢神経系中に外植するＭＳＣおよび関係する骨髄由来細胞の潜在能力が記述
されている。Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ９４：４０８０−４０８５）は、レシピエントの免疫不全マウス
への全骨髄の注入後のドナー由来の星状細胞の存在を記述する。骨髄由来細胞を
使用して中枢神経系の障害を治療する以前の試みの重大な欠点は、神経系組織に
注入された細胞が注入後に適切に挙動しなかったこと、および注入のための細胞
を得ることが困難であったことを包含する。

【００１１】Ａｚｉｚｉら（１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：３９０８−３９１３）は、成体ラットの基底核に注入されたラットもしく
はヒトのいずれかのＭＳＣが、ニューロン幹細胞の特性の多くを有する傍室星状
細胞に類似の様式で組み込みかつ移動したことを報告した。Ｋｏｐｅｎら（１９
９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１０７１１−１
０７１６）は、新生マウスの傍室領域に注入されたマウスＭＳＣが、ニューロン
幹細胞に類似の様式で組み込みかつ移動したことを立証した。該細胞は、マウス
脳が拡大した際に数が増大したようであった。細胞の若干は星状細胞に分化した
。他の細胞は、多数がニューロン豊富な領域に出現し、そしてニューロンに分化
していたかもしれない。中枢神経系の障害の治療へのＭＳＣの使用は、ＰＣＴ特
許出願公開第ＷＯ９９／４３２８６号明細書にもまた記述されている。骨髄と
中枢神経系組織との間の細胞の相互転換可能性の潜在能力は、ニューロン幹細胞
が骨髄除去を受けたマウスにおいて造血系を再構成することができることが立証
された最近の報告によってもまた強調された（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、１９９９、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２８３：５３４−５３７）。

【００１２】ＭＳＣおよび関係する細胞の投与を必要とする臨床試験が実施されている。例
えば、重症の骨形成不全（タイプＩＩＩ）に悩まされる小児が骨髄除去を受け、
次いでＨＬＡ適合性の兄弟もしくは姉妹からの同種骨髄を移植される試験が開始
された（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：３０９−３１３；
Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９９９、“Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄ
ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−
ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｃｅｌｌｓｉｎｃｈｉｌｄｒｅ
ｎｗｉｔｈｓｅｖｅｒｅｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓｉｍｐｅｒｆｅｃｔ
ａ，”第７回国際骨形成不全会議（７ｔｈＩｎｔｌ．Ｍｅｅｔｉｎｇｏｎ
ＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓＩｍｐｅｒｆｅｃｔａ）（モントリオール）の要旨
）。この試験では、全骨髄が、レシピエントの骨芽細胞を置き換えそしてそれに
より重症の形態の骨形成不全をより軽度の形態の該疾患に変換することができる
、有意の数のＭＳＣおよび関係する骨芽細胞前駆体を含有するかもしれないと仮
定した。該試験の５例の小児が、例えば減少された骨折率および増大された全身
ミネラル含量により評価されるような有意の改善を表した。しかしながら、ドナ
ー細胞は、骨髄生検を得た４例の患者のうち３例で骨芽細胞の１．３ないし２％
のみの原因であった。従って、これらの結果は多様な方法に解釈することができ
る。例えば、全骨髄移植は少数の骨芽細胞の後期前駆細胞のみを含有し、そして
これらの細胞はこれらの患者の骨の状態の一時的改善のみを提供するのかもしれ
ない。他の可能性は、骨髄移植片組織が一般に小児のオステオペニアにつながっ
たとしても、骨髄除去単独は不確定の利益を生じさせたということである（例え
ば、Ｂｈａｔｉａら、１９９８ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎ
ｔａｔｉｏｎ２２：８７−９０）。

【００１３】別の臨床試験において、Ｗｈｉｔｅら（１９９９、“Ｍａｒｒｏｗｃｅｌｌ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｆｏｒｉｎｆａｎｔｉｌｅｈｙｐｏｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｉａ，” 第７回国際骨形成不全会議（７ｔｈＩｎｔｌ．
ＭｅｅｔｉｎｇｏｎＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓＩｍｐｅｒｆｅｃｔａ）（
１９９９）の要旨）は、乳児低ホスファターゼ症（骨芽細胞に存在するアルカリ
ホスファターゼの遺伝的欠損症）に悩まされる８ヶ月齢の小児を治療した。該小
児は骨髄除去を受け、そしてその後ＨＬＡ適合性の姉妹から骨髄移植片を受領し
た。移植後１００日に、該小児は彼女の悪化する骨格疾患の顕著な反転および他
の改善を立証した。しかしながら、有益な影響は６ヶ月後にもはや存在しなかっ
た。該小児はその後、ＭＳＣを用いるＴ細胞を枯渇されない増強（ｂｏｏｓｔ）
を与えられ、それは彼女の姉妹から拡張されかつさらなる骨髄除去を伴わずに投
与された。追加抗原量後９ヶ月のレントゲン写真は有意の改善を示し、それは持
続するようであった。

【００１４】ＭＳＣの生物学の検査への大きな興味、および治療へのそれらの潜在的な使用
にもかかわらず、培養物中のＭＳＣを単離しかつ拡張するための一般に受容され
るプロトコルが未だ存在しない。ＭＳＣの分化に関する大部分の実験は、記述さ
れる（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９７６、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４：
２６７−２７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９８７、ＣｅｌｌＴｉｓｓ
ｕｅＫｉｎｅｔ．２０：２６３−２７２）とおり、組織培養皿へのＭＳＣのし
っかりとした接着によって主として単離されたＭＳＣの培養物を使用して実施さ
れている。他者はより均質なＭＳＣ集団を調製することを試みている（例えば、
Ｌｏｎｇら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：８８１−８８７；
Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９１、Ｂｌｏｏｄ７８、５５−６２；Ｗａｌｌｅｒら
、１９９５、Ｂｌｏｏｄ８５：２４２２−２４３５；Ｒｉｃｋａｒｄら、１９
９６、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１：３１２−３２４；Ｊｏｙｎｅ
ｒら、１９９７、Ｂｏｎｅ２１：１−６）。しかしながら、これらのプロトコ
ルのいずれも広範な容認を獲得していない。加えて、これらのプロトコルは主と
して骨芽細胞前駆体を単離するよう設計された。これらのプロトコルの使用は、
真に多能性である細胞をそれらが生じさせるかどうか決定するために検討されて
いない。

【００１５】最近、ＭＳＣを単離するためのＳｔｒｏ−１抗体の使用への興味が新たにされ
ている（例えば、Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、１９９６、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａ
ｐｙ５：１５−２３；Ｂｙｅｒｓら、１９９９、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８７：
３７４−３８１；Ｓｔｅａｒｔら、１９９９、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅ
ｓ．１４：１３４５−１３５６）。しかしながら、Ｓｔｒｏ−１は主としてＭＳ
Ｃの培養物中の大型の細胞および顆粒細胞を染色するかもしれない。従って、こ
の抗体は、主として、骨芽細胞の系統に拘束される細胞のみを同定もしくは単離
するために有用であるかもしれない。

【００１６】文献のこの総説は、ＭＳＣの移植が重要な治療的および遺伝子移入の用途を有
することを立証する。しかしながら、ＭＳＣを単離およびそれらの増殖を誘導す
るための従来技術の方法は、従来技術の方法を使用して達成することができる集
団の拡張の程度を包含する実務上の限界を有する。それらが増殖する際にＭＳＣ
の分化を誘導することを伴わない培養物中でのＭＳＣの有意の増殖の確実な誘導
方法に対する決定的な必要性が残存する。本発明はこの必要性を満足する。

【００１７】（発明の要約）本発明は、インビトロでの単離されたヒト骨髄ストローマ細胞の増殖の誘導方
法に関する。該方法は、単離された細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメ
ートルあたり約５０、２５、１２、１０もしくは６個未満の細胞であるような成
長表面に、単離された細胞および成長培地を提供すること、ならびに、成長を促
進する条件下で該表面をインキュベートすることを含んで成る。初期細胞密度は
、成長表面の１平方センチメートルあたり最低約０．５もしくは３個の細胞であ
るべきである。例えば、初期密度は成長表面の１平方センチメートルあたり約３
もしくは１．５個の細胞であることができる。細胞は、例えば約１０もしくは１
４日を越えないインキュベーション後に成長表面から収穫することができる。

【００１８】細胞を収穫した後に、それらの細胞および成長培地ならびに、収穫された細胞
の初期密度が第二の成長表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞
であるような第二の成長表面に提供する。第二の成長表面を、細胞が増殖するよ
うに、成長を促進する条件下でインキュベートする。それらの細胞を、約１４日
を越えないインキュベーション後に第二の成長表面から収穫することができ、そ
してその後、成長培地と一緒に、第二の成長表面から収穫された細胞の初期密度
が第三の成長表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞であるよう
な第三の成長表面に提供することができる。第三の成長表面を、成長を促進する
条件下でインキュベートすることができ、その結果細胞が増殖する。もちろん、
さらなる回の収穫および拡張を実施することができる。

【００１９】それとともに細胞が収穫される成長培地は、ウシ胎児血清のような哺乳動物血
清を含むことができるか、または、成長因子（例えば線維芽細胞増殖因子、血小
板由来増殖因子、インスリン増殖因子もしくは内皮細胞増殖因子）を成長培地に
添加することができる。

【００２０】本発明はまた、成長培地の存在下で表面上で成長する単離されたヒト骨髄スト
ローマ細胞のインビトロ増殖を高める方法にも関する。該方法は、馴化培地中に
存在する因子で成長培地を補充することを含んで成る。馴化培地は、１平方セン
チメートルあたり最低約０．５もしくは１２個の細胞の初期密度で第二の表面上
で成長されかつ最低約３もしくは６日間インキュベートされる産生体（ｐｒｏｄ
ｕｃｅｒ）のヒト骨髄ストローマ細胞の培養物から得られる。成長培地は、成長
培地を馴化培地で補充すること、または、馴化培地を大きさで分画すること、お
よびその後約３０，０００もしくは１０，０００の分子量を有する大きさで分画
された分子を含有する馴化培地の画分で成長培地を補充することにより、因子で
補充することができる。

【００２１】本発明は、さらに、ヒト骨髄ストローマ細胞の増殖を誘導するための馴化培地
に関する。該馴化培地は、表面の１平方センチメートルあたり約１２個未満の細
胞の初期密度で成長培地の存在下に表面上で最低約３日間ヒト骨髄ストローマ細
胞をインキュベートすることにより作成される。成長培地はそれにより馴化培地
に転換される。

【００２２】別の局面において、本発明は、ヒト骨髄ストローマ細胞の増殖の誘導方法に関
する。本方法は、骨髄サンプルから単核細胞を単離すること、単核細胞をインキ
ュベートしてコロニーを生じさせること、個々のコロニーを単離すること、なら
びに成長表面を有する容器中で、単離されたコロニーから得られたヒト骨髄スト
ローマ細胞をインキュベートすることを含んで成る。該容器は、成長培地、およ
び成長表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞の初期密度の細胞
を含有する。これは細胞が増殖することを誘導する。

【００２３】本発明はまた、ヒト骨髄ストローマ細胞のインビトロでの拡張可能性の評価方
法にも関する。該方法は、表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細
胞の初期密度で成長培地の存在下に表面上で細胞を（例えば最低約１０日間）イ
ンキュベートすること、および細胞のコロニー形成効率を評価することを含んで
成る。細胞の拡張可能性は細胞のコロニー形成効率にほぼ比例する。コロニー形
成効率は、既知の拡張可能性を有しかつ同一の様式でインキュベートされるヒト
骨髄ストローマ細胞の別のサンプルのコロニー形成効率と比較することができる
。あるいは、コロニー形成効率は、図２のプロットのようなコロニー形成効率対
拡張可能性の参照プロットと比較することができる。

【００２４】本発明はまた、骨髄ストローマ細胞の精製方法も包含する。該方法は、ストロ
ーマ細胞の集団をリポコルチンＩＩに対する抗体と接触させること、および、ス
トローマ細胞の集団から、該抗体を結合する細胞を単離して、それにより骨髄ス
トローマ細胞を精製すること、を含んで成る。

【００２５】骨髄ストローマ細胞の付加的精製方法もまた包含され、ここで、該方法は、単
離された細胞の初期濃度が成長表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満
の細胞であるような成長表面に、単離された骨髄ストローマ細胞および成長培地
を提供すること、該表面を、成長を促進する条件下でインキュベートすること（
それにより細胞が増殖する）、ストローマ細胞の集団を、リポコルチンＩＩに対
する抗体と接触させること、および、ストローマ細胞の集団から、該抗体を結合
する細胞を単離して、それにより骨髄ストローマ細胞を精製することを含んで成
る。

【００２６】（発明の詳細な記述）本発明は、それらの多能性を保存しつつヒト骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）の
増殖を誘導するもしくは高める方法に関し、およびまたヒトから得られたＭＳＣ
の拡張可能性の評価にも関する。「骨髄ストローマ細胞」、「ＭＳＣ」および「
ストローマ細胞」という用語は本明細書で互換可能に使用する。

【００２７】本発明は、ヒト骨髄ストローマ細胞の拡張可能性（ＭＳＣ；すなわち、それら
自身を複数回複製するＭＳＣの能力）を、従来技術のＭＳＣの培養／拡張方法で
使用される初期細胞密度よりずっとより低い初期細胞密度で、成長表面および成
長培地の存在下でＭＳＣをインキュベートすることにより増大させることができ
るという発見に関する。従来技術の方法において、ＭＳＣは、典型的には１平方
センチメートルあたり約１，０００個以上の細胞の初期細胞密度で培養される。
対照的に、本発明の方法により、ＭＳＣは１平方センチメートルあたり約５０、
２５、１２、１０、６もしくは３個未満の細胞の初期細胞密度で培養される。好
ましくは、初期細胞密度は１平方センチメートルあたり約１．５ないし１２個の
細胞（例えば１平方センチメートルあたり３個の細胞）を包含する。初期細胞密
度は、１平方センチメートルあたり最低約０．５個の細胞であるべきである）。

【００２８】本発明のＭＳＣの培養／拡張方法において、ＭＳＣはそれらの多能性（すなわ
ち、骨芽細胞、脂肪細胞などのような多様な細胞型の１つに分化するそれらの能
力）を保持する。本発明の方法を使用して拡張されたＭＳＣは、従来技術の方法
を使用して拡張もしくは培養されたＭＳＣが保持するよりもより大きな程度まで
（すなわちより大きな比率で）分化するそれらの能力を保持する。

【００２９】幹細胞（ＭＳＣはその１つの型である）は、独特の特性により、多数のヒト疾
患のための細胞治療および遺伝子治療の方法での使用に対する甚だしい潜在能力
を有する。すなわち、幹細胞は、一方の娘細胞が幹細胞のまま留まりかつ他方の
娘細胞がそれが生物体中である機能を実施する１種もしくはそれ以上の分化した
（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）（すなわち分化した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ
ｄ））細胞になるもしくはそれらを生じさせるようにその特徴を変えるような２
個の細胞に分裂することができる。幹細胞の一例は、骨髄で見出される造血幹細
胞（ＨＳＣ）である。各ＨＳＣは、生じる細胞の一方がＨＳＣのまま留まるよう
に分裂することができる。他方の生じる細胞は、血流に進入する赤血球（ＲＢＣ
）、白血球（ＷＢＣ）および血小板の分化した特徴を徐々に獲得する細胞を生じ
させるように分裂し続ける。

【００３０】本発明はＭＳＣに関し、これは幹細胞の特性の多くを有するが、しかし造血細
胞（例えばＲＢＣ、ＷＢＣおよび血小板）を生じさせない。代わりに、ＭＳＣは
、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、肺細胞、または、分化した状況下では中枢神経系
の細胞、もしくは他の型の細胞になる非造血前駆細胞を生じさせる。細胞および
遺伝子治療のためのＭＳＣの重要な一利点は、ＭＳＣのような幹細胞は体内で老
化した細胞を置き換えることができる「幼若細胞」であることである。さらに、
遺伝子欠損が患者のＭＳＣ中で修正される場合、該修正は、患者が生存する限り
、患者への幹細胞の再導入に際して患者中で持続する可能性がある。加えて、Ｍ
ＳＣが最終的に存することができる所望の組織中での発現のために、遺伝子をＭ
ＳＣに送達してよく、それにより細胞が導入される個体中での欠損症を修正する
。

【００３１】本明細書に記述されるＭＳＣの培養／拡張方法は、ヒト疾患の治療への幹細胞
の使用における本質的な問題を解決する。すなわち、本明細書に提供される開示
の前には、大部分の幹細胞は、単離することおよび培養物中で拡張することが困
難であった（すなわち、それらを十分な数に増殖するよう誘導することが困難で
あった）。この理由から、十分な数の多能性細胞が、一般に、治療的用途のため
に得ることができなかった。本明細書に開示される結果は、局所麻酔下で得られ
た少量の骨髄吸引物（例えば２０ミリリットル、もしくは１オンスの約２／３）
で開始すれば、それらのＭＳＣを使用して実施すべき広範な治療および操作を可
能にするのに十分なＭＳＣを成長させかつ単離することができる。

【００３２】従来技術の培養／拡張方法を使用して培養されるＭＳＣを使用して遭遇される
別の困難は、こうした方法を使用して産生されたＭＳＣが低下された分化能力を
保持することである。すなわち、こうした細胞の比較的小さな画分のみが、多様
な細胞型の１つになるよう分化する能力を保持し；多くのもしくは大部分のこう
した細胞は、終末分化されているかもしくは分化経路に沿って進行しており、そ
れによりそれらが分化することができる多様な細胞型の数が制限されたようにな
っている。本発明の培養／拡張方法により産生されたＭＳＣは、従来技術の方法
を使用して産生されたＭＳＣよりも大きな程度まで多様な細胞の１つに分化する
それらの能力を保持する。

【００３３】従来技術の培養条件下では、ＭＳＣを１平方センチメートルあたり約１，００
０から１０，０００個までの細胞の範囲にわたる初期密度でプレート培養し、そ
して、細胞はおよそ１４日の経過にわたって約３倍ないし１０倍だけ数を拡張す
る。本明細書に開示されるデータにより立証されるとおり、本明細書に記述され
る方法により培養されたＭＳＣは、約１０ないし１４日の期間にわたって、約３
００倍ないし２，０００倍だけ数が増大する。本発明の方法で多数の多能性細胞
が得られ、それにより例えば細胞治療もしくは遺伝子治療の目的上十分な細胞を
提供する。

【００３４】本発明はまた、外因性遺伝子を発現するＭＳＣを得るのにも有用であり、その
結果、ＭＳＣを例えば細胞治療もしくは遺伝子治療に使用することができる。す
なわち、本発明は外因性遺伝子を発現する多数の細胞の産生を可能にする。外因
性遺伝子は、例えば、内在性遺伝子の外因性バージョンであることができる（す
なわち、同一遺伝子の野性型のバージョンを使用して、有害な突然変異を含んで
成る欠陥のあるアレルを置き換えることができる）。外因性遺伝子は、通常、し
かし必ずでなく、１種もしくはそれ以上の付加的遺伝子と共有結合される（すな
わち「と融合される」）。例示的な「付加的」遺伝子は、外因性遺伝子を組み込
んだ細胞を選択するための「正の」選択に使用される遺伝子、および、内在性の
遺伝子と同一の染色体の遺伝子座に外因性遺伝子を組み込んだ細胞を選択するた
めの「負の」選択に使用される遺伝子を包含する。

【００３５】本開示は、それらの多能性を保存しつつ培養物中でＭＳＣを迅速かつ広範囲に
拡張することを可能にするため、当業者は、それらの用途が従来技術の方法によ
り培養／拡張されたＭＳＣを使用して以前は実行可能でなかった場合でさえ、遺
伝子工学プロトコルにより生じられたＭＳＣを使用することを可能にされる。

【００３６】当該技術分野で既知の条件下で、ＭＳＣは、選択された型の細胞へのＭＳＣの
分化につながることが既知の培養条件の選択により、脂肪細胞、軟骨細胞、肺細
胞、骨細胞、中枢神経系の細胞、および他の細胞型に分化するよう誘導すること
ができる。例えば、実施例１で本明細書に記述される成長培地のいずれも、骨芽
細胞もしくは脂肪細胞へのＭＳＣの分化を誘導するために使用することができる
。当該技術分野で既知の他の条件を使用して、軟骨細胞もしくは筋細胞に分化す
るようＭＳＣを誘導することができる、（例えば、Ｗａｋｉｔａｎｉら、１９９
５、ＭｕｓｃｌｅａｎｄＮｅｒｖｅ１８：１４１７−１４２６；Ｐｒｏｃ
ｋｏｐ、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔ
ｅｉｎら、１９８７、ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＫｉｎｅｔ．２０：２６３−２
７２；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら、１９９７、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．
１２：１３３５−１３４７；Ｂｒｕｄｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．６４：２７８−２９４；Ｋｅｌｌｙら、１９９８、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ１３９：２６２２−２６２８に記述される方法）。

【００３７】本開示に記述されるとおり培養もしくは拡張されたＭＳＣは、選択された細胞
型への分化の前もしくは後に、ＭＳＣ（すなわち、外因性遺伝子をもつＭＳＣ、
もしくは外因性遺伝子をもたないＭＳＣ）を使用して治療可能であるべき当該技
術分野で既知の多様な障害を治療するのに使用することができる。こうした障害
の例は、骨障害（例えば骨粗鬆症および骨折）、関節の障害（例えば関節炎およ
びリウマチ）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の障害（例えば脳の外傷、ハンチ
ントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄の傷害、卒中、多発性硬化
症、外科的切除および頭部の外傷）を包含する。

【００３８】本発明はまた、少なくともＭＳＣが低細胞密度で成長している場合にそれらに
より産生される１種もしくはそれ以上の成長因子も包含する。これらの成長因子
の１種もしくはそれ以上が、少なくともあるレベルで培養物中にＭＳＣとともに
存在する場合に、ＭＳＣの増殖の速度が増大される。成長因子は、例えば部分的
に精製された形態で、もしくは実質的に精製された形態で馴化培地の一成分とし
て提供されることができる。成長因子の１種もしくはそれ以上はまた、ＭＳＣの
増殖を阻害することもできるか、ＭＳＣの分化も誘導することができるか、もし
くはその双方である。因子の１種もしくはそれ以上が、増殖を増大させることが
できるか、ＭＳＣの分化を阻害することができるか、もしくはその双方である。

【００３９】加えて、実施例８に記述されるデータが立証するとおり、リポコルチンＩＩと
して知られる（アネキシンＩＩとしてもまた知られる）タンパク質が、本明細書
に記述される本発明の方法により拡張された培養物中でのみ見出されている。従
って、本発明は、治療での使用のために培養物中で拡張されたＭＳＣを単離およ
び精製するためのこのタンパク質の使用方法を包含する。定義本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれはこの節でそれに関連し
た意味を有する。

【００４０】冠詞「ａ」および「ａｎ」は、該冠詞の文法上の目的語の１個（種）もしくは
１個（種）以上（すなわち最低１個（種））を指すのに本明細書で使用する。例
として、「１要素（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１種の要素もしくは１種以上
の要素を意味する。

【００４１】「コロニー形成効率」および「ＣＦＵ効率」という用語は、互換性に、サンプ
ル中のＭＳＣの総数のパーセンテージもしくは画分として表現される、培養物中
で別個のコロニーを形成するサンプル中のＭＳＣの能力を意味する。

【００４２】「成長因子」は、培養物中でＭＳＣとともに存在する場合にＭＳＣの増殖の速
度もしくは程度を増大させる物質もしくは化合物である。

【００４３】「成長表面」は、細胞の成長、接着もしくは双方を支持することが可能ないず
れかの支持体である。こうした用語は、プラスチック、ガラス、繊維、膠状物質
などを包含する。

【００４４】培養物中のＭＳＣの「初期密度」および「初期細胞密度」という用語は、互換
性に、成長表面を含んで成る容器にＭＳＣを最初に添加する時点での、その存在
下でＭＳＣが培養される成長表面の単位面積あたりの細胞の数を意味する。

【００４５】「成長培地」は、ＭＳＣの増殖を持続させるのに必要な最小の栄養素を含んで
成る物質の組成物である。

【００４６】ＭＳＣの「拡張可能性」は、増殖する（すなわち数が拡大するかもしくは集団
の倍加を受ける）ＭＳＣの能力を意味する。

【００４７】本明細書で使用されるところの「単離された」という用語により、その天然に
存在する形態でそれに天然に付随する類似の実体（例えば他のタンパク質もしく
は他の細胞）から実質的に分離されている実体（例えばタンパク質もしくは細胞
）を意味する。例えば、単離されたＭＳＣは、それらが通常それとともに（例え
ば骨髄中に）存在する少なくともある種の他の骨髄細胞から分離されているＭＳ
Ｃである。

【００４８】「骨髄ストローマ細胞」（「ＭＳＣ」）は、非造血組織の前駆細胞でありかつ
骨髄から単離することができる幹様細胞である。ＭＳＣは従来技術に記述されて
いる（例えば、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９７６Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．４：２６７−２７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９８７、Ｃｅｌｌ
ＴｉｓｓｕｅＫｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６３−２７２；Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａ
ｌａｓｐｉｎａら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；Ｍｅｔｓら
、１９８１、Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖｅｌｏｐ．１６：８１−８９；Ｐｉ
ｅｒｓｍａら、１９８５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：２３７−２４３；Ｏ
ｗｅｎら、１９８８、ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
ｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ、チバ財団シンポジ
ウム（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ）、英国チチェス
ター、４２−６０；Ｃａｐｌａｎ、１９９１、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒｅｓ．
９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７
１−７４）。

【００４９】「多能性」、「分化可能性」およびその文法的な形態は、多様な細胞型の１つ
になる（すなわちその型の細胞に分化する）ＭＳＣの能力を指す。

【００５０】本明細書で使用されるところの「トランスフェクションされたＭＳＣ」もしく
は「形質導入されたＭＳＣ」は、限定されるものでないが、古典的トランスフェ
クション（リン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥデキストランに媒介されるトラン
スフェクション）、電気穿孔法、微小注入法、リポソームに媒介される移入、化
学物質に媒介される移入、リガンドに媒介される移入、または組換えウイルスベ
クター移入のような細胞に核酸分子を導入するのに使用されるいずれかの技術を
使用して遺伝子構築物が提供されているＭＳＣである。

【００５１】本明細書で使用されるところの「異種核酸」および「組換え核酸」という用語
は互換可能に使用され、そして、ＭＳＣに導入されるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、
合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ
を意味する。組換え遺伝物質は異種遺伝物質であることができるか、または、Ｍ
ＳＣが得られた個体もしくは動物中で通常見出される遺伝物質の付加的なコピー
（１種もしくは複数）であることができる。

【００５２】本明細書で使用されるところの「プロモーター／調節配列」は、該プロモータ
ー／調節配列と操作可能に連結された遺伝子の特異的発現に必要とされるＤＮＡ
配列を意味する。いくつかの例では、本配列はコアプロモーター配列であること
ができ、また、他の例では、本配列は、エンハンサー配列、および組織特異的ま
たは別の方法で誘導可能なもしくは構成的様式での遺伝子の発現に必要とされる
他の調節要素もまた包含する可能性がある。

【００５３】本明細書で使用されるところの、「操作可能に連結される」として２種の核酸
配列を記述することにより、一本鎖もしくは二本鎖核酸部分が２種の核酸配列の
それぞれを含んで成ること、および、該２種の核酸配列の少なくとも一方がそれ
によりそれが他方の上に特徴づけられる生理学的影響を発揮することが可能であ
るような様式で、該２種の配列が該核酸部分内に配置されることを意味する。

【００５４】「発現構築物」は、発現されるべきヌクレオチド配列に効果をもたらして連結
された発現制御配列を含んで成る組換えポリヌクレオチドを含んで成るＤＮＡ構
築物を指す。発現構築物は、発現のための十分なシスに作用する要素を含んで成
り；発現のための他の要素は宿主細胞によるかもしくはインビトロ発現系中で供
給されることができる。発現構築物は、組換えポリヌクレオチドを組み込むコス
ミド、プラスミド（例えば裸のもしくはリポソーム中に含有される）およびウイ
ルスのような、当該技術分野で既知の全部のものを包含する。

【００５５】化合物、例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチドは、それが天然に関連
する成分を本質的に含まない場合、もしくはそれがその天然の状態でそれに付随
する天然の汚染物質から分離されている場合に「実質的に精製」されている。従
って、本明細書で使用されるところのタンパク質もしくはポリペプチドの「実質
的に純粋な」調製物は、その天然に存在する状態でそれが通常関連する成分から
精製されているタンパク質もしくはポリペプチドを指す。記述本発明は、ヒト骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）の拡張を、最初に低細胞密度で
ＭＳＣを培養することにより、従来技術の培養／拡張方法に関して向上させるこ
とができるという発見に基づく。従来技術の培養／拡張方法においては、細胞を
培養するために、非常に高い初期細胞密度（例えば、１平方センチメートルあた
り約１０００以上、および好ましくはおよそ５，０００個の細胞）を使用する。
対照的に、本発明の方法においては、ＭＳＣの拡張に使用される初期細胞密度は
、１平方センチメートルあたり約５０個を越えない細胞であるべきであり、およ
び好ましくは１平方センチメートルあたり約３個の細胞である。これらの低初期
細胞密度値でＭＳＣを培養することは、従来技術の方法よりもより大きな程度の
ＭＳＣの拡張を可能にする。

【００５６】本発明は、単離されたヒトＭＳＣのインビトロでの増殖の誘導方法を包含する
。本方法は、単離されたＭＳＣの初期密度が成長表面の１平方センチメートルあ
たり約５０（２５、１２、１０、６もしくは３）個未満の細胞であり、そして好
ましくは１平方センチメートルあたり最低約０．５個の細胞であるような成長表
面に、単離されたＭＳＣおよび成長培地を提供することを含んで成る。ＭＳＣは
、実質的に、実施例１で本明細書に記述されるもののような、当該技術分野で既
知のいずれかのＭＳＣ単離方法により単離することができる。成長表面は、培養
容器（例えば組織培養フラスコもしくはローラー瓶）、または、成長培地と接触
して維持される支持体（例えばビーズ、繊維、多孔質マトリックス、スポンジ、
管、など）の１個もしくはそれ以上の壁のような、ＭＳＣが接着することができ
る実質的にいかなる表面（例えばガラスもしくはプラスチック表面）であること
もできる。成長を促進する条件下で表面の存在下にＭＳＣをインキュベートする
場合に、ＭＳＣが増殖する。

【００５７】成長を促進する条件は、ＭＳＣが正常に増殖する条件のいずれかの組（温度、
成長培地組成、雰囲気、湿度、攪拌の程度など）を包含する。これらの条件のい
ずれも決定的に重要でない。温度は正常なヒト体温（すなわち約３７℃）のもの
近くであるべきであるが、しかし、ＭＳＣが増殖することができるいずれかの温
度（例えば３０ないし４３℃）であることができる。成長培地は、ＭＳＣの増殖
を支持するのに十分な栄養素および因子を含有するいかなる液体培地であること
もできる。こうした培地は、例えば炭素源（例えばブドウ糖）および最小必須栄
養素を含有し、そして好ましくは、哺乳動物血清（例えばウシ胎児血清）、抗生
物質（例えばペニシリンもしくはストレプトマイシン）およびＬ−グルタミン（
すなわち、タンパク質生合成のためのアミノ酸供給を向上させるため）の１種も
しくはそれ以上を含有する。哺乳動物血清は、全成長培地の１０％ないし２０容
量％の濃度で使用することができる。血清は、好ましくは、それがＭＳＣの活発
な成長を支持することを確実にするように前スクリーニングし；いくつかのロッ
トは、同一の供給元から提供されたロットであっても、ＭＳＣの活発な成長を支
持しない。あるいは、哺乳動物血清は１種もしくはそれ以上の成長因子（例えば
、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン増殖因子、もしくは内
皮細胞増殖因子）で置き換えることができる。成長培地は、例えば、本明細書の
実施例でのとおり、ウシ胎児血清、抗生物質およびＬ−グルタミンで補充された
、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを含まない最小必須培地
−αであることができる。他の例示的成長培地は、例えば、ダルベッコの最小必
須培地、および当該技術分野で記述されている他者（例えば本開示の背景の節で
論考される参考文献に開示される培地）を包含する。成長培地は、好ましくは、
ＭＳＣ、成長表面および成長培地のインキュベーションの間に１回もしくはそれ
以上（例えば３もしくは４日ごと）に置き換える。ＭＳＣは空気雰囲気、もしく
は例えば５％ＣＯ₂で補充された空気雰囲気中で成長させることができる。

【００５８】ＭＳＣの供給源、およびそれらの供給源からＭＳＣを得る方法は当該技術分野
で記述されている（例えば、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９７６Ｅｘｐ．
Ｈｅｍａｔｏｌ．４：２６７−２７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら、１９８７
、ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＫｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６３−２７２；Ｃａｓ
ｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１
；Ｍｅｔｓら、１９８１、Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖｅｌｏｐ．１６：８１
−８９；Ｐｉｅｒｓｍａら、１９８５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：２３７
−２４３；Ｏｗｅｎら、１９８８、ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ、チバ
財団シンポジウム（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ）、
英国チチェスター、４２−６０；Ｃａｐｌａｎ、１９９１、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐｅ
ｄ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７６：７１−７４；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９２、Ｊ．ＣｅｌｌＳｃ
ｉ．１０２：３４１−３５１；Ｃｈｅｎｇら、１９９４、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ１３４：２７７−２８６；Ｒｉｃｋａｒｄら、１９９４、Ｄｅｖｅｌｏ
ｐ．Ｂｉｏｌ．１６１：２１８−２２８；Ｃｌａｒｋら、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ
．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：７０−７８）。ＭＳＣは、例えばヒトドナー
の腸骨稜の吸引により得られる骨髄を包含する実質的にいずれの骨髄からも得る
ことができる。ドナーから骨髄を得る方法は当該技術分野で公知である。

【００５９】本明細書に記述されるところの単離されたＭＳＣの増殖の誘導方法の重要な一
局面は、単離されたＭＳＣの初期密度である。該初期密度は、成長表面の１平方
センチメートルあたり約５０個未満の細胞であるべきであり、そして好ましくは
１平方センチメートルあたり約２５、１２、１０、６もしくは３個未満の細胞で
ある。初期密度値の好ましい範囲（１平方センチメートルあたりの細胞で）は、
０．５−１．０および１．５ないし３を包含する。従来技術のＭＳＣの培養／拡
張方法と対照的に、本発明の方法の低い初期細胞密度は、成長表面上に接種され
たＭＳＣ集団の迅速かつ広範囲の拡張を促進する（すなわち、低細胞密度はＭＳ
Ｃの増殖能力を高レベルで維持する）。低い初期細胞密度は、ＭＳＣ集団の有意
の程度（例えば、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍も
しくはそれ以上）の拡張を可能にする。従来技術の方法は初期細胞密度にずっと
より大きな（１平方センチメートルあたり１，０００〜１０，０００個の細胞）
値を使用し、そしてずっとより低い程度のＭＳＣの拡張（例えば約３倍）をもた
らす。

【００６０】本明細書に記述される方法を使用する拡張により生じられたＭＳＣと、従来技
術の培養／拡張方法により生じられたＭＳＣとの間の別の重要な差異は、本開示
で記述されるとおり拡張されたＭＳＣが高度の分化可能性を保持することである
。すなわち、従来技術の方法により培養されたＭＳＣよりも、低初期細胞密度で
それらを培養することにより拡張されたＭＳＣのより大きな比率が、多数の細胞
型（例えば骨芽細胞、脂肪細胞、ニューロン細胞など）の１つに分化する能力を
保持する。上に示されたとおり、ＭＳＣが拡張される初期細胞密度は、拡張され
たＭＳＣの分化可能性の重要な一決定子である。拡張されたＭＳＣの分化可能性
の別の重要な決定子は、成長表面上にＭＳＣを接種することと、拡張されたＭＳ
Ｃを収穫することとの間で経過する時間の期間である。一般に、ＭＳＣが早期に
収穫されるほど、それらの分化の潜在能力が大きくなることができる。本明細書
に記述される方法を使用して拡張されたＭＳＣは、約３ないし１０日間培養物中
で維持することができ、そして、好ましくは約１４もしくは１０日を越えない後
に収穫する。

【００６１】該ＭＳＣ拡張方法は１回実施することができる（すなわち、成長培地の存在下
で成長表面上にＭＳＣを接種すること、およびその後例えば１０日後に細胞を収
穫することにより）。あるいは、該方法は連続して実施することができ、該方法
を１回実施し、ＭＳＣを拡張かつ収穫し、そしてその後拡張されたＭＳＣおよび
成長培地を第二の成長表面に提供し、ここで拡張されたＭＳＣの初期密度は第二
の成長表面の１平方センチメートルあたり約５０（２５、１２、１０、６もしく
は３）個未満の細胞であることを意味する。ＭＳＣ、成長培地および第二の成長
表面をインキュベートした後に、ＭＳＣをさらに拡張することができる。もちろ
ん、２回拡張されたＭＳＣを収穫し、そして同一の方法を使用して１回もしくは
それ以上の回の付加的な拡張にかけることができる。実施することができる拡張
および収穫の回数に対する理論上の制限は存在しない。しかしながら、各拡張／
収穫周期は入手可能なＭＳＣの数を有意に増大させることができる（すなわち１
０倍、１００倍もしくはそれ以上だけ）ため、全部の拡張されたＭＳＣをさらに
拡張するべきである場合に、幾何学的に増大する量の成長培地および培養表面が
、連続的な拡張／収穫周期の間に必要とされるであろうことが認識される。従っ
て、大部分の応用について、約１０を越えない拡張および収穫周期が通常必要で
あることができ、また、約１、２、３もしくは４周期が多くの応用（例えば細胞
治療もしくは遺伝子治療）に十分であることができることが認識される。

【００６２】本明細書に記述される方法を使用して拡張されるＭＳＣは、例えば、同一の個
体にＭＳＣを戻す前にＭＳＣを拡張するという目的上、一個体から得られるＭＳ
Ｃであることができる。あるいは、ＭＳＣは、レシピエントの個体にＭＳＣを提
供する前にそれらを拡張するという目的上、ドナー個体から得ることができる。
レシピエントおよびドナーは、好ましくは遺伝的に関係し、共通の血液細胞もし
くは他の細胞の表面抗原、またはそれらの双方を共有する。拡張されるＭＳＣは
、あるいは、最近（例えば数時間、数日、数週もしくは数ヶ月以内）に個体から
単離されたＭＳＣ、または拡張前に代謝的に抑制されたもしくは休眠状態で保存
されていた（例えば数年、数ヶ月もしくは数週間の期間の間液体窒素中で凍結さ
れた）ＭＳＣであることができる。いくつかの態様において、本開示に記述され
る方法に従ってＭＳＣを拡張する前に、外因性核酸を該細胞に提供することがで
きる。ＭＳＣへの外因性核酸の提供方法、およびこうしたＭＳＣの使用方法は、
例えば、同時係属中の米国特許出願第０９／０２８，３９５号明細書、ならびに
国際ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４４０７号および同第ＰＣＴ／ＵＳ
９９／０３８９７号明細書（本明細書で引用される全部の文書でそうであるよう
に、引用することにより組み込まれる）に記述される。

【００６３】単離されたＭＳＣは、例えば本開示の背景の節で記述されるものの全部を包含
する多様な臨床上の設定で有用である。例えば、ＭＳＣは、治療的産物である核
酸または治療的産物（すなわちＲＮＡもしくはタンパク質分子）をコードする核
酸のヒトへの投与のための送達ベヒクルとして使用することができる。例えば、
ＭＳＣは、適する核酸、好ましくは適するプロモーター／調節配列と操作可能に
連結されたものを使用して、トランスフェクションもしくは形質導入することが
できる。該核酸がＭＳＣ中で発現される場合に、ヒトに有益である治療的ＲＮＡ
もしくはタンパク質が産生される。ＭＳＣへの核酸の送達は、例えばＶｅｒｍａ
ら（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ３８９：２３９−２４２）に記述されるウイルス
遺伝子移入を使用するような標準的技術を使用して達成する。

【００６４】より具体的には、本発明のいくつかの局面において、遺伝子欠損を特徴とする
障害に悩まされる個体を、正常な細胞の遺伝子を正しく発現する細胞で欠陥のあ
るもしくは不足した細胞を補完すること、補強することもしくは置き換えること
の１種もしくはそれ以上により治療することができる。個体に導入されるべきで
ある細胞は、正常な合致されたドナーから得られたＭＳＣ由来であることができ
るか、もしくは、それらは治療されるべき個体から得られたＭＳＣであることが
できる。該細胞は欠損を修正するように遺伝子的に改変することができる。

【００６５】ＭＳＣの投与が障害を治療するために有用である障害の一例は脳の外傷である
。正常な合致されたドナーから得られたＭＳＣを、脳の外傷もしくは卒中を経験
した個体に投与することができる。投与後に、ＭＳＣは正常な脳細胞に分化する
ことができ、それらが該個体の冒された脳細胞を置き換えるかもしくは補完する
。正常な細胞は、冒された脳細胞を補償することができ、完全なもしくは部分的
に正常な機能を復帰させる。

【００６６】別の局面において、ＭＳＣを脳腫瘍に悩まされる個体から単離し、そして腫瘍
細胞を殺すかもしくは別の方法でその複製を停止させることが可能な遺伝子を、
単離されたＭＳＣに挿入する。その後、トランスフェクションされた細胞を個体
に再導入する。腫瘍細胞の成長および複製の一方もしくは双方を停止させること
ができ、そして腫瘍細胞のアポトーシスを誘発させることができる。

【００６７】本発明の一局面において、中枢神経系の障害に悩まされる個体を以下のとおり
治療することができる。単離されたＭＳＣを得、そしてそれらを拡張しかつ個体
に全身投与する。単離／拡張されたＭＳＣの若干が正常細胞に発育する。従って
、ＭＳＣの拡張されかつ若返らされた集団を含む中枢神経系組織の再生息が、中
枢神経系組織中の欠損の修正を助長する。また、ＭＳＣは、患者への骨髄ストロ
ーマ細胞の投与前に、当該技術分野で既知の方法を使用して例えば筋細胞、骨細
胞、軟骨細胞、脂肪細胞などに分化することができる。

【００６８】合致されたドナーからの修復された細胞もしくは正常細胞で、欠陥のある細胞
を置き換えることに加え、本発明の方法は、ヒト中で分泌される場合に有益な効
果を有する所望のタンパク質の発現を助長するのにもまた使用することができる
。例えば、ＭＳＣを単離し、本発明の方法を使用して拡張し、所望のタンパク質
をコードする遺伝子を供給し、そして個体の中枢神経系もしくは他の組織に導入
することができる。個体の所望の標的組織中での所望のタンパク質の発現は、個
体で治療効果を発揮する。本発明の本局面は、治療的タンパク質を個体に投与す
る遺伝子治療に関する。あるいは、ある疾患に悩まされる個体からＭＳＣを単離
することができ、そして、個体のＭＳＣ中の突然変異された遺伝子を不活性化す
るかもしくはインシトゥで正常遺伝子で置き換えることができる。こうした操作
は通常、正しく改変された細胞の徹底的な選択、および従って本発明により可能
にされる該改変されたＭＳＣの広範囲の拡張を必要とする。改変されたＭＳＣを
単離かつ拡張した後に、それらを疾患の治療のため同一の個体に戻すことができ
る。

【００６９】異種遺伝子を発現しかつ異種タンパク質を産生するための適する宿主であるこ
とに加えて、本明細書に開示されるとおり拡張されたＭＳＣはそれらの多能性を
保持しかつ多様な異なる組織を再生息させることができるため、ＭＳＣは細胞治
療組成物中でとりわけ有用である。さらに、ＭＳＣは、直接の血管血供給を欠く
位置に埋植される場合に非常に高い生存率を有する。さらに、ＭＳＣは容易に（
ｅａｓｉｌｙ）かつたやすく（ｒｅａｄｉｌｙ）得ることができ、また、それら
は、多数のＭＳＣを生じさせる本発明の方法を使用して培養物中で迅速に拡張し
、それらを細胞治療に有用な細胞の十分な供給の良好な供給源とする。

【００７０】本発明の別の局面は、ヒトＭＳＣは、それらが培養される場合、少なくともそ
れらを低い（すなわち１平方センチメートルあたり５０、２５、１２、１０、６
もしくは３個未満の細胞）初期密度で培養する場合に１種もしくはそれ以上の可
溶性の成長因子を産生するという発見に関する。これらの成長因子の少なくとも
１種は約３０，０００の分子量を有し、そして例えばサイズ排除ＨＰＬＣを使用
してＭＳＣの培地から少なくとも部分的に精製することができる。ヒトＭＳＣ培
養物へのこの成長因子の添加は、ＭＳＣ増殖の速度および程度の一方もしくは双
方を高める。少なくとも１種の他の成長因子は約１０，０００の分子量を有し、
そしてまたサイズ排除ＨＰＬＣを使用してＭＳＣの培地から少なくとも部分的に
精製することができる。ヒトＭＳＣ培養物へのこの成長因子の添加は、ＭＳＣ増
殖の速度および程度の一方もしくは双方を阻害する。成長因子の１種もしくはそ
れ以上が、ヒトＭＳＣを多様な型の細胞に分化するように誘導することができる
。また、該因子の１種もしくはそれ以上は、分化させることなくＭＳＣを増殖さ
せるかもしれない。

【００７１】成長因子の１種もしくはそれ以上を、実質的に精製された形態、部分的に精製
された形態、もしくは馴化培地の形態でヒトＭＳＣ培養物に添加することができ
る。こうした馴化培地は、ヒトＭＳＣを数時間もしくは数日の期間の間成長培地
中で培養することにより生じさせることができ（すなわち、１平方センチメート
ルあたり１２〜１０，０００個のＭＳＣの細胞密度を有するＭＳＣ培養物中で最
低約３もしくは６日）、その期間の間、ＭＳＣは成長培地中に成長因子を分泌し
、それにより成長培地を馴化培地に転換する。ＭＳＣが約１４日間培養される馴
化培地は、例えば、約３０，０００の分子量を有する上述された成長因子、およ
び約１０，０００の分子量を有する上述された成長因子を包含する、ＭＳＣによ
り産生される複数の成長因子を含有する可能性がある。１種もしくはそれ以上の
付加的因子もまた存在するかもしれない。

【００７２】本発明は、従って、成長培地の存在下に表面上で成長する単離されたヒトＭＳ
Ｃのインビトロ増殖を高める方法を包含する。該方法は、低初期密度でのように
成長されたヒトＭＳＣにより分泌される成長因子で成長培地を補充することを含
んで成る。例えば、該成長因子は、低密度（例えば、１平方センチメートルあた
り最低約０．５もしくは１．５個の細胞の初期密度）で第二の表面上で成長され
かつ最低数時間（しかし好ましくは約３〜６日のような１日以上）インキュベー
トされるヒトＭＳＣの培養物（「産生体ＭＳＣ」）から得られた馴化培地で成長
培地を補充することにより、成長培地に添加することができる。

【００７３】産生体ＭＳＣにより産生される成長因子の量は存在するＭＳＣの数におおよそ
比例する可能性があることが理解される。この理由から、非常に低い産生体細胞
密度（例えば１平方センチメートルあたり＜０．５個の細胞）は好ましくない。
代わりに、産生体ヒトＭＳＣは、１平方センチメートルあたり最低約１２個の細
胞の初期密度のようなより高い初期密度で第二の表面上で成長させることができ
る。成長因子を生成させるための産生体細胞の有用な密度は、例えば、１平方セ
ンチメートルあたり１２〜１０，０００個の細胞を包含する。

【００７４】産生体ＭＳＣにより産生される成長因子の量はＭＳＣの培養の少なくとも最初
の数時間もしくは数日の間に増大する可能性があることもまた理解される。従っ
て、成長因子を含有する馴化培地を収穫する前に、産生体ヒトＭＳＣを最低数時
間、および好ましくは最低数日（好ましくは３〜２１日）間インキュベートする
ことが好ましい。

【００７５】馴化培地は、好ましくは、産生体細胞が成長培地から分離されている形態で使
用する。一個体から得られたヒトＭＳＣにより産生される成長因子は、好ましく
は馴化培地から実質的に全部の（例えば＞９０％、＞９５％、＞９９％もしくは
＞９９．９％）産生体細胞を除去した後に、異なる個体に提供することができる
。さらに、成長因子は、標準的なタンパク質精製方法により馴化培地から精製す
ることができる。成長因子の活性は、分画された（例えば、液体クロマトグラフ
ィー法により、沈殿法により、遠心分離法により、など）馴化培地の個々の画分
のＭＳＣ増殖を高める活性を測定することにより、分画された培地中で評価する
ことができる。有意のＭＳＣ増殖を高める活性を表す画分は、ＭＳＣ増殖を高め
るためかもしくはさらなる精製のための出発原料としてのいずれかで、合わせる
かもしくは個別に使用することができる。馴化培地、または好ましくは部分的に
精製されたもしくは実質的に精製された成長因子を、個体中でのＭＳＣの増殖を
誘導するためにヒト患者に提供することができる。培養された培地もしくは成長
因子は、好ましくは静脈内に投与するが、しかし、場合によっては、インビボで
ヒトＭＳＣへの該因子の送達をもたらすいずれかの他の投与方法（例えば筋肉内
注入、骨髄を含有する空間への注入、皮下注入、分解可能な成長因子を含有する
塊の埋植、など）により投与することができる。

【００７６】非常に高濃度の成長因子でのような、少なくともある状況下で、成長因子がＭ
ＳＣ増殖を阻害する可能性のあることが認識される。従って、ヒトに投与される
成長因子の用量が、所望のＭＳＣ増殖を誘導する効果を達成しない場合、所望の
効果が達成されるまで該用量を改変（すなわち増大もしくは減少）することがで
きる。さらに、培養物中でのヒトＭＳＣの増殖は、それとともにＭＳＣがインキ
ュベートされる培地を希釈（例えば不連続な回数で、もしくは連続的に）または
置き換えることにより高めることができる。あるいは、馴化培地の精製は数種の
異なる成長因子を提供するかもしれず、そのいくつかは患者に投与される場合に
ＭＳＣの増殖を増大させる可能性がある。これらの成長因子の他者は、骨細胞（
骨芽細胞）のような特定の細胞型へのＭＳＣの分化を促進する可能性がある。例
えば骨芽細胞へのＭＳＣの分化を促進した因子は、骨粗鬆症のような骨障害を治
療するのに有用である。

【００７７】本明細書の実施例で記述されるとおり、ヒトＭＳＣの拡張可能性（すなわち、
細胞の成長および分裂によりＭＳＣのその後の世代を生じさせるそれらの能力）
は、培養物中でコロニーを形成するＭＳＣの能力と正確に相関する。従って、本
発明は、インビトロでのヒトＭＳＣの拡張可能性の評価方法を包含し、該方法は
、低密度の（例えば表面の１平方センチメートルあたり約５０、２５、１２、１
０、６もしくは３個未満の細胞の初期密度の）成長培地の存在下での表面上の細
胞をインキュベートすること、およびその後にＭＳＣのコロニー形成効率を評価
することを含んで成る。ＭＳＣの拡張可能性はＭＳＣのコロニー形成効率におお
よそ比例する。ＭＳＣは１時間から約１４日までの間培養することができるが、
しかし、好ましくは、ＭＳＣにより形成されるコロニーを計数する前に数日間培
養することができる（例えば、コロニーをクリスタルバイオレットでの染色後に
計数するはずである場合に５もしくは６〜１０日）。

【００７８】コロニー形成効率は、例えば、形成されたコロニーの数を計数することと連結
された、培養されたＭＳＣの視覚的検査により評価することができる。コロニー
形成効率は、成長表面上に接種された細胞の数で、形成されたコロニーの数を割
ることにより、ＭＳＣのパーセンテージとして表すことができる。もちろん、形
成されたコロニーの数を、いずれかの他の（例えば自動化された）コロニー計数
方法により評価することができる。

【００７９】第一のサンプルもしくはＭＳＣの供給源から得られた培養されたＭＳＣのコロ
ニー形成効率を、第二のサンプルもしくはＭＳＣの供給源から得られたＭＳＣの
コロニー形成効率と比較することができる。より高いコロニー形成効率を有する
ＭＳＣを包含するサンプルもしくは供給源は、一般に、他のサンプルもしくは供
給源よりもより大きな拡張可能性を有するＭＳＣの収穫を有することができる。
あるいは、ＭＳＣのサンプルもしくは供給源から得られた培養されたＭＳＣのコ
ロニー形成効率を、類似の（もしくは好ましくは同一の）条件下で培養されたＭ
ＳＣの別の供給源もしくはサンプルを使用して生じられたデータと比較すること
ができる。また、好ましくは、他の供給源もしくはサンプルから得られたＭＳＣ
の拡張可能性が既知である。該データは、一組の類似のもしくは同一の条件下で
培養されたＭＳＣのコロニー形成効率と拡張可能性との間の関係を示す参照曲線
（例えば、図２で本明細書に示されるプロット）であることができる。

【００８０】本発明はヒトＭＳＣを使用して例示されたとは言え、ＭＳＣは、あるいは、Ｍ
ＳＣを含んで成るいずれの動物のものであることもできる。本発明は、他の霊長
類、および例えば骨髄の便宜的なもしくは豊富な供給物を提供することができる
他の哺乳動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、など）のような他の哺乳動物のＭＳ
Ｃを包含する。また、成長因子は、他の生物学的系を包含する他の供給源、また
は、単離されそしてその後細菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞もしくは
トランスジェニック動物のような多様な系で発現される遺伝子の産物から得るこ
とができるかもしれない。

【００８１】実施例８に提示されるデータが立証するとおり、リポコルチンＩＩとして知ら
れる（アネキシンＩＩとしてもまた知られる）タンパク質は、上のとおり拡張さ
れた培養物中でのみ見出されることが本発明で同定された表面タンパク質である
。従って、本発明は、本タンパク質を使用する拡張されたＭＳＣの単離および精
製方法を包含する。該方法は、当該技術分野で利用可能な普遍的な免疫学的技術
を使用して細胞を単離かつ精製するために本タンパク質に対する抗体を使用する
ことを含んで成る。

【００８２】実施例さらに、本発明は、次の実験例を参考にすることによって詳細に記述される。
これらの実施例は、具体的に説明するためにのみ与えられるものであって、他に
特定されない限り限定するものではない。かくして、本発明は、次の例に限られ
ず、むしろ、本明細書に与えられる教示の結果として明らかである種々の改変を
包含する。

【００８３】例１培養におけるヒト骨髄ストローマ細胞の拡張および老化骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、正常なボランティアの腸骨稜から得られた
骨髄吸引物から単離された。細胞は、それらのプラスチックへの接着能によって
単離され、培養において継代され、そして凍結保存された。あるサンプルは、凍
結細胞保存物から１５細胞倍加を経て拡張した。他のサンプルは、約４細胞倍加
後に複製を停止した。

【００８４】この実施例において開示されるデータは、培養における細胞の複製潜在力が、
初期の継代からのサンプルが１平方センチメーター当たり約１０細胞の低い密度
において塗布（ｐｌａｔｅ）された単純なコロニー形成アッセイによって、最良
に予測されることを例証する。高いコロニー形成効率を示したサンプルは、最高
の複製潜在力を示した。低密度において初期の継代細胞を塗布することによって
得られるコロニーは、大きさと形態において異なっていた。大きいコロニーは、
適当な培地において培養された場合、容易に骨芽細胞および脂肪細胞に分化した
。かくして、この実施例において開示されるデータは、正常なボランティアの骨
髄吸引物から得られたＭＳＣはそれらの培養において広範に変化するけれども、
それらのＭＳＣの拡張能は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を検出する単純なアッ
セイによって予測できることを例証する。

【００８５】さらに、この実施例において開示されるデータは、ＭＳＣサンプルが高い始発
細胞密度において塗布され、そして老化に達する培養において拡張された場合、
ＭＳＣが、それらの骨芽細胞への分化能を保持することを例証する。しかしなが
ら、そのようなＭＳＣは、脂肪細胞への分化はできなかった。培養における連続
継代後の多能性の欠如は、細胞および遺伝子治療のための拡張されたＭＳＣの使
用について重要な示唆をもつであろう。

【００８６】この実施例において提示される実験で使用される材料および方法が、ここに記
述される。

【００８７】高密度プレーティングによるＭＳＣの単離および培養ヒトＭＳＣは、年齢１９〜４９才にわたる正常なドナーの腸骨稜から採取され
た吸引物２０ｍｌから得られた。吸引物の各２０ｍｌは、先ず、ハンクス液（Ｈ
ＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ）２０ｍｌを用いて吸引された骨髄を希釈し、次いで、混合
物を数回弱く反転して骨髄を洗浄することによって処理された。フィコール（Ｆ
ｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）約１０ｍｌが、サンプル４０ｍ
ｌの下に重層され、そしてサンプルは、室温で３０分間２５００ｘｇにおいて遠
心された。単核細胞（ＭＮＣ）層が勾配界面から除去され、そして細胞がＨＢＳ
Ｓを用いて洗浄された。細胞は１５００ｘｇで１５分間遠心され、そして細胞ペ
レットが完全培地に再懸濁された。完全培地は、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清
（ＦＣＳ，ＡｔｌａｎｔａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）
、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂ
ｃｏ）および２ｍＭＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補足された、デオキシリ
ボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを含まない最小必須培地−アルファ培
地（Ｇｉｂｃｏ）を含有した。ＦＣＳはＭＳＣの急増殖のためにロット−選択さ
れた。

【００８８】この処理の後、細胞は、２５ｃｍ²組織培養フラスコ（Ｎｕｎｃ）中に添加さ
れ、そして湿潤５％ＣＯ₂雰囲気の存在下３７℃において培養された。２４時間
後、非接着細胞が除去された。接着細胞は、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）
を用いて２回激しく洗浄され、そして振盪して接着性造血前駆体を除去し、この
後、新鮮な完全培地が添加された。培地は、３〜４日毎に置換され、そして細胞
は約７０〜９０％集密まで増殖された。

【００８９】細胞は、細胞層を３７℃で５分間０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび１ｍ
ＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）と接触させることによって収穫された。細胞は、７５
ｃｍ²フラスコ中に再塗布され、再び集密まで増殖され、そして細胞が収穫され
た。完全培地約８ｍｌが、トリプシン処理された細胞と混合されてトリプシンを
失活させ、そして細胞が、自動装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ）または血球計を用いてカ
ウントされた。収穫細胞は、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯおよび３０％（ｖ／ｖ）Ｆ
ＣＳ中で徐々に凍結され、液体窒素中で凍結保存された。連続継代をとおして細
胞を拡張するために、細胞は、１ｃｍ²当たり５，０００細胞（すなわち、約１
：３希釈）において塗布され、集密近くまで増殖され、そして同じプロトコール
を用いて収穫された。各継代の最後に、細胞が血球計を用いてカウントされて細
胞倍加数を計算した。

【００９０】ＣＦＵ−Ｆアッセイ培養において約７０〜９０％集密まで拡張されたＭＳＣは、トリプシン−ＥＤ
ＴＡを用いて収穫され、そして血球計でカウントされた。ガラス製パスツールピ
ペットが、その先端を火炎により直径が減少され、そして細胞が細いピペットを
とおして数回吸われて細胞分離を確実にされた。細胞は完全培地中に希釈され、
そして直径１００ｍｍ（約８０ｃｍ²）組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）において約
１０細胞／ｃｍ²の始発密度において塗布された。湿潤５％ＣＯ₂雰囲気の存在下
３７℃において１０〜１４日間培養後、細胞はＰＢＳを用いて洗浄された。細胞
は、メタノール中０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットを用いて５〜１０
分間室温で染色された。細胞はＰＢＳで２回洗浄され、そして可視コロニーがカ
ウントされた。コロニーを分離するために、未染色コロニーがクローニングシリ
ンダーおよびトリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収された。

【００９１】ＭＳＣの骨形成分化ＭＳＣは、１２穴組織培養プレートのウエルにおいて７０〜９０％集密まで増
殖され、次いで、１０^-8Ｍデキサメタソン、０．２ｍＭアスコルビン酸（Ｓｉｇ
ｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）および１０ｍＭβ
−グリセロールリン酸（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＳｔＬｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）を含有する骨形成培地において培養された。培地は３〜４日毎に置
換され、そして無機質の沈着が２〜３週後に観察された。石灰沈着を調べるため
に、培養物がＰＢＳで洗浄され、氷冷７０％エタノール溶液中で１時間固定され
た。培養物は水で洗浄され、次いでＳｔａｎｆｏｒｄら（１９９５，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４２０−９４２８）の記述のように、４０ｍＭアリザ
リンレッド（ｐＨ４．１，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＳｔＬｏ
ｕｉｓ，ＭＯ）１ｍｌを用いて回転しつつ１０分間染色された。培養物は、２ま
たは３回ＰＢＳで洗浄されて非特異的染色を減少させた。染色された無機質は不
均一に分布され、そして細胞を覆い隠したので、集密培養物の全面積のパーセン
テージとして石灰沈着面積を計算するために、石灰沈着が多視野を検査すること
によってアッセイされた。

【００９２】ＭＳＣの脂肪形成分化８５〜９５％集密培養物におけるＭＳＣは、記述（ＫｅｌｌｙａｎｄＧｉ
ｍｂｌｅ，１９９８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９：２６２２−２６２
８）のように、ＭＨＩ（０．５μＭヒドロコルチゾン、０．５ｍＭイソブチルメ
チルキサンチンおよび６０μＭインドメタシンを含有する）を補足された完全培
地において培養された。培地は３〜４日毎に置換された。脂質液胞を含有する細
胞が２〜３週後に観察された。細胞はＰＢＳを用いて洗浄され、そして１０％ホ
ルマリン中で１０分間固定された。細胞は、記述（Ｈｏｕｇｈｔｏｎｅｔａ
ｌ．，１９９８，Ｂｏｎｅ２２：７−１６）のように、新鮮オイルレッド−Ｏ
溶液を用いて約１０〜１５分間染色された。オイルレッド−Ｏ溶液は、保存液（
イソプロパノール中０．５％；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）３部と水２部を激しく混合し、次いで溶液を０．４μｍフィ
ルターを通して濾過することによって調製された。プレートは水で３回洗浄され
た。脂肪細胞のパーセンテージは、多視野において５０〜１００細胞をカウント
することによってアッセイされた。

【００９３】この実施例において提示される実験結果が、ここに記述される。

【００９４】ＣＦＵ−Ｆアッセイが培養物における寿命を予測する有核細胞が、正常なドナーの骨髄吸引物から単離され、そしてＭＳＣが、それ
らのプラスチック培養皿への接着能によって単離された。細胞は、先ず２５ｃｍ ² フラスコにおいて、次いで７５ｃｍ²フラスコにおいて集密まで増殖された後、
凍結細胞保存物が調製された。個々のドナーから得られたサンプルにおける続く
集団倍加の総数が、凍結細胞保存物の連続再プレーティングによって調べられた
。近年の報告は、寒冷保存が、イヌＭＳＣ（Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔａｌ．，１
９９７，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．８：１３６−１５６）またはヒトＭＳＣ
（Ｂｒｕｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
４：２７８−２９４）のいずれかの性質を有意には変えないことを示した。凍結
細胞の第１プレーティングによって得られた集密培養物（すなわち第２継代）の
蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によるアッセイは、細胞が、ＣＤ４５、造血
細胞のマーカー（ＣｌａｒｋａｎｄＫｅａｔｉｎｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ
ｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：７０−７８）について陰性であっ
たことを指示した。ＦＡＣＳによって解析された細胞の約８％は、Ｓｔｒｏ−１
（１次ヒトＭＳＣ培養物において初期の骨形成始原細胞を同定するために、他の
研究者によって使用された細胞表面マーカー；ＳｉｍｍｏｎｓａｎｄＴｏｒ
ｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，１９９１，Ｂｌｏｏｄ７８：５５−６２）については強く
陽性であり、そして陽性細胞は、最大で、もっとも顆粒状のＦＡＣＳ細胞フラク
ションに存在した。残りの細胞は、Ｓｔｒｏ−１について弱く陽性であった。し
たがって、この実施例において記述される結果は、Ｓｔｒｏ−１抗体が、ＭＳＣ
の培養物におけるもっとも初期の始原細胞を同定するために使用できるという結
論とは一致しない。

【００９５】図１に示されるように、細胞が高密度で塗布されることによって継代された場
合、異なるドナーから得られたＭＳＣサンプルを用いて得ることができる集団の
倍加数には有意な変動があった。あるＭＳＣサンプルは、凍結細胞保存物から１
５細胞倍加以上に拡張した。他のＭＳＣサンプルは、約４細胞倍加後に複製を止
めた。細胞の複製能は、それらの始発増殖速度において反映されなかった（例え
ば、図１におけるドナー１１とドナー１３を比較せよ）。また、変動は、ドナー
の性別または年齢には無関係であった。第４継代後の細胞のアッセイは、細胞が
低密度（１０細胞／ｃｍ²）で塗布された単純ＣＦＵアッセイにおいて得られた
コロニー数には、また有意な変動があることを例証した。最初に塗布された単核
細胞（ＭＮＣ）数と検出できるＣＦＵ数との間には、ポジティブな相関関係があ
った（γ²＝０．６３；ｎ＝８；ｐ＜０．０１１）が、同じ個体から同時に得ら
れた二並列サンプルが比較された場合、相関関係は存在しなかった。具体的には
、ドナー５４，５６および５７から得られた二並列骨髄サンプル間には相関関係
は存在しなかった。しかしながら、培養において得られた集団倍加数は、図２に
おいて示されるように、ＣＦＵアッセイにおいて得られた値と密接に相関された
（γ²＝０．９４１９；ｎ＝５；ｐ＝０．００６）。

【００９６】ＭＳＣ細胞サンプルが培養において拡張されうにつれ、ＣＦＵ数は衰退した。
継代数に伴うＣＦＵの衰退は、単一サンプルのアッセイから（すなわち、図３Ａ
に示されるように）、そして継代４と継代１２において比較された異なるドナー
から得られた５サンプルのアッセイから（すなわち、図３Ｂにおいて示されるよ
うに）明らかであった。

【００９７】ＭＳＣＣＦＵ−Ｆは、大きさ、形態および増殖速度において異なるＣＦＵアッセイにおいて希薄に塗布されたＭＳＣによって形成されるコロニー
は、大きさにおいて変化した（また、ＭｅｔｓａｎｄＶｅｒｄｏｎｋ，１９
８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖ．１６：８１−８９；Ｂｒｕｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２７８−２９４、
参照）。図４および図６Ａ−Ｄにおいて示されるように、最大コロニーは、一貫
して最小コロニーの大きさの２〜３倍であった。比較的大きいコロニーは、図６
Ｃにおいて示されるように、小さい紡錘形細胞からなった。比較的小さいコロニ
ーは、幅広い平らな細胞からなり（図６Ｄ参照）、そして比較的大きいコロニー
よりも低く集密になる傾向であった。

【００９８】骨芽細胞および脂肪細胞への分化についてのアッセイこの実施例において記述されるように培養されたＭＳＣの多能性を調査するた
めに、継代２から得られたＭＳＣが、低密度で塗布され、そして個々のコロニー
がクローニングリングを用いて単離された。コロニーからの細胞の二並列の一定
分量が集密まで増殖され、そしていずれか骨芽細胞または脂肪細胞への分化につ
いてアッセイされた。初期の継代培養物から単離されたコロニーのすべては、図
５および６Ａ−Ｈに示されるように、両表現型に分化した。しかしながら、分化
の程度にはかなりの変化があった。若干のコロニーは継代培養された場合、プレ
ートは、骨形成培地を用いる培養後に、ほとんど完全に無機質で覆われた。二並
列サンプルにおいて、本質的にすべての細胞は、脂肪形成培地における培養後に
、オイルレッド−Ｏ染色される液胞を含有した。他のコロニーが継代培養された
場合、図５に示されるように、細胞は、優先して１つの表現型に分化されるか、
またはわずかにどちらかに分化されるかいずれかであった。この差異は、同じド
ナーからの同じプレートから単離された大きいコロニーが比較された場合でも検
出可能であった。

【００９９】類似の分化アッセイが、後期のＭＳＣ（例えば、継代１２）を用いて実施され
た。ＭＳＣは、希薄な塗布後にはもはやコロニーを生成しなかったので、アッセ
イは、約１：３希釈において細胞を塗布した後の集密に近い培養物において行わ
れた。後期継代培養物のＭＳＣは、図６Ｇおよび表１において示されるように、
骨芽細胞への分化能を保持していた。実際には、少数の培養物が、偶発的に無機
質の蓄積を始めただけであった。しかしながら、図６Ｈおよび表１に示されるよ
うに、ＭＳＣは、それらのＣＦＵ生成能を失っていたので、脂肪細胞への分化は
できなかった。

【０１００】

【表１】

【０１０１】表１におけるデータ（すなわち、継代２細胞に関する）は、次のように得られ
た。大きいコロニーは、コロニーシリンダーを用いるＣＦＵアッセイから単離さ
れた。二並列の細胞一定分量が再塗布され、そして集密近くまで増殖された。培
養物は、１８日間、いずれか脂肪形成または骨形成培地において培養された。継
代１２細胞を用いる実験では、１：３希釈においてプレーティング後、集密近く
まで増殖され、次いで、二並列の培養物が１８日間、いずれか脂肪形成または骨
形成培地において培養された。図３に示されるように、いずれであっても、ＣＦ
Ｕは、本明細書に開示されるナンバー１２および５４Ｌ以外のドナーからの継代
１２細胞を用いて得ることはほとんどできなかった。

【０１０２】プラスチック培養表面への接着能によって単離されたＭＳＣは、従来、よく定
義された特性を有する（例えば、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１
９７６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４：２６７−２７４；Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌ
ａｓｐｉｎａｅｔａｌ．，１９８０，Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；
ＭｅｔｓａｎｄＶｅｒｄｏｎｋ，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖ
．１６：８１−８９；Ｐｉｅｒｓｍａｅｔａｌ．，１９８５，Ｅｘｐ．Ｈｅ
ｍａｔｏｌ．１３：２３７−２４３；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．
，１９８７，ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６
３−２７２；ＯｗｅｎａｎｄＦｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８，Ｉｎ：
ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ，ｐｐ．４２−６０，ＣｉｂａＦｏｕｎ
ｄａｔｉｏｎＳｙｍｐ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ；Ｃａｐｌａｎ，１９
９１，Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ，１９９
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４、参照）。しかしながら、異なる起源
から、そして異なる条件下で調製された培養物ではかなりの可変性がある。例え
ば、マウス骨髄から得られたＭＳＣの始発培養物は、造血前駆細胞によって非常
に汚染されており（ＣｌａｒｋａｎｄＫｅａｔｉｎｇ，１９９５，Ａｎｎ．
ＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：７０−７８）、そしてＭＳＣの
収量は、ある近交系からは著しく低い（Ｐｈｉｎｎｅｙｅｔａｌ．，１９９
９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：５７０−５８５）。反対に、造血前
駆細胞は、ヒトＭＳＣの培養物からは急速に失われるようである。しかしながら
、少なくとも２種の形態的に区別される細胞が存在する（ＭｅｔｓａｎｄＶ
ｅｒｄｏｎｋ，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖ．１６：８１−８９；
Ｓａｔｏｍｕｒａｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
１７７：４２６−４３８）。これらの２つのタイプは、タイプＩ細胞（急速に増
殖する紡錘形細胞）およびタイプＩＩ細胞（幅広い、徐々に増殖する細胞）と呼
ばれる。タイプＩＩ細胞は、細胞が継代されるにしたがって数が増加し、そして
タイプＩ細胞から生じるように見える。さらに、中間の形態をもつ細胞も観察さ
れる。

【０１０３】この実施例で開示されるデータは、腸骨稜吸引物から得られたヒトＭＳＣの培
養における拡張性が、細胞が高い密度において最初に塗布される場合には有意に
変化することを例証している。この変化は、ドナーの性別または年齢によっては
説明されない。また、それは、サンプル中に存在する有核細胞の数によっても説
明されなかった。その代わりに、同時に同じボランティアから採取された２種の
サンプル間でさえ変化が観察されたので、それは、腸骨稜から得られた骨髄の吸
引物におけるサンプリング変動を反映しているのであろう。ＭＳＣは、毛細管か
ら骨髄自体を不完全に分ける血管周囲の細胞の複雑な構築構造物から生じ（Ｐｒ
ｏｃｋｏｐ，１９９７，Ｓｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４）、そしてＭＳＣの
収量は、吸引物中のそのような構築構造物の存在により変化できる。

【０１０４】ＭＳＣ培養物の拡張性は、第１または第２継代における始発増殖速度とは相関
されない。しかしながら、この実施例で記述されるように、拡張性は、ＭＳＣサ
ンプル中にＣＦＵを検出する単純アッセイに基づいて予測することができる。遺
伝マーカーを用いる決定的な実験は報告されてないが、ＣＦＵアッセイにおける
各コロニーは、単一細胞から生じると推測される（Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐ
ｉｎａｅｔａｌ．，１９８０，Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；Ｋｕｚ
ｎｅｔｓｏｖｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．
１２：１３３５−１３４７；Ｓａｔｏｍｕｒａｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７７：４２６−４３８）。したがって、いかなる
特定の操作理論によっても拘束されることを願わずに、初期の継代培養物から得
られたＣＦＵ数は、骨髄サンプル中の複製コンピテントＭＳＣまたはＭＳＣ前駆
体の数を反映すると信じられる。コロニー形成ＭＳＣの低い数しか検出できない
サンプルにおいては、細胞は、最初のプレーティングにおいて集密に達する前に
多くの倍加を経るであろう、したがって、さらなる拡張のためには限られた潜在
力をもつ。

【０１０５】この実施例において開示されるデータは、単純なＣＦＵアッセイが、タイプＩ
（紡錘形）細胞に富んでいるサンプルを同定するために使用できることを示唆す
る。したがって、そのようなアッセイは、ＭＳＣサンプルの相対的拡張性を比較
するために使用することができる（すなわち、ＣＦＵ内容物と拡張性とを相関さ
せる標準曲線または他の参考データを用いて、種々のサンプルのＣＦＵ内容物を
比較するか、または１つのサンプルのＣＦＵ内容物を比較することによって）。
また、ＣＦＵアッセイは、多数のＭＳＣサンプルの中から培養において拡張する
最大の可能性をもつサンプルを選択するために使用できる。

【０１０６】また、タイプＩ細胞に富むサンプルは、比較的少ないタイプＩ細胞を含有する
サンプルよりも分化のために大きい可能性をもつ。従って、初期継代ＭＳＣにお
けるＣＦＵアッセイは、実質的な数の分化可能な細胞を含有し、したがって、広
範な特性決定または遺伝子操作のために適当である、サンプルを同定するために
使用することができる。

【０１０７】近年、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｅｔａｌ．（１９９７，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎ
ｅｒ．Ｒｅｓ．１２：１３３５−１３４７）およびＳａｔｏｍｕｒａｅｔａ
ｌ．（１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７７：４２６−４３８）に
よって例証されたように、初期の継代ＭＳＣの希薄なプレーティング後に得られ
たコロニーの細胞は、大きさ、形態、およびイン・ビボで骨芽細胞へ分化する潜
在力において不均一である。この実施例で開示されるように、初期の継代細胞か
ら得られたクローンは、また、培養において脂肪細胞に分化するそれらの潜在力
において不均一である。したがって、細胞は、均等に多能性ではない。

【０１０８】ここに提示される結果は、プラスチック培養表面への接着能によって単離され
たＭＳＣは、培養における多数の継代後に、種々の非造血細胞に分化する能力を
保持していることを例証している。近年の報告は、そのようなＭＳＣが、ＭＳＣ
の全身的注入後に随伴細胞または筋細胞に（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，１
９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９：１４５６，１５２８−１５３０）、あるいは
脳への注入後に星状細胞に（Ａｚｉｚｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３９０８−３９１３；Ｋｏｐｅｎ
ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１０
７１１−１０７１６）分化できることを示している。

【０１０９】さらにまた、この実施例において開示される結果は、ＭＳＣが高い始発細胞密
度において塗布された培養で継代されるにつれて、多能性の喪失の増大、使用さ
れた培養条件に依存する喪失程度が存在することを例証している。Ｂｒｕｄｅｒ
ｅｔａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２７８−２
９４）は、この実施例において開示されたデータによって確認されるように、Ｍ
ＳＣのサンプルが、培養における１５継代後にも骨芽細胞へ分化する潜在力を保
持できることを報告した。事実、この実施例において開示されたデータは、若干
の後期の継代ＭＳＣが、突発的に骨芽細胞に分化したことを例証している。しか
しながら、ＭＳＣは培養において老化に達するにつれ、それらは、脂肪細胞への
分化能を喪失した。

【０１１０】例２培養におけるヒト骨髄ストローマ細胞の単離および拡張方法この実施例において開示されるデータは、ヒト骨髄の小サンプルが、骨、軟骨
、筋肉、肺および中枢神経組織を含む種々の組織において見いだされる細胞の始
原細胞である幹様細胞の起源として使用できることを例証する。この実施例では
、ヒト骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）を単離および拡張する方法が述べられる。
概説すると、方法は、ドナーから骨髄サンプルを採取することを含む（例えば、
外来患者操作として局部麻酔下で実施されるヒト腸骨稜の吸引において得られる
骨髄）。ＭＳＣは、骨髄から単離され、そして細胞数を増加させるためにこの実
施例において述べられる条件下で培養することができる。この方法を使用して、
非常に多数の細胞が、例えば、種々の細胞および遺伝子治療応用において使用す
るために単離することができる。

【０１１１】この実施例において開示されるデータは、低密度（例えば、約０．５〜約１０
細胞／ｃｍ²）においてＭＳＣを塗布することが、先行培養技術に較べて、ＭＳ
Ｃが分化を受けることなく経ることができる集団倍加数を増加することを例証す
る。結果として、分化可能なＭＳＣは、先行技術の培養／拡張方法を用いてでき
るよりもはるかに大きい程度に、培養において拡張することができる。

【０１１２】ＭＳＣの単離ＭＳＣを単離するために使用される操作は例１において記述された。簡単に言
えば、ヒト骨髄吸引物２０ｍｌが、局部麻酔下で年齢１９〜４９才にわたるヒト
のボランチアの１つまたは両方の腸骨稜から得られた。単核細胞（ＭＮＣ）は、
実施例１において記述されるように、フィコール勾配における遠心、培養および
非接着細胞の除去を含む標準操作を用いて単離された。この方法で得られたＭＳ
Ｃは、自動装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ）または血球計を用いてカウントされ、５％Ｄ
ＭＳＯおよび３０％ＦＣＳ中で徐々に凍結され、そして拡張操作において使用す
るまで液体窒素中で凍結保存された。

【０１１３】ＭＳＣの拡張次の操作が、ＭＳＣを拡張するために使用され、そして例としてドナー５９ＲＭＳＣを用いて、図８に具体的に説明される。種々の起源（例えば、異なるド
ナーから得られた吸引物および同じドナーから同時に得られた多数の吸引物）か
ら得られた細胞の比較では、細胞は、約５２８細胞が１ディッシュ当たりに塗布
されるように、１７６ｃｍ²培養皿中に塗布された。培地は、平均して３〜４日
毎に変えられた。細胞は、最初の塗布後１０および１４日目に収穫された。

【０１１４】第１培養継代（「継代１」）において拡張されたＭＳＣの数は、表２に示され
るように、骨髄吸引物の４種の異なるサンプルにおいて約１５２〜約３５０倍増
加した。

【０１１５】

【表２】

【０１１６】より大きい程度にＭＳＣを拡張するために、第１の培養継代において拡張され
たＭＳＣが、実施例１において記述されるように、０．２５％トリプシンおよび
１ｍＭＥＤＴＡを用いて収穫された。収穫された細胞は、約３細胞／ｃｍ²の始
発密度において再塗布され、そして同じ条件を用いて再培養された。ＭＳＣは、
再培養された第１継代細胞の数に比較して約３２２〜２，０８４倍の数で拡張し
、このことは、第１継代から得られた細胞がそれらの拡張性を保持していたこと
を示す。第２培養継代後に収穫されたＭＳＣは、さらに再培養された。第３培養
継代（表２における「継代３」）では、細胞は、再培養された第２継代細胞の数
に比較して約４３３〜１，４２０倍の数で拡張し、このことは、第２継代から得
られた細胞がそれらの拡張性を保持していたことを示す。第１および第２継代か
ら得られたＭＳＣのすべてが塗布された場合、細胞の最終収量は、起源に応じて
、約５ｘ１０¹³〜１．８ｘ１０¹⁴になったであろう。成人の身体における総細胞
数は、約１０¹³細胞と見積もられることを考えると、この方法は、治療操作を含
む種々の目的のために十分な細胞数以上を明らかに生じる。

【０１１７】さらに、１人のドナー（すなわち、ドナー１８）からのＭＳＣは、約３細胞／
ｃｍ²の同じ密度で塗布されたが、より高い数（すなわち、約１．８ｘ１０⁴細胞
）が、わずか５２８細胞の代わりにその密度で塗布された。１０日後、６ｘ１０ ⁶ ＭＳＣが回収され、このことは、ここに開示された方法が、多数の多能性幹細
胞を得るために成功裏に拡張できることを例証している。

【０１１８】培養においてＭＳＣを拡張するための先行技術は、約５，０００細胞／ｃｍ²
の密度で細胞を塗布し、次いで約２週間細胞を増殖させることを教えている。こ
の先行技術法は、ＭＳＣ細胞数の約３倍拡張を生じるだけである。

【０１１９】図１に示されるように、集密まで２回増殖されたすべての特定のＭＳＣのサン
プルから得ることができる集団倍加数は広く変化し、そして約４〜約１７集団倍
加にわたる。しかしながら、細胞は標準条件下の培養において継代されるにつれ
て、図３に示されるように、ＣＦＵの効率は低下する。さらにまた、ＭＳＣサン
プルにおいて検出されるＣＦＵの数が減少する（例えば、サンプルが培養におい
て継代される回数につれて）につれて、図６に示されるように、骨芽細胞または
脂肪細胞へ分化する細胞の潜在力もまた減少する。

【０１２０】この実施例に記述されるＭＳＣの培養法は、先行技術のＭＳＣ拡張法よりも大
きい程度まで培養においてＭＳＣが拡張されるのを可能にする。例えば、本発明
は、図８に示されるように、コロニーから増殖する細胞数を、各継代中に数百倍
増加させる。さらに、細胞倍加数は、図９に示されるように、先行技術の培養条
件に較べて３倍増加される。したがって、この実施例に記述されるＭＳＣ培養／
拡張法は、非常に多数のＭＳＣを生成させることができ、そして先行技術の培養
法よりも高いパーセンテージの分化可能な（すなわち、多能性の）細胞を含ませ
られる。この実施例に記述される方法を用いて生成されるＭＳＣの増強された拡
張性は、実施例１に記述されるアッセイを用いて検出できるＣＦＵ数が数回の継
代を通じて（特に、図１０に示されるように、細胞が１４日後よりむしろ１０日
後に収穫される場合には）高く留まるという事実によって証明される。

【０１２１】最初に低密度においてＭＳＣを培養することは、図１１に示されるように、最
初に高密度においてＭＳＣを培養することに較べて、比較的短期間に得ることが
できる細胞数を非常に増大する。低密度継代の適当な条件下で、そして十分量の
増殖表面と培地を用いることが、約１０¹⁴までの細胞を生成することができ、こ
の数はヒトの身体に存在する細胞数の約１０倍である。しかしながら、そのよう
な多数の細胞を作成することは、細胞を培養するのに大きい表面積を必要とする
ために、現在は技術的観点から実際的ではない。例えば、商品名ＣｅｌｌＦａ
ｃｔｏｒｙ^TM（Ｎｕｎｃ）として現在販売される一連の相互連絡する培養フラス
コを含む、比較的大きい表面積をもつ器具が使用することができるが、これは６
，０００〜２５，０００ｃｍ²の表面積を有する。もちろん、増殖表面の形態は
重要ではなく、そしてビーズ、繊維、スポンジなどを含めることができる。１０ ¹⁴ くらい多数の細胞数は、治療剤としてＭＳＣを使用するためには必要ではない
。何故ならば、ほとんどの治療目的（例えば、理論的に、約１０⁸ＭＳＣが、パ
ーキンソン病の治療のための神経移植において要求されるすべてである）のため
には、ずっと少ない細胞数が要求されるからである。また、培養においてＭＳＣ
を広範に拡張する能力は、他では不可能である遺伝子操作の実施を可能にさせる
。例えば、具体的には、哺乳動物細胞における内因性遺伝子が相同組み換えのメ
カニズムによって類似の外因性遺伝子によって置換することができる。しかしな
がら、相同組み換えは、培養において広く拡張され、したがって、内因性遺伝子
と外因性遺伝子の相同組み換えという頻度の小さい事象を受けた細胞クローンを
広範な選択にかけることができる細胞を必要とする。本発明は、そのようなＭＳ
Ｃの取り扱いを可能にさせる。

【０１２２】コロニーの形態に及ぼすプレーティング密度の影響が図１２Ａ−１２Ｅにおい
て示される。約０．５細胞〜約３細胞／ｃｍ²の密度において細胞を塗布するこ
とが、ＭＳＣを大コロニーとして増殖させることができる。６細胞／ｃｍ²では
、小コロニーのみが検出された。また、全コロニーに関して大コロニーのパーセ
ンテージは、低密度において塗布されたＭＳＣ中に検出される大コロニーのパー
センテージに較べて、６細胞／ｃｍ²において塗布されたＭＳＣにおいては極端
に減少した。また、１２細胞／ｃｍ²の代わりに３細胞／ｃｍ²におけるＭＳＣの
プレーティングは、図１３Ａ（１２細胞／ｃｍ²のプレーティング）および１３
Ｂ（３細胞／ｃｍ²のプレーティング）において示されるように、検出される大
コロニー数を増加させるのみならず、また培養皿から回収される全細胞数を約３
倍増加させる。ＭＳＣは、クリスタルバイオレットとともに塗布されたＭＳＣを
インキュベートし、ＭＳＣを洗浄し、そしてエタノールを用いてＭＳＣから染料
を抽出することによってカウントされた。エタノール染料抽出液の分光光度計ア
ッセイは、３細胞／ｃｍ²において細胞を塗布することによって得られた細胞数
が、１２細胞／ｃｍ²において細胞を塗布することによって得られた細胞数の約
３倍であった（すなわち、５８０ｎｍにおける染料抽出液の光学濃度（ＯＤ_580n _m ）は、それぞれ３および１２細胞／ｃｍ²で塗布された細胞について１２．２お
よび４．２であった）。したがって、低密度におけるＭＳＣのプレーティングは
、得られる全細胞数をより多くさせる。また、低密度において塗布されたＭＳＣ
は、より高いＣＦＵ効率を示す。

【０１２３】例３低い始発細胞密度において培養されたＭＳＣは１種以上の成長因子を生産する本明細書、例えば図１２において開示されるデータは、ＭＳＣが希薄なプレー
ティング（すなわち、約０．５〜約３細胞／ｃｍ²）後に増殖する速度は、ＭＳ
Ｃが培養基中に分泌する少なくとも１種の成分によって著しく影響されることを
開示している。図１２Ａ−１２Ｅでは、ＭＳＣは、０．５〜６細胞／ｃｍ²の選
ばれた始発細胞密度において塗布された。プレートは完全培地を用いて１２日間
インキュベートされ、次いでＰＢＳで洗浄された。プレート上の細胞はクリスタ
ルバイオレットとメタノールにより１０分間染色されてコロニーを可視化した。
図１２Ａ−１２Ｃに示されるように、始発密度０．５〜３細胞／ｃｍ²で塗布さ
れたＭＳＣは、多数の容易に可視化されるコロニーを生じた。ＭＳＣが始発細胞
密度６細胞／ｃｍ²（すなわち、図１２Ｄのように）で塗布された場合、ＭＳＣ
コロニーは小さく（すなわち、約１０−１００細胞）、そして容易には可視化で
きなかった。始発細胞密度６細胞／ｃｍ²で塗布されたコロニーから単離された
ＭＳＣは、さらに拡張することができなかった。さらに、図１２Ｆに示されるよ
うに、コロニーの大きさは始発細胞塗布密度と相関し、最小密度は最大（直径で
）コロニーを生じた。いかなる特定の操作理論によっても限定されなければ、Ｍ
ＳＣによって分泌される１種以上の成長因子が低濃度においては分裂促進性であ
るが、より高濃度ではコロニーの増殖を阻害できることが予想される。かくして
、培養中に１種以上のこれらの成長因子を希釈することによって、培養における
ＭＳＣの拡張を誘導することができるであろう。

【０１２４】始発細胞密度３細胞／ｃｍ²以下において塗布されたＭＳＣの拡張によって生
成されたＭＳＣが、小さい、顆粒性であるＭＳＣのサブ集団を代表することが観
察された。ＭＳＣのこの集団は、ＭＳＣの高密度（例えば、３０％集密）培養物
中には不在であり、そして始発細胞密度６細胞／ｃｍ²以上で塗布されたＭＳＣ
の拡張によって生成されたＭＳＣ中では有意に低下される。この観察は、蛍光標
示式細胞分取（ＦＡＣＳ）解析によって確認された。さらに、トリチウム化チミ
ジン取り込みが、始発細胞密度６細胞／ｃｍ²以上で塗布されたＭＳＣにおいて
阻害されることが観察された。

【０１２５】ＭＳＣの２つのサンプルが、約６，０００ｃｍ²の増殖表面をもつ細胞ファク
トリーにおいて、１つは始発密度約１２細胞／ｃｍ²において、他方は始発密度
５０細胞／ｃｍ²において塗布され、そしてこれらの２つのサンプルの細胞は、
２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有の完全培地１リットルの存在下で７日間の培養にお
いて拡張させられた。７日後、培養基が細胞から除去され、そして細胞が、リン
酸バッファー食塩水を用いて広く洗浄されて残留ＦＣＳと培地が除去された。細
胞は、血清不含の無機質必須培地−αにおいてさらに２４時間増殖された。この
培地（これ以降、「順化培地」と呼ばれる）が２つのサンプルから収穫され、−
２０℃において一定分量として保存され、そして続く実験で使用された。

【０１２６】各々２つのサンプルからの順化培地は、始発細胞密度３細胞／ｃｍ²で塗布さ
れ、そして選ばれた量の順化培地を補足された完全培地１０ｍｌの存在下で培養
された、ＭＳＣの増殖に及ぼす二相（ｂｉ−ｐｈａｓｉｃ）効果を媒介した。順
化培地１ユニットは、順化培地０．１ｍｌに相当すると定義された。図１４に示
されるように、完全培地１０ｍｌに対する順化培地１ユニットの添加は、ＭＳＣ
へのトリチウム化チミジンの取り込みにおける約３倍増加をもたらした。トリチ
ウム化チミジンは、主として新しく合成されるＤＮＡ中に取り込まれるので、２
４時間のトリチウム化チミジンの取り込みは、ＭＳＣが培養において複製しつつ
ある速度を直接反映する。より多量の順化培地の添加は、ＭＳＣの複製速度を減
少させた。かくして、順化培地中の１種以上の成長因子は、ヒトＭＳＣの増殖に
二相効果を有した。

【０１２７】図１６に示されるように、成長因子活性を示すクロマトグラフィーカラムから
のフラクション（すなわち、図１６における列２，５および６）は、各々、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルに適用された場合、分子量約３０，０００を示すタンパク質を
含有する。

【０１２８】いかなる特定の操作理論によっても限定されなければ、ＭＳＣによって分泌さ
れる成長因子は、低濃度においてはＭＳＣ増殖を刺激するが、多分、高い因子濃
度における１種以上の因子のレセプターの下方制御によって、または順化培地中
の多数の因子の存在によって、より高い濃度では増殖を阻害するのであろう。

【０１２９】順化培地中に存在する成長因子をさらに特徴付けるために、ＭＳＣは、先に記
述されたように、ＦＣＳを補足された無機質必須培地−αを含有する培地におい
て、始発細胞密度６０細胞／ｃｍ²で５日間培養された。５日後、この培地が培
養細胞から除去され、そしてＭＳＣは、血清不含の培地の存在下でさらに２４時
間培養されて順化培地を得た。この順化培地は、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグ
ラフィーによって分画された。

【０１３０】選ばれたＨＰＬＣ画分は、細胞が、始発密度１．５細胞／ｃｍ²で塗布された
試験プレート上で、ＭＳＣの増殖を刺激する能力について調査された。５日後、
選ばれたＨＰＬＣカラム画分が培養物に添加され、そして２４時間後に回収され
る細胞数が調べられた。画分番号１０（平均分子量約３０，０００をもつ分子を
含有する）は最大の増殖刺激活性を有した。画分番号１７（平均分子量約１０，
０００の分子を含有する）は細胞の増殖を阻害した。種々のＨＰＬＣ画分に対応
する活性が図１５に示される。

【０１３１】いかなる特定の操作理論によっても限定されなければ、ＭＳＣが培養において
増殖するにつれて、それらは、増殖培地中に１種以上の成長因子を分泌すると考
えられる。これらの因子の少なくとも１つはＭＳＣを刺激して、より急速に増殖
させる。培地中に分泌される刺激因子は分子量約３０，０００ダルトンをもつ。

【０１３２】例４ヒト骨髄からのプラスチック接着性細胞の培養における再循環幹細胞の急速拡張骨髄から得られるプラスチック接着細胞の培養は、それらの造血幹細胞の増殖
を支持する能力、それらの分化に対する多能性、およびそれらの細胞および遺伝
子治療のための使用の可能性のために、魅力的な興味を有する。この実施例にお
いて示される実験では、細胞が、単細胞由来のコロニーを生成するために、最初
に低密度（１．５または３．０細胞／ｃｍ²）で塗布された場合、それらはもっ
とも急速に増殖することが例証された。培養は、誘導期５日、急速増殖の対数期
約５日、次いで定常期を表す。ＦＡＣＳ解析は、定常期の培養物は、大きくそし
て中間の顆粒細胞（ｍＭＳＣ）の主集団および小さくそして無顆粒の細胞（ＲＳ
−１細胞）の小集団を含有した。誘導期の間に、ＲＳ−１細胞は、小さく、濃い
顆粒細胞（ＲＳ−２細胞）の新集団を生じる。後期誘導期の間に、ＲＳ−２細胞
は、数が減少し、そして定常期培養物において見いだされるＲＳ−１細胞のプー
ルを再生した。細胞が低密度において塗布される反復継代では、細胞は、６週目
に約１０⁹倍に増殖できる。細胞は、単細胞由来のコロニーを生成するそれらの
能力を保持し、したがって分化に対するそれらの多能性を明らかに保持していた
。

【０１３３】造血細胞のための幹細胞に加えて、骨髄は、非造血組織の前駆体である幹様細
胞を含有している（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９７６，Ｅｘ
ｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４：２６７−２７４；Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ
ｅｔａｌ．，１９８０，Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；Ｍｅｔｓｅ
ｔａｌ．，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｅｉｎｇＤｅｖ．１６：８１−８９；
Ｐｉｅｒｓｍａｅｔａｌ．，１９８５，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３：２
３７−２４３；Ｈｏｗｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈ
ｏｐｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，２１３，２５１−２６３；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅ
ｉｎｅｔａｌ．，１９８７，ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓ．Ｋｉｎｅｔｉｃ
ｓ２０：２６３−２７２；Ｏｗｅｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｉｎ：Ｃｅｌ
ｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔ
ｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ，ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐ．
，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ，ｐｐ．４２−６０，；Ｃａｐｌａｎ，１９９１
，Ｊ．ＯｒｔｈｏｐｅｄＲｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ，１９
９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４）。非造血組織の前駆体は、プラス
チック接着性細胞またはコロニー形成ユニット繊維芽細胞として（Ｆｒｉｅｄｅ
ｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９７６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４：２６７
−２７４；Ｈｏｗｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ
ｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，２１３，２５１−２６３；Ｏｗｅｎｅｔａｌ．，
１９８８，Ｉｎ：ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏ
ｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ，ＣｉｂａＦｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎＳｙｍｐ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ，ｐｐ．４２−６０）、
そして続いて間葉幹細胞（Ｃａｐｌａｎ，１９９１，Ｊ．ＯｒｔｈｏｐｅｄＲ
ｅｓ．９：６４１−６５０）または骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）として最初に
言及された。細胞は、造血幹細胞の増殖のためのフィーダー層として働くそれら
の能力、それらの分化に対する多・潜在力、およびそれらの両細胞および遺伝子
治療のための使用の可能性のために、魅力的な興味を有する（Ｃａｐｌａｎ，１
９９１，Ｊ．ＯｒｔｈｏｐｅｄＲｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ
，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７１−７４；Ｃｈｉａｎｇｅｔａｌ
．，１９９９，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１０：６１−７６；Ｈｏｒｗｉｔ
ｚｅｔａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．５：３０９−３１３８−
１１）。

【０１３４】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔ
ａｌ．，１９７６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４：２６７−２７４）は、それ
らの組織培養表面への接着性によってＭＳＣを最初に単離し、そして本質的に同
じ操作が、多くの後続研究者によって使用された（Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐ
ｉｎａｅｔａｌ．，１９８０，Ｂｌｏｏｄ５６：２８９−３０１；Ｍｅｔ
ｓｅｔａｌ．，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｅｉｎｇＤｅｖ．１６：８１−
８９；Ｐｉｅｒｓｍａｅｔａｌ．，１９８５，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１
３：２３７−２４３；Ｈｏｗｌｅｔｔｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｌｉｎ．Ｏ
ｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，２１３，２５１−２６３；Ｏｗｅｎｅｔ
ａｌ．，１９８８，Ｉｎ：ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ，Ｃｉｂａ
ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ，ｐｐ．４２
−６０，；Ｃａｐｌａｎ，１９９１，Ｊ．ＯｒｔｈｏｐｅｄＲｅｓ．９：６４
１−６５０；Ａｎｋｌｅｓａｒｉａｅｔａｌ．，１９８７，Ｅｘｐｅｒ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．１５：６３６−６４４；Ｂｅｒｓｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９
９２，Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１０２：３４１−３５１；Ｃｈｅｎｇｅｔａ
ｌ．，１９９４，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４：２７７−２８６；Ｃｌａｒｋ
ｅｔａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７０：７０
−７８；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｅｔａｌ．，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａ
ｔｏｌ．９７：５６１−５７０；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｅｔａｌ．，１９９７
，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎ．Ｒｅｓ．１２：１３３５−１３４７；Ｂｒｕｄｅｒ
ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２７８−２９
４；Ｗａｋｉｔａｎｉｅｔａｌ．，１９９５，ＭｕｓｃｌｅＮｅｒｖｅ
１８：１４１７−１４２６、参照）。単離された細胞は、それらが、培養におい
て、またはイン・ビボの移植後に、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞および筋管へ
と分化する多能性であることが示された。ＭＳＣの全身的注入後に、細胞の子孫
が、骨（Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：４８５７−４８６１；Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａ
ｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１
４２−１１４７；Ｈｏｕｅｔａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：７２９４−７２９９；Ｎｉｌｓｓｏｎｅｔａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ８９：４０１３−４０２０）、軟骨（Ｐｅｒｅｉｒａｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：
４８５７−４８６１；Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１４２−１１４７）、肺（Ｐｅｒ
ｅｉｒａｅｔａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ９２：４８５７−４８６１；Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．，１９９８
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１４２−１１４７
；Ｋｅａｔｉｎｇｅｔａｌ．，１９９６，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２
４：１０５６，Ａｂｓ．１８０）、脾臓（Ｋｅａｔｉｎｇｅｔａｌ．，１９
９６，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：１０５６，Ａｂｓ．１８０）、およ
び胸腺（Ｋｅａｔｉｎｇｅｔａｌ．，１９９６，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．２４：１０５６，Ａｂｓ．１８０）を含む、種々の組織において現れた。ま
た、ドナーＭＳＣの修復筋肉への移植が、いずれか局所注射または全身的注射後
に観察された（Ｆｅｒｒａｒｉｅｔａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
７９：１４５６，１５２８−１５３０）。ジストロフィン欠失マウスの筋肉への
移植は、ＭＳＣの前駆体である「サイドポピュレーション（ｓｉｄｅｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎ）」またはＳＰ細胞として定義される希少骨髄細胞の全身的注入後
に見られた（Ｇｏｏｄｅｌｌｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２
：１３３７−１３４５；Ｇｕｓｓｏｎｉｅｔａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒ
ｅ４０１：３９０−３９３）。

【０１３５】さらに、ＭＳＣまたは関連細胞が、中枢神経系に移植することが示された。ド
ナー由来の星状細胞の存在が、免疫不全マウスへの全骨髄の注入後に観察された
（Ｅｇｌｉｔｉｓｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４０８０−４０８５）。ラットの脳底神経節への直接注
入後、いずれかラットまたはヒトＭＳＣは、多くの骨髄幹細胞の性質をもつ側脳
室星状細胞に類似の様式で組み込まれ、移動した（Ａｚｉｚｉｅｔａｌ．，
１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３９０８−
３９１３）。マウスＭＳＣが新生マウスの側脳室域に注入された後、若干の細胞
は星状細胞に分化した（Ｋｏｐｅｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１０７１１−１０７１６）。他の細胞はニューロ
ンに富む領域に現れ、そして多分ニューロンに分化した（Ｋｏｐｅｎｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１０７１１−１
０７１６）。骨髄と中枢神経系間の細胞の相互交換性についての可能性は、また
、神経幹細胞が、骨髄剥離を受けたマウスにおける造血系を再構築できるという
観察によって強調された（Ｂｊｏｒｓｏｎｅｔａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２８３：５３４−５３７）。

【０１３６】大きなＭＳＣに関する関心にもかかわらず、培養における細胞の単離および拡
張については、まだ十分定められた方法が存在しない。ほとんどの実験は、Ｆｒ
ｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．によって記述されたように、最初に、組織
培養皿への強い接着によって単離されるＭＳＣの培養を用いて実施された（Ｆｒ
ｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９７６，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４
：２６７−２７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅ
ｌｌａｎｄＴｉｓｓ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６３−２７２）。数グル
ープの研究者らは、より均一な集団を調製する方法を開発した（Ｌｏｎｇｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：８８１−８８７；Ｓ
ｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ７８：５５−６２；Ｗａ
ｌｌｅｒｅｔａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ８５：２４２２−２４３５；
Ｒｉｃｋａｒｄｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｎｅｒ．Ｒｅ
ｓ．１１：３１２−３２４；Ｇｒｏｎｔｈｏｓｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．
Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．５：１５−２３；Ｊｏｖｎｅｒｅｔａｌ．，１９９
７，Ｂｏｎｅ２１：１−６；Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．
ＢｏｎｅＭｉｎｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４：１３４５−１２５６）が、これらの方
法のいずれも広く受け入れられなかった。

【０１３７】この実施例において示される実験では、小さくて、急速に増殖し、細胞が再塗
布された場合循環再生に耐え、そして同じ培養においてより成熟した細胞の前駆
体であるＭＳＣを含む、ＭＳＣの培養における細胞のサブ集団が同定される。こ
れらの細胞は、ここでは、再循環幹細胞（ＲＳ細胞）と呼ばれる。さらに、ＲＳ
細胞が、６週において約１０⁹倍増幅できる条件が、この実施例で定義される。

【０１３８】この実施例で示される実験において使用される材料および方法が、ここに記述
される。

【０１３９】ｈＭＳＣの単離および培養ヒトＭＳＣは、記述（ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｂｒ
．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０７：２７５−２８１）されるように、年齢１９〜
４９才にわたる正常なドナーの腸骨稜から得られた吸引物２０ｍｌから得られた
。数人のドナーについて、２並列サンプルが左右の腸骨稜から同じ場合に得られ
た。吸引物の各２０ｍｌは、ハンクス液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ）を用いて１：
１希釈され、そしてフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）約１０ｍｌの上に重層された。２５００ｘｇにおいて３０分間遠心後、単核
細胞層が界面から除去され、そしてハンクス液に懸濁された。細胞は１５００ｘ
ｇで１５分間遠心され、そして完全培地（最小必須培地；デオキシリボヌクレオ
チドもしくはリボヌクレオチド（Ｇｉｂｃｏ）を含まないアルファ培地；ＭＳＣ
の急速増殖のためにロット−選択された２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ａｔｌａ
ｎｔａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）；１００単位／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ
）、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）；および２ｍＭＬ−
グルタミン（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁された。全細胞は、１７６ｃｍ²培養皿（
Ｎｕｎｃ）中培地約２０ｍｌに塗布され、そして湿潤５％ＣＯ₂とともに３７℃
において培養された。２４時間後、非接着細胞が廃棄され、そして接着細胞は、
ＰＢＳを用いて２回激しく洗浄された。新鮮な完全培地が添加され、そして約１
４日間３〜４日毎に置換された。

【０１４０】細胞は、３７℃で５分間、０．２５％トリプシンおよび１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉ
ｂｃｏ）によって収穫され、７５ｃｍ²プレート中に再塗布され、再び約１４日
間培養され、そして収穫された。完全培地約８ｍｌが、トリプシン処理された細
胞と混合されてトリプシンを失活させ、そして細胞が、自動装置（Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ）または血球計を用いてカウントされた。細胞は、遠心によって再回収され、
５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳ中濃度１−２ｘ１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁され
た。一定分量各約１ｍｌが徐々に凍結され、そして液体窒素中で保存された。各
凍結保存物１〜２分量が、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）についてアッセイさ
れた（ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａ
ｔｏｌ．１０７：２７５−２８１）。１００細胞当たりのＣＦＵの値は１２〜４
２の範囲であった。細胞密度を変えて培養物を増殖するために、ＭＳＣの凍結保
存物は３７℃で融解され、完全培地で希釈され、そして遠心によって回収してＤ
ＭＳＯを除去した。細胞は培地に懸濁され、そして約５，０００細胞／ｃｍ²に
おいて塗布された。約１日間培養後、非接着細胞が除去され、接着細胞がＥＤＴ
Ａ／トリプシンを用いて収穫され、狭められたパスツールピペットを通過させる
ことによって崩壊され、カウントされ、そして７９ｃｍ²プレートにおける培地
１０ｍｌにおいて指定された密度で再塗布された。

【０１４１】ＦＡＣＳ解析培養ＭＳＣがＥＤＴＡ／トリプシンを用いて脱離され、濃度２０，０００〜１
００，０００細胞／ｍｌにおいてＰＢＳ０．５ｍｌ中に懸濁され、そして流動細
胞計（ＦＡＣｓｏｒｔ；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）においてアッセイ
された。表面エピトープを同定するために、大サンプルが、組織培養フラスコ（
６，０００ｃｍ²；ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ，Ｎｕｎｃ）相互連結システムに
おいて、培地１リットルにおいて密度３細胞／ｃｍ²において、約１８，０００
ＭＳＣを塗布することによって調製された。細胞は６日間培養され、次いでＥＤ
ＴＡ／トリプシンを用いて収穫された。細胞は、ＰＢＳ中で遠心によって洗浄さ
れ、そして濃度約１００，０００／ｍｌにおいてＰＢＳ中に再懸濁された。細胞
は、１％メタノールまたはアセトン中で４℃で１０分間固定され、そしてＰＢＳ
で洗浄された。非特異的抗原は、１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＦＣＳおよ
び０．１％ヤギ血清において室温で１時間、細胞をインキュベートすることによ
ってブロックされた。細胞は３倍量のＰＢＳ中で遠心によって洗浄され、そして
細胞ペレットは、抗体２０μｇ／ｍｌ、１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％
ヤギ血清を含有する１次抗体溶液０．５ｍｌ中に懸濁された。４℃で４０分間イ
ンキュベートされた後、細胞はＰＢＳにおいて洗浄された。１次抗体は、マウス
抗ヒトであり、そして次の起源から得られた：ＣＤ９０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；
ＣＤ１１７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ標識；Ｃｈｅｍｉｃｏ
ｎ）；ＣＤ３８（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；Ｓｔｒｏ−１（ＩｇＭＨｙｂｒｉｄｏ
ｍａＢａｎｋａｔｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｏｗａ）；Ｃ
Ｄ４５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ＣＤ３１（Ｂｉｏｍｅｄａ）；ＣＤ３４（Ｓ
ａｎｔａＣｒｕｚ）およびＣＤ４３。イソタイプコントロールのために、非特
異的マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）が、１次抗体と置換された。検出のため
に第２抗体を要する抗体では、細胞ペレットが、ＦＩＴＣで標識された抗マウス
ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とともに２０分間同じ条件下でインキュベート
された。次いで、細胞は、ＰＢＳ中で洗浄され、そしてＦＡＣＳ解析のためにＰ
ＢＳ１ｍｌ中に懸濁された。

【０１４２】この実施例において示された実験結果がここに記述される。

【０１４３】ＭＳＣの拡張に及ぼすプレーティング密度の影響注目されたように（例えば、例３参照）、ヒトＭＳＣは、ＣＦＵのために低密
度で塗布された場合に単細胞由来のコロニーを形成する。この実施例で示される
実験では、プレーティングの密度を０．５〜１２細胞／ｃｍ²に変えた場合、塗
布された１００細胞当たり形成されるコロニー数は一定のままであることが観察
された。しかしながら、コロニーの大きさは、細胞が、より高い密度で塗布され
た場合、極端に減少することが観察された。最大の大きさをもつコロニーは、図
１７において示されるように、細胞が骨髄吸引物のほとんどの保存サンプルから
のＭＳＣを用いて１．５〜３．０細胞／ｃｍ²で塗布された場合に得られた。コ
ロニーは、６または１２細胞／ｃｍ²で塗布された場合、比較的小さかった。コ
ロニーの大きさは、培地を隔日または１０日後に交換することによって影響され
なかった。しかしながら、コロニーの大きさが減少するにつれて細胞の収量は減
少した。細胞が低密度１．５〜３．０細胞／ｃｍ²で塗布された場合、図１８Ａ
に示されるように、細胞は約１０日間に２，０００倍まで拡張した。これに対し
て、１２細胞／ｃｍ²で塗布された細胞は、約６０倍に拡張しただけであった。
低密度で塗布された場合、細胞は、典型的には、３つの増殖期：誘導期、急速増
殖の対数期および定常期を示した（図１８Ａ、参照）。対数増殖期の間、低密度
で塗布された細胞は、２４時間当たり平均約２回倍加された、すなわち、図１８
Ｂに示されるように、約１２時間の倍加時間。１．５細胞／ｃｍ²の代わりに、
細胞が６細胞／ｃｍ²で塗布された場合、もっとも急速な増殖は８日目に代わっ
て６日目においてであった。細胞が１２細胞／ｃｍ²で塗布された場合、図１８
Ｂに示されるように、倍加時間は、培養期間をとおして約２４時間に低下された
。

【０１４４】始原細胞のサブ集団の同定ＭＳＣの定常培養物から得られた細胞は、ＦＡＣＳによる前方光と側方光散乱
によって大きさおよび顆粒性についてアッセイされた。２種の細胞集団が、図１
９Ａに示されるように、定常培養物において検出することができた。しかしなが
ら、小さい、無顆粒の細胞の小集団が存在した。ヨウ化プロピジウムによる染色
は、両集団中の細胞の約９８％が生存していることを例証した。細胞周期特異抗
原Ｋｉ−６７による染色は、小さい、無顆粒細胞は細胞周期に存在しないが、比
較的大きい細胞は細胞周期に存在することを示した。大、小細胞の類似パターン
は、１２細胞／ｃｍ²で塗布され、そして５日後に検査された培養物により観察
された。しかしながら、異なるパターンは、１．５〜３．０細胞／ｃｍ²で塗布
され、そして５日後に検査された培養物では見られなかった。これらの細胞の約
１３％は、小さく無顆粒の細胞であったが、小さい顆粒細胞の新しいサブ集団は
、図１９Ｂに示されるように、総集団の約３０％であった。Ｋｉ−６７による染
色は、小さい顆粒細胞が細胞周期において存在することを例証した。便宜的に、
再循環幹細胞−１（ＲＳ−１）を小無顆粒細胞、再循環幹細胞−２を小顆粒細胞
、そして成熟ＭＳＣ（ｍＭＳＣ）を大、中顆粒細胞と言及した。

【０１４５】結果が図１９に示された実験からのデータの図表示は、図２０に示されるよう
に、ＲＳ−２細胞が最初に出現し、そして誘導期の間に拡張したことを示した。
対数増殖期の間に、ＲＳ−２細胞は数が減少し、そしてｍＭＳＣが急速に拡張し
た。後期対数期の間には、ＲＳ−２細胞は消失し、そしてＲＳ−１細胞が拡張し
た。

【０１４６】ＲＳ細胞とＣＦＵとの間の相関関係図１９および２０におけるデータは、培養物におけるもっとも早期の始原細胞
がＲＳ−１およびＲＳ−２細胞であることを示した。したがって、ＭＳＣのいず
れかのサンプルにおけるＲＳ−１およびＲＳ−２の数は、ＣＦＵアッセイにおい
て単細胞由来コロニーを生成する細胞数を反映するにちがいない。図２１に示さ
れるように、ほぼ直線関係が、一連のサンプルについて得られたＲＳ細胞の数と
ＣＦＵ値の間に観察された（ｒ²＝０．９５，ｐ値＝０．００１）。さらに、プ
ロットの傾斜は０．８２±０．９６Ｓ．Ｄ．であった。したがって、結果は、各
ＲＳ細胞が平均効率約８２％でコロニーを形成したことを示した。また図２１に
示されるように、ＣＦＵと総細胞数（ＲＳ−１プラスＲＳ−２）との間に同じ関
係が、プレーティング後の種々の時間における同じ培養物から得られたサンプル
を用いて観察された。例えば、１つの培養物が５日目および１２日目にアッセイ
された。５日目には、全１００細胞の約４８がＲＳ細胞であり、そして約４２コ
ロニーが形成された。１２日目では、１００細胞当たり約１２がＲＳ細胞であり
、そして約１２コロニーが形成された。５日目におけるＲＳ細胞のほとんどはＲ
Ｓ−２細胞であり、そして１２日目におけるＲＳ細胞のほとんどはＲＳ−１細胞
であったので、結果は、両集団が単細胞由来コロニーを生成したことを示してい
る。

【０１４７】細胞培養物のエピトーププロフィルＭＳＣの培養物における全細胞は、表３に示されるように、ＣＤ３４、早期造
血幹細胞のマーカーについて一貫してネガティブであった。また、それらは、造
血細胞の他のマーカー（ＣＤ１１Ｂ，ＣＤ４３，ＣＤ４５）についてもネガティ
ブであった。全３種の細胞タイプの少数（１０％以下）は、内皮細胞マーカーＣ
Ｄ３１についてかすかにポジティブであった。また、少数は、ＣＤ３８、Ｂリン
パ球、そして若干の胸腺細胞、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞およびマクロファージのマ
ーカーについてかすかにポジティブであった。ｍＭＳＣは、造血幹細胞マーカー
ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）についてかすかにポジティブであったが、ＲＳ−１お
よびＲＳ−２細胞はネガティブであった。既に報告されたように（４１）、ｍＭ
ＳＣは、Ｓｔｒｏ−１、骨形成ＭＳＣのマーカー（３５）について中等度にポジ
ティブであった。しかしながら、ＲＳ−１およびＲＳ−２細胞は、Ｓｔｒｏ−１
についてネガティブであった。３種の細胞サブ集団におけるエピトープにおける
１つの顕著な相違は、ｍＭＳＣが、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、胸腺細胞および末
梢Ｔリンパ球のマーカーについてポジティブであることであった。ＲＳ−１細胞
は、かすかにポジティブであったが、ＲＳ−２細胞はネガティブであった。

【０１４８】

【表３】

【０１４９】低密度におけるプレーティングによるＭＳＣの広い拡張低密度におけるＭＳＣのプレーティングは培養物の急速な増殖を促進したので
、細胞が低密度での反復継代により培養において拡張できる程度が試験された。
１つの実験では、細胞は低密度において塗布され、大きいコロニーが、クローニ
ングリングによりプレートから単離され、そしてコロニー中の細胞が低密度にお
いて再塗布された。操作は、最大コロニーからの細胞のみが継代されるように繰
り返された。図２２に示されるように、細胞は、約５０集団倍加をとおして増殖
を継続された。これに対して、類似のＭＳＣサンプルが高密度において継続され
た場合、細胞は約１５倍加後に増殖を止めた。

【０１５０】実験の第２シリーズでは、ＭＳＣの数サンプルが低密度において継代されたが
、ここで用いられた方法は、培養物からの全細胞がＥＤＴＡ／トリプシンを用い
て収穫され、そして一定分量が次の継代のために３．０細胞／ｃｍ²で再塗布さ
れる、より慣用的方法である。操作は３継代全部について繰り返された。細胞の
拡張倍数は、表４に示されるように、１４日の単一継代の間に約１５０倍〜２，
０００倍以上まで変化した。２人のドナーからの別々の４サンプルを用いて、１
継代当たりの平均拡張倍数は６００倍、したがって、６週間の３継代にわたって
約２ｘ１０⁹倍であった。各継代からの全細胞が塗布された場合、１０¹³ＭＳＣ
以上が、各吸引サンプル２０ｍｌから得られるであろう。第３継代の終わりの平
均ＣＦＵパーセントは、サンプルについての始発時の値とほぼ同じ（２８％対３
３％）であった。したがって、また、ＣＦＵ細胞の累計収量は約１０¹³であった
。

【０１５１】

【表４】

【０１５２】註： ¹⁾ サンプルは、正常なボランティア２人（５８および５９）から同時に得ら
れた骨髄吸引物、右腸骨稜から各１（５８Ｒおよび５９Ｒ）、そして左腸骨稜か
ら各１（５８Ｌおよび５９Ｌ）であった。吸引物の各々は、１．２〜２．７ｘ１
０⁷有核細胞が得られた約２０ｍｌであった。有核細胞は、初期継代ＭＳＣの凍
結保存物を得るために高密度で塗布された（本文参照）。

【０１５３】 ²⁾ 各継代では、５３０ＭＳＣが、平均塗布密度３．０細胞／ｃｍ²において
１７６ｃｍ²プレートに塗布された。培養物は１４日間培養され、ＥＤＴＡ／ト
リプシンを用いて収穫され、次いで一定分量５３０細胞が密度３．０細胞／ｃｍ ² において再塗布された。

【０１５４】 ³⁾ 凍結保存物からの全ＭＳＣおよび各継代が３．０細胞／ｃｍ²において再
塗布される場合のＭＳＣおよびＣＦＵの累計総数。

【０１５５】多数の従来の報告は、ＭＳＣが、組織培養表面において接着および増殖するそ
れらの傾向を利用することによって、培養において比較的容易に拡張できること
を例証した（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，１９７６，Ｅｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．４：２６７−２７４；Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．
，１９８７，ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ２０：２６３−
２７２；Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７７０：７０−７８；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｅｔａｌ．，１９９７，Ｂ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９７：５６１−５７０；Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎ．Ｒｅｓ．１２：１３３５−１３４
７；Ｂｒｕｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６４：２７８−２９４）。若干の種および株依存の差異が見られる。特に、数株
からのマウスＭＳＣは、増殖が難しく、しばしば、造血前駆体によって汚染され
ている（Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７７０：７０−７８；Ｐｈｉｎｎｅｙｅｔａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：５７０−５８５）。反対に、ヒトＭＳＣは、増
殖が比較的容易であり、そして２または３継代後、ほとんど造血前駆体不含にな
る。しかしながら、従来の報告では、ヒトＭＳＣは、５，０００細胞／ｃｍ²と
いう比較的高密度でのプレーティングによって継代され、そして細胞が約２週に
わたって集密まで増殖して３〜５倍拡張した（Ｂｒｕｄｅｒｅｔａｌ．，１
９９７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２７８−２９４）。この実施例
において例証されたように、ヒトＭＳＣは、それらが極端な低密度１．５または
３．０細胞／ｃｍ²において塗布された場合、一層劇的な様式で増殖する。より
低密度では、培養物は２週内に平均６００倍拡張した。ある継代では、１２日内
に２，０００倍までの拡張が観察された。

【０１５６】培養におけるＭＳＣの急拡張は、小細胞の小集団の存在に依存することが見い
出された。従来の報告は、ヒトＭＳＣの培養物が均一であるか否かに関しては矛
盾する主張をした。あるものは、細胞が、形態および表面エピトープのような数
種の他の基準によって均一であることを示した（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒｅｔａ
ｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：１４３−１４７）。しかしながら、
多くのものは不均一性を強調した。特に、ＭｅｔｓａｎｄＶｅｒｄｏｎｋ（
Ｍｅｔｓｅｔａｌ．，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖ．１６：８
１−８９）は、彼らがタイプＩＩ細胞と呼ぶ大きい、偏平な細胞、および彼らが
タイプＩ細胞と呼ぶ小さい、紡錘型細胞の存在を強調した。タイプＩＩ細胞は、
非常に遅く増殖し、そしてタイプＩは、より急速に増殖した。本明細書では、Ｆ
ＡＣＳ解析は、ＭＳＣの定常培養物は、本明細書でｍＭＳＣと呼ばれる大きい細
胞の主集団と、小さい顆粒細胞（ＲＳ−１細胞）の小集団を含有することを例証
した。低密度での培養物の再塗布後、小さい顆粒状ＲＳ−２細胞の新しい集団が
現れた。対数増殖期の間に、ｍＭＳＣの集団は急速に拡張し、ＲＳ−２細胞は数
が低下し、そしてＲＳ−１細胞が増加した。ＭｅｔｓａｎｄＶｅｒｄｏｎｋ
（Ｍｅｔｓｅｔａｌ．，１９８１，Ｍｅｃｈ．ＡｇｉｎｇＤｅｖ．１６：
８１−８９）および他の研究者（Ｐｒｏｃｋｏｐ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７６：７１−７４）によって注目されたように、ｍＭＳＣは、培養物が老化に
達するにつれて、ゆっくり分割し、そして優勢な細胞になる比較的成熟した細胞
である（ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏｅｔａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔｏｌ．１０７：２７５−２８１）。

【０１５７】本明細書でなされた観察のもっとも単純な説明は、ここでＲＳ−１細胞と呼ば
れた細胞が誘導期の間にＲＳ−２細胞を生成し、ＲＳ−２細胞が対数期の間にｍ
ＭＳＣを生じ、次いでＲＳ−２細胞が後期対数期にＲＳ−１細胞を生成すること
である。この説明は図２３に図示される。ここでの観察または主張はこの理論の
正確さには依らないけれども、この連続する事象は、培養中に細胞が出現し、消
失する時間経過、ならびにＲＳ細胞数と、単細胞由来のコロニーを生成できる同
じサンプル中の細胞数との間の直線関係と両立する。

【０１５８】ヒトＭＳＣの培養物中の幹細胞様細胞が容易に拡張できることは、造血幹細胞
を拡張する際に遭遇する難しさ（Ｇｌｉｍｍｅｔａｌ．，１９９９，Ｂｌｏ
ｏｄ９７：２１６１−２１６８）、ならびに神経始原細胞が培養において拡張
する比較的遅い速度（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｅｔａｌ．，１９９９，Ｅｘｐ．
Ｎｅｕｒｏｌ．１５８：２６５−２７８）とは著しい対照を示している。培養に
おいてヒトＭＳＣを急拡張できることは、細胞および遺伝子治療のために細胞を
使用する上に重要である（Ｃａｐｌａｎ，１９９１，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐｅｄ．Ｒ
ｅｓ．９：６４１−６５０；Ｐｒｏｃｋｏｐ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７
６：７１−７４）。ここに開発された条件下で、局部麻酔下で得られた単一の骨
髄吸引物は、約１０¹³細胞、成人の身体における総細胞数に達する数、を生成す
ることができる。特に重要なのは、細胞の広範な拡張後に、ＣＦＵの数が変わら
ずに留まることである。ＣＦＵ数は、両骨芽細胞または脂肪細胞へ分化する細胞
の能力に密接に相関することが既に示されている（ＤｉＧｉｒｏｌａｍｏｅｔ
ａｌ．，１９９９，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０７：２７５−２８１）
。したがって、結果は、拡張された細胞がそれらの多能性を維持していることを
示唆する。

【０１５９】例５非ＲＳｍＭＳＣからＲＳ細胞の分離ＲＳ細胞は、少なくとも２つの異なる方法を用いて非ＲＳｍＭＳＣから分離す
ることができる。ＲＳ細胞は、既知の方法を用いる傾瀉によって非ＲＳｍＭＳＣ
から分離できる。ＲＳ細胞は、限外濾過によって他のｍＭＳＣから分離すること
ができる。ＲＳ細胞は非ＲＳｍＭＳＣより小さいので、それらは、適当な孔径を
もつ限外濾過膜を通過できる。そのような膜の例は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製１０
μｍ等孔径ポリカーボネート膜である。有意に１０μｍ超の大きさをもつ粒子か
ら有意に１０μｍ未満の大きさをもつ粒子を分離するいかなる他の方法も、実質
的に、非ＲＳＭＳＣからＲＳＭＳＣを分離するために使用できることが期待
される。ＭＳＣの調製物をそのような限外濾過膜を通過させることによって得ら
れた結果は図２４に示される。

【０１６０】結果が図２４に示される実験では、ＭＳＣの凍結保存物が３７℃で融解され、
完全培地で希釈され、そして遠心によって回収してＤＭＳＯを除去した。細胞は
培地に懸濁され、そして約５，０００細胞／ｃｍ²において塗布された。塗布さ
れた細胞を約１日間培養後、非接着細胞が除去され、そして接着細胞がＥＤＴＡ
／トリプシンを用いて収穫された。これらの細胞は、狭められたパスツールピペ
ットを通過させることによって崩壊され、次いでカウントされた。細胞は、セル
ファクトリー表面１ｃｍ²当たり約１コロニー形成細胞を得るために、ＣＦＵア
ッセイから得られた値を用いて調整される密度約３細胞／ｃｍ²においてセルフ
ァクトリー装置に塗布された。細胞は完全培地１リットル中で増殖されたが、培
地は３−４日毎に置換された。細胞は、３７℃で５分間、０．２５％トリプシン
および１ｍＭＥＤＴＡを用いて収穫され、次いで、それらを２０％αＭＥＮ中に
再懸濁することによって洗浄され、そして遠心された。ＲＳ−１およびＲＳ−２
細胞は、２０％αＭＥＮ中に濃度約１０⁶細胞／ｍｌにおいて細胞を再懸濁する
ことによって他のＭＳＣから分離された。この細胞懸濁液は、１０μｍ等孔径ポ
リカーボネート膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて限外濾過され、そ
してＲＳ−１およびＲＳ−２細胞が濾液中に得られた。濾液は同型の膜を用いて
２回目の限外濾過をされ、そして第２濾液中の細胞が遠心によって回収された。
第２濾液および他のサンプル中の細胞の均一性はＦＡＣＳを用いて解析され、そ
してこの解析の結果が図２４に示される。これらの結果は、１つのサンプル（図
２４の上図）が約８６％のＲＳ−１細胞からなり、そしてその他のサンプルが約
８６％の非ＲＳｍＭＳＣからなることを示す。細胞の総回収率は約７０％であっ
た。

【０１６１】例６外因性遺伝子を用いるヒトおよびラットＭＳＣのトランスフェクションそれらの記述（Ｍａｔｔｅｗｓｅｔａｌ．，１９９５，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ４８：２７３−２８０）からやや改変された条件を用いて、ヒトＭＳ
Ｃが、ｌａｃＺ遺伝子の発現がＣＭＶプロモーターによって作動される線状ＤＮ
Ａ構築物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したベクターｐＣＩ−ｎｅｏ、この中
に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐβＧａｌ−ＣｏｎｔｒｏｌベクターのＣＭ
Ｖ−ｌａｃＺカセットがクローン化された）を使用してエレクトロポレーション
された。約１０−２０％のＭＳＣがトランスフェクションされた。図２５に示さ
れるように、ｌａｃＺを発現した１０⁶個以上の安定なＧ４１８耐性細胞がそれ
から生成された。

【０１６２】これらの結果は、エレクトロポレーションがＭＳＣ中に外因性遺伝子を導入す
るために使用できることを例証している。かくして、この操作が、ウイルスベク
ターを用いて実施されるトランスフェクションに対する代替法として使用できる
。ＭＳＣは非常に急速に、容易に、そして広く拡張することができるので、この
結果は、外因性遺伝子（例えば、ＭＳＣがなることができるタイプの細胞におい
て生じる遺伝子の異常コピーを置換するための外因性正常遺伝子）を用いてエレ
クトロポレーションされたＭＳＣのクローンが、患者の細胞における同じ遺伝子
の異常コピーの代わりに遺伝子の正常コピーが挿入された（例えば、相同組み換
えによって）細胞を生成するために使用できることを示す。患者にそれらの細胞
を提供する前に相同組み換えを受ける１種以上のＭＳＣを単離するために、本質
的に、二重選択が使用できる。かくして、ゲノム中に無作為に組み込む（または
全くゲノム中に挿入されない）ウイルスまたはウイルスベクターの使用が回避で
きる。これは、遺伝子療法における大きな進歩を表す。ゲノム中に組み込まない
ベクターは、一般に、時間の経過とともに失われる。ゲノムへのベクターの任意
の組み込みは、正常な遺伝子または制御機構が破壊し、併発症をもたらす危険性
を有する。相同組み換えが検出されるエレクトロポレーションされたＭＳＣの使
用はこれらの欠点を排除する。

【０１６３】例７ＭＳＣを用いる生物工学の例本明細書に記述される方法は、急速かつ確実に、多数のＭＳＣを生産するため
に使用できるので、従来、非実用的か、または不可能な生物工学の高等技術が、
ここに可能になる。例えば、多数のＭＳＣは、本明細書に記述されるように生成
され、そして分化（すなわち、すべての種々の既知の方法を用いて）されて、微
視的または巨視的組織部分を置換できる細胞を形成することができる。例えば、
ＭＳＣは、既知の方法を用いて軟骨細胞になるように誘導することができる。そ
のような細胞は、単独で、またはすべての種々既知の天然もしくは人工の組織支
持材料（例えば、コラーゲンに基づく材料）中に組み入れられて使用され、外科
操作、例えば顔（または適当に分化された細胞を用いて他の器官）の再形成手術
または関節の再構築もしくは再表面形成において、軟骨組織を置換するか修復す
るために使用することができる。さらに、例えば、ＭＳＣはイン・ビボで拡張さ
れ、１種以上の骨細胞タイプ（例えば骨芽細胞）になるよう誘導されてもよい。
骨細胞（場合によっては、ＭＳＣの小または大部分と混合されて、そしてまた場
合によっては支持材料と混合されたままで）は、骨傷害の部位（例えば、骨折部
位または骨が外科的に除去された部位）に提供されて、新しい骨の形成と、それ
による骨傷害の緩和を誘導することができる。また、そのような細胞は、骨に接
触する人工器官（例えば、股人工器官）における皮膜内または孔（または他の腔
）内に移植されてもよい。人工器官内の、またはそれに結合されるそのような細
胞の存在は、用具の耐久性および受容性を含む、人工器官への患者の骨のより強
固な結合を誘導する。例えば、そのような細胞は、股の人工器官の幹（ｓｈａｆ
ｔ）における腔の表面上または内部に組み入れることができる。患者の大腿骨内
の幹の挿入は、患者の大腿骨と細胞を結合させる。患者の大腿骨と人工器官の幹
とを結ぶ空間における骨細胞（および場合によっては骨細胞になるように誘導さ
れるＭＳＣ）の存在は、幹と結合できる骨の形成（すなわち、幹のＭＳＣ含有皮
膜と結合させることによって）、または患者の大腿骨から幹内の腔の内部に伸び
る連続する骨の形成を誘導する。そのような骨の形成は、より確実に、不可逆的
に骨を大腿骨に結合させ、大腿骨人工器官の脱離の発生を減少させる。

【０１６４】例８ＲＳ細胞の単離および特性決定のためのさらなる方法本明細書の他項で記述されるように単離されたＲＳ細胞は、次のようにさらに
特性決定された。

【０１６５】ＲＳ細胞および成熟ＭＳＣの集団が、図２６に示されるように、種々の抗体と
反応する能力についてアッセイされた。図２６に示されるデータは、ＲＳ細胞の
特性決定についてさらなる基準を提供する。ＲＳ−１細胞および成熟ＭＳＣが、
また、顕微鏡的に特性決定され、そして結果が図２７Ａ−Ｄに示されるが、ここ
ではこれらの細胞の形態学的同定が明らかになる。

【０１６６】さらに、タンパク質が、ＭＳＣに富んでいる培養物から抽出され、そして二次
元ゲルにおいて調査された。この実験の結果が図２８Ａおよび２８Ｂにおいて示
され、ここでは、ＲＳ細胞に富んでいる培養物、およびかなり少ないＲＳ細胞と
比較的多い成熟ＭＳＣを有する培養物から得られたタンパク質の二次元ゲルの画
像が示される。図２８Ａでは、初期誘導期培養物（培養５日；６０％ＲＳ−１お
よびＲＳ−２細胞）から得られたタンパク質が示され、そして図２８Ｂでは、後
期誘導期培養物（培養１２日；１５％ＲＳ−１細胞）から得られたタンパク質が
示される。これらのデータが、さらに解析され、そして図２９では、図２８Ａ（
初期誘導期培養物、同定番号ＬＢ２Ｄ６−８０−１）、および図２８Ｂ（後期誘
導期培養物、同定番号ＬＢ２Ｄ６−８０−７）において示されるゲルのタンパク
質分析を表す表が示され、ここでは、いずれの培養物にも独特なタンパク質が分
析された。ＬｉｐｏｃｏｒｔｉｎＩＩ（また、ＡｎｎｅｘｉｎＩＩとして知られ
る）として知られるタンパク質が、本明細書に記述される発明の方法にしたがっ
て拡張された培養物においてのみ見い出された。かくして、本発明は、治療にお
いて使用するために培養物において拡張されたＭＳＣを単離し、そして精製する
ためにこのタンパク質を使用する方法を含む。

【０１６７】ここに引用される各特許、特許出願および公表物の開示は、引用によって本明
細書に組み入れられている。

【０１６８】本発明は、特定の実施態様に関して開示されているけれども、本発明の他の実
施態様および改変物が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の当業
者によって工夫できることは明らかである。付随する特許請求項は、すべてのそ
のような実施態様および等価改変物を包含する。

【図面の簡単な説明】

【図１】発明にかかる、従来技術（すなわち高密度）培養方法を使用するインビトロで
のヒト骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）の拡張可能性（集団の倍加により示される
）を描くグラフである。値は、５人の異なるドナーから得られたＭＳＣをコンフ
ルエントまで２回培養した（第一は２５平方センチメートルの表面上、およびそ
の後７５平方センチメートルの表面上）後の集団の倍加を示す。ＭＳＣをその後
、高密度（すなわち１平方センチメートルあたり約５，０００個の細胞）でプレ
ート培養することにより継代し、そして約１４日間、コンフルエントに成長させ
た。

【図２】発明にかかる、第四の継代後の本明細書に記述されるコロニー形成単位（ＣＦ
Ｕ）アッセイで観察される集団の倍加とコロニーの数との間の相関を描くグラフ
である。棒は各点についての３つの値の平均±標準誤差を示す。

【図３Ａ】発明にかかる、第４および第１２継代のＭＳＣのＣＦＵの減少を描く棒グラフ
である。

【図３Ｂ】発明にかかる、単一ドナーから得られた細胞を継代した際に該ドナーから得ら
れたＭＳＣのＣＦＵと拡張可能性（集団の倍加により示される）との間の関係を
描くグラフである。各値は３測定値の平均±標準誤差を表す。

【図４】発明にかかる、ＣＦＵアッセイで得られたコロニーの大きさ分布を描く棒グラ
フである。値は第２継代での４人のドナーからのプレートあたり３５個のコロニ
ーからである（ｎ＝１４０）。値はコロニーの最大の観察された直径である。

【図５】発明にかかる、第二継代のＣＦＵアッセイから得られたＭＳＣの骨芽細胞およ
び脂肪細胞への分化を描くグラフである。ＲおよびＬは同時に採取された同一ド
ナーの右および左腸骨稜からのサンプルを示す。

【図６Ａ】発明にかかる、ＭＳＣのＣＦＵアッセイを描く培養プレートの像である。プレ
ートは、ドナー１５から得られた第４継代のＭＳＣのＣＦＵアッセイを描く。

【図６Ｂ】発明にかかる、ＭＳＣのＣＦＵアッセイを描く培養プレートの像である。プレ
ートは、ドナー１７から得られた第４継代のＭＳＣからのＣＦＵアッセイを描く
。

【図６Ｃ】発明にかかる、ドナー５２から得られた第２継代のＭＳＣのＣＦＵアッセイ後
の大型のコロニー中に存在する紡錘形状の細胞を描く像である。

【図６Ｄ】発明にかかる、図６Ｃに描かれるところのドナー５２から得られた第２継代の
ＭＳＣの同一のＣＦＵアッセイ後の小型のコロニー中に存在する紡錘形状の細胞
を描く像である。

【図６Ｅ】発明にかかる、細胞をコンフルエントまで成長させかつ骨形成培地中で１８日
間インキュベートした後の、ドナー５４Ｌの第２継代から得られた大型のコロニ
ーの細胞の骨芽細胞への分化を描く像である。

【図６Ｆ】発明にかかる、細胞を脂肪形成培地中で１８日間インキュベートした後の、図
６Ｅ中と同一の大型のコロニーの細胞の１個の二重の培養物からの細胞の脂肪細
胞への分化を描く像である。

【図６Ｇ】発明にかかる、細胞をコンフルエントまで成長させかつ骨形成培地中で１８日
間インキュベートした後の、ドナー５４Ｌからの第１２継代から得られた細胞の
骨芽細胞への分化を描く像である。

【図６Ｈ】発明にかかる、細胞を脂肪形成培地中で１８日間インキュベートした後の、図
６Ｇ中のようなドナー５４Ｌからの第１２継代から得られた細胞の１個の二重の
培養物からの細胞の脂肪細胞への分化を描く像である。

【図７】発明にかかる、ＭＳＣが培養物中で拡張される際のそれらの多能性の喪失を描
く図である。

【図８】発明にかかる、本明細書に開示されるところの低密度継代培養により達成され
る細胞拡張を描く図である。

【図９Ａ】発明にかかる、細胞が高密度（「全培養物」）もしくは低密度（「単一コロニ
ー」）で繁殖された培養物中のＭＳＣの拡張可能性（集団の倍加に関して）を描
くグラフである。低密度（単一コロニー）拡張のためには、以前の継代から得ら
れた最大のコロニーのうち１個を、クローニング環を使用して単離し、そしてそ
のコロニーからのＭＳＣを次の継代をプレート培養するのに使用した。

【図９Ｂ】発明にかかる、図９Ａ中の「単一コロニー」のＭＳＣに対応するＭＳＣをどの
ように拡張したかを描く図である。

【図１０】発明にかかる、初期（「第１０日の収穫物」）および後期（「第１４日の収穫
物」）のコロニーから得られた細胞のＣＦＵ効率を描く棒グラフである。該結果
は、コロニーが第１４日に拡張することを停止する前に細胞を収穫することが、
初期前駆細胞の最良の収穫を提供するかもしれないことを示す。

【図１１】発明にかかる、２０ミリリットルの骨髄吸引物から単離されたＭＳＣの拡張可
能性を描くグラフであり、ここで、細胞を高密度（すなわち１平方センチメート
ルあたり約５，０００個の細胞）もしくは低密度（すなわち１平方センチメート
ルあたり約３個の細胞）のいずれかで繁殖させた。

【図１２】発明にかかる、図１２Ａ−１２Ｆを含んで成り、ＭＳＣ（図１２Ａ−１２Ｄ）
もしくは線維芽細胞（図１２Ｅ）を選択された細胞密度で培養した培養プレート
を描く一連の像、および、１２日のインキュベーション後の図１２Ａ−１２Ｃに
示されるプレート上の大型のコロニーの存在を要約する棒グラフ（図１２Ｆ）で
ある。細胞をプレート培養した初期細胞密度は、１平方センチメートルあたり３
．０（図１２Ａおよび１２Ｅ）、１．５（図１２Ｂ）、０．５（図１２Ｃ）なら
びに６．０（図１２Ｄ）個の細胞であった。図１２Ｅでプレート培養された線維
芽細胞についてはコロニー形成が観察されなかった。図１２Ｆにおいて、５ミリ
メートルより大きい直径を有した図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃのそれぞれ中の
コロニーのパーセンテージを示す。

【図１３】発明にかかる、図１３Ａおよび１３Ｂを含んで成り、成長培地上での細胞のイ
ンキュベーションに際しての大型コロニーの形成および細胞数に対する１平方セ
ンチメートルあたり１２（図１３Ａ）もしくは３（図１３Ｂ）個の細胞の初期密
度でのＭＳＣのプレート培養の影響を描く、培養プレートの一対の像である。

【図１４】発明にかかる、トリチウム化チミジンの取込みにより評価されるところのＭＳ
Ｃの成長速度に対する馴化培地の影響を描くグラフである。馴化培地を、本明細
書に記述されるとおりＭＳＣの培養物から得、そして１平方センチメートルあた
り約３個の細胞の初期細胞密度でプレート培養されたＭＳＣの成長培地に添加し
、そしてトリチウム化チミジンの取込みの速度を評価した。該結果は、馴化培地
がＭＳＣの拡張に対する二相性の影響を発揮することを立証する。

【図１５】発明にかかる、１平方センチメートルあたり１．５個の細胞の初期密度でプレ
ート培養されたＭＳＣに対する、（サイズ排除クロマトグラフィー媒体を使用し
て）ＨＰＬＣで分画されたヒトＭＳＣ馴化培地の相対的影響を描く棒グラフであ
る。各棒の下の数字はＨＰＬＣ画分の番号を示す。画分１０に対応するおおよそ
の分子量は３０，０００である。画分１７に対応するおおよその分子量は１０，
０００である。

【図１６】発明にかかる、ＭＳＣの成長速度を高める因子を含有するクロマトグラフィー
画分（レーン２、５および６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の結果の像である。レー
ン３および４は分子量マーカーを含有する。像の右の矢印は約３０，０００の重
量に対応する位置を示す

【図１７】発明にかかる、１平方センチメートルあたり０．５、１．５、３．０もしくは
６．０個の細胞の密度でのＭＳＣのプレート培養後に観察されたコロニーの大き
さを描く像である。７９平方センチメートルのプレート中での１４日間のインキ
ュベーション後に、メタノール中０．５％クリスタルバイオレットを用いて室温
で５ないし１０分間染色することによりコロニーを可視化した。

【図１８】発明にかかる、図１８Ａおよび１８Ｂを含んで成り、細胞の収量（図１８Ａ）
および平均倍加時間（図１８Ｂ）に対するプレート培養密度の影響を示す一対の
グラフである。細胞を７９平方センチメートルのプレート上でプレート培養し、
そして示された日に血球計算板を使用して細胞の収量を測定した。図１８Ａのグ
ラフはプレート培養された１００個の細胞あたりの細胞の収量を示し、ここで、
細胞は、１平方センチメートルあたり１．５（実線）もしくは１２．０（破線）
個の細胞の初期プレート培養密度でプレート培養した。図１８Ｂのグラフは、Ｍ
ＳＣを１平方センチメートルあたり１．５（実線）および１２．０（破線）個の
細胞でプレート培養した場合の１日あたりの細胞の倍加の平均の数を示す。値は
図１８Ａに提示されるデータからの３日の平均である。

【図１９】発明にかかる、図１９Ａ−１９Ｄを含んで成り、選択された期間のインキュベ
ーション後の大きさおよび粒状度についての細胞の個々のＦＡＣＳ分析を描く四
つ組のグラフである。予備実験は、細胞集団の間の前駆体と生成物の関係がゆっ
くりと成長した培養物中でより明らかであったことを示した。従って、該実験に
選択されたＭＳＣのストックサンプルは、以前に、培養物中でゆっくりと拡張す
ることが示され、そして約１２％（参考文献４１を参照されたい）という異常な
小さいＣＦＵ値を有する。細胞を、１平方センチメートルあたり３個の細胞（１
平方センチメートルあたり１．０個の細胞に同等であったか、もしくは、より迅
速に拡張しかつより大きいＣＦＵ値を有したサンプルについてはより小さい（図
１７を参照されたい））の最適に及ばない密度でプレート培養した。図１９Ａは
第１４日の静止培養物中の細胞のＦＡＣＳ分析である。線は、ＲＳ−１細胞、Ｒ
Ｓ−２細胞およびｍＭＳＣを規定するのに使用されたゲーティングを示す。図１
９Ｂは初期プレート培養後第５日のＦＡＣＳ分析である。図１９Ｃは初期プレー
ト培養後第７日のＦＡＣＳ分析である。図１９Ｄは初期プレート培養後第１０日
のＦＡＣＳ分析である。図１９において、「ＦＳＣ」は光の前方散乱（細胞の大
きさについてのアッセイ）を意味し、また、「ＳＳＣ」は光の側方散乱（細胞の
粒状度についてのアッセイ）を意味する。値は自由裁量の単位で示す。

【図２０】発明にかかる、１平方センチメートルあたり１．５個の細胞での細胞の初期プ
レート培養後に観察される細胞の数の一時的依存性を示すグラフである。値は、
培養物中の細胞の総数について補正された図１９に提示されるデータから採る。

【図２１】発明にかかる、ＭＳＣのサンプル中のＲＳ細胞のパーセンテージとＣＦＵのパ
ーセンテージとの間の比例性を示すグラフである。黒三角は変動する密度でプレ
ート培養されかつ１４日間インキュベートされた培養物から採取されたサンプル
を使用して得られたデータを表し；＊印は５日間（より大きい値）もしくは１４
日間（より小さい値）インキュベートされたＭＳＣの同一の初期サンプルからの
培養物を使用して得られたデータを表す。「％ＲＳ」はサンプル中のＲＳ−１お
よびＲＳ−２細胞の総パーセンテージを示す。「ＣＦＵ効率」は、プレート培養
された１００個の細胞あたりの観察されたコロニーの数を意味する。

【図２２】発明にかかる、細胞を低密度（破線）および高密度（実線）でプレート培養し
た場合に得られる集団の倍加の数を描くグラフである。黒三角は、１０ないし１
４日間インキュベートされた、１平方センチメートルあたり１．５個の細胞でプ
レート培養しかつそれから大型のコロニーをその後同一条件下での各その後の継
代について環状クローニングにより単離した細胞に対応するデータを表し；黒四
角は、記述された（４１）とおり１平方センチメートルあたり５，０００個の細
胞の高密度でプレート培養することにより継代されたＣＦＵの匹敵する値をもつ
サンプルからのＭＳＣに対応するデータを表す。

【図２３】発明にかかる、ＭＳＣの培養物中の細胞の前駆体と生成物の関係についての提
案されるスキームの図である。大型のｍＭＳＣは不十分に複製する（２、４１）
。従って、誘導期の間出現するＲＳ−２細胞はＲＳ−１細胞から生じるに違いな
い。成長の初期の対数期の間、ＲＳ−２細胞は、ｍＭＳＣが多数で出現する際に
数が減少する。従って、ＲＳ−２細胞はおそらくｍＭＳＣの前駆細胞である。し
かしながら、該データは、ＲＳ−２細胞が迅速にＲＳ−１細胞を生じさせてそれ
がｍＭＳＣ（破線の矢印）を生じさせるという可能性を排除しない。また、最も
初期のｍＭＳＣは複製し続けることができる。後期の対数期の間に、ＲＳ−２細
胞は数が減少し、そしてＲＳ−１の亜集団が拡張する。従って、ＲＳ−２細胞は
ＲＳ−１細胞に再循環する可能性がある。

【図２４】発明にかかる、限外濾過により調製されたＭＳＣサンプルの細胞含量を描く一
対のグラフである。ＲＳ−１細胞は箱中で「Ｒ１」と呼称されて示され；全部の
他のＭＳＣは非ＲＳＭＳＣと考えられた。

【図２５】発明にかかる、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと操作可能に連
結されたｌａｃＺを含んで成るベクターの存在下で電気穿孔されたＭＳＣ細胞中
でのｌａｃＺの発現を描く像である。

【図２６】発明にかかる、ＲＳ−１およびＲＳ−２細胞、ならびに成熟ＭＳＣ（ｍＭＳＣ
）上の付加的なエピトープを描く表である。該細胞と反応した抗体を、反応しな
かったものがそうであるように列挙する。

【図２７Ａ−Ｄ】発明にかかる、ＲＳ−１細胞およびＭＳＣを定義する顕微鏡写真の一連の像で
ある。

【図２８ＡおよびＢ】発明にかかる、ＲＳ細胞について濃縮されている培養物、ならびにかなりより
少ないＲＳ細胞およびより多い成熟ＭＳＣを有する培養物から得られたタンパク
質の二次元ゲルの一連の像である。図２８Ａには、初期の誘導期の培養物（５日
のインキュベーション；６０％のＲＳ−１およびＲＳ−２細胞）から得られたタ
ンパク質を示し、また、図２８Ｂには、後期の誘導期の培養物（１２日のインキ
ュベーション；１５％のＲＳ−１細胞）から得られたタンパク質を示す。

【図２９】発明にかかる、図２８Ａ（初期の誘導期の培養物、同定番号ＬＢ２Ｄ６−８０
−１）および図２８Ｂ（後期の誘導期の培養物、同定番号ＬＢ２Ｄ６−８０−７
）に示されるゲルのタンパク質分析を描く表であり、ここではいずれかの培養物
に独特のタンパク質を分析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 25/00 25/00 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 29/00 １０１ 29/00 １０１ 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｑ 1/02 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者コルター，デイビツドアメリカ合衆国ペンシルベニア州19128フイラデルフイア・テイ22・ヘンリーアベニユー8201 (72)発明者デイジロラモ，カーラアメリカ合衆国マサチユセツツ州01757ミルフオード・アパートメント５・フエザントサークル１Ｆターム(参考） 4B063 QA20 QQ08 QR69 QS24 4B065 AA94X BB19 BB25 BD50 CA44 CA60 4C084 AA13 NA14 ZA012 ZA022 ZA162 ZA962 ZA972 ZB152 ZB212 4C087 AA01 AA02 AA03 AA04 AA05 BB44 BB64 MA67 NA14 ZA01 ZA02 ZA16 ZA96 ZA97 ZB15 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離された細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメート
ルあたり約５０個未満の細胞であるような成長表面に、単離された細胞および成
長培地を提供すること、ならびに成長を促進する条件下で該表面をインキュベートし、それにより細胞を増殖する
ことを含んで成る、単離されたヒト骨髄ストローマ細胞のインビトロでの増殖の誘導
方法。
【請求項２】単離された細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメート
ルあたり約２５個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
１２個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
１０個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
６個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
３個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
１．５個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項８】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり約
１．０個未満の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項９】細胞の初期密度が成長表面の１平方センチメートルあたり最
低約０．５個の細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】細胞が、約１４日を越えないインキュベーションの後に成
長表面から収穫される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】細胞が、約１０日を越えないインキュベーションの後に成
長表面から収穫される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】収穫された細胞および成長培地を、収穫された細胞の初期
密度が第二の成長表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞である
ような第二の成長表面に提供し、かつ、成長を促進する条件下で第二の成長表面
をインキュベートし、それにより細胞を増殖する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】細胞が、１平方センチメートルあたり約３個の細胞の初期
密度で成長表面上に接種される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】細胞が、約１４日を越えないインキュベーションの後に第
二の成長表面から収穫される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】細胞が、約１０日を越えないインキュベーションの後に第
二の成長表面から収穫される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】第二の成長表面から収穫された細胞および成長培地を、第
二の成長表面から収穫された細胞の初期密度が第三の成長表面の１平方センチメ
ートルあたり約５０個未満の細胞であるような第三の成長表面に提供し、かつ、
成長を促進する条件下で第三の成長表面をインキュベートし、それにより細胞を
増殖する、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】細胞が、約１４日を越えないインキュベーションの後に第
三の成長表面から収穫される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】細胞が、約１０日を越えないインキュベーションの後に収
穫される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】細胞が、１平方センチメートルあたり約３個の細胞の初期
密度で成長表面上に接種される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】成長培地が哺乳動物血清を含んで成る、請求項１記載の方
法。
【請求項２１】哺乳動物血清がウシ胎児血清である、請求項２０記載の方
法。
【請求項２２】成長因子が成長培地に添加される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】成長因子が、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、
インスリン増殖因子および内皮細胞増殖因子より成る群から選択される、請求項
２２記載の方法。
【請求項２４】馴化培地中に存在する因子で成長培地を補充すること（こ
こで、馴化培地は、１平方センチメートルあたり最低約０．５個の細胞の初期密
度で第二の表面上で成長されかつ最低約３日間インキュベートされる産生体ヒト
骨髄ストローマ細胞の培養物から得られる）を含んで成る、成長培地の存在下で
表面上で成長する単離されたヒト骨髄ストローマ細胞のインビトロ増殖を高める
方法。
【請求項２５】生産体ヒト骨髄ストローマ細胞が、１平方センチメートル
あたり最低約１２個の細胞の初期密度で第二の表面上で成長される、請求項２４
記載の方法。
【請求項２６】産生体ヒト骨髄ストローマ細胞が最低約６日間インキュベ
ートされる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】成長培地が、馴化培地で成長培地を補充することにより因
子で補充される、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】成長培地が、馴化培地を大きさで分画すること、およびそ
の後、約３０，０００の分子量を有する大きさで分画された分子を含有する馴化
培地の画分で成長培地を補充することにより、因子で補充される、請求項２４記
載の方法。
【請求項２９】成長培地が、馴化培地を大きさで分画すること、およびそ
の後、約１０，０００の分子量を有する大きさで分画された分子を含有する馴化
培地の画分で成長培地を補充することにより、因子で補充される、請求項２４記
載の方法。
【請求項３０】馴化培地が、表面の１平方センチメートルあたり約１２個
未満の細胞の初期密度で成長培地の存在下に表面上で最低約３日間ヒト骨髄スト
ローマ細胞をインキュベートすることにより作成されて、それにより成長培地が
馴化培地に転換される、ヒト骨髄ストローマ細胞の増殖を誘導するための馴化培
地。
【請求項３１】骨髄サンプルから単核細胞を単離すること、単核細胞をイ
ンキュベートしてコロニーを生じさせること、個々のコロニーを単離すること、
ならびに成長表面を有する容器中で、単離されたコロニーから得られたヒト骨髄
ストローマ細胞をインキュベートすること（該容器は、成長培地および成長表面
の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞の初期密度の細胞を含有し、
それにより細胞が増殖する）を含んで成る、ヒト骨髄ストローマ細胞の増殖の誘
導方法。
【請求項３２】表面の１平方センチメートルあたり約５０個未満の細胞の
初期密度で成長培地の存在下に表面上で細胞をインキュベートすること、および
細胞のコロニー形成効率を評価すること（それにより細胞の拡張可能性が細胞の
コロニー形成効率にほぼ比例する）を含んで成る、ヒト骨髄ストローマ細胞のイ
ンビトロでの拡張可能性の評価方法。
【請求項３３】細胞が最低約１０日間インキュベートされる、請求項３２
記載の方法。
【請求項３４】コロニー形成効率が、同一の様式でインキュベートされた
ヒト骨髄ストローマ細胞の別のサンプルのコロニー形成効率と比較され、ここで
、他のサンプルの細胞の拡張可能性が既知である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】コロニー形成効率が、コロニー形成効率対拡張可能性の参
照プロットと比較される、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】プロットが図２である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】骨髄ストローマ細胞の集団を、約１０マイクロメートル未
満の大きさを有する第一の画分および約１０マイクロメートルより大きい大きさ
を有する第二の画分に分離すること（それにより第一の画分の細胞が第二の画分
の細胞より大きな拡張能力を有する）を含んで成る、より小さい拡張能力を有す
る骨髄ストローマ細胞からのより大きな拡張能力を有する骨髄ストローマ細胞の
単離方法。
【請求項３８】ｉ）同一種の動物から骨髄ストローマ細胞を単離することｉｉ）その後ａ）発現構築物の存在下で、単離された骨髄ストローマ細胞を電気穿孔して、形
質転換された単離された骨髄ストローマ細胞を生じさせること、およびｂ）単離された骨髄ストローマ細胞をインビトロで拡張すること、ならびにｉｉｉ）その後、形質転換された単離された骨髄ストローマ細胞を動物に提供す
ること（それにより発現構築物が動物に提供される）を含んで成る、動物への発現構築物の提供方法。
【請求項３９】骨髄ストローマ細胞が同一の動物から単離される、請求項
３５記載の方法。
【請求項４０】ストローマ細胞の集団をリポコルチンＩＩに対する抗体と
接触させること、およびストローマ細胞の集団から、該抗体を結合する細胞を単離して、それにより骨髄
ストローマ細胞を精製すること、を含んで成る、骨髄ストローマ細胞の精製方法。
【請求項４１】単離された細胞の初期濃度が成長表面の１平方センチメー
トルあたり約５０個未満の細胞であるような成長表面に、単離された骨髄ストロ
ーマ細胞および成長培地を提供すること、成長を促進する条件下で該表面をインキュベートすること（それにより細胞が増
殖する）、ストローマ細胞の集団を、リポコルチンＩＩに対する抗体と接触させること、な
らびに、ストローマ細胞の集団から、該抗体を結合する細胞を単離して、それに
より骨髄ストローマ細胞を精製することを含んで成る、骨髄ストローマ細胞の精製方法。