JP6153653B2 - 幹細胞培養方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ドナーから採取した骨髄液を用いて幹細胞を培養する幹細胞培養方法に関する。
幹細胞を培養する培地と、幹細胞に対して照射エネルギーが０を超え１０ジュール／ｃｍ２以下、レーザパワー密度が０．１Ｗ／ｃｍ２以下、照射エネルギーを０．１以上２．５ジュール／ｃｍ２以下の低出力の炭酸ガスレーザーの照射光をデフォーカスして培地全体に照射し、幹細胞を活性化させるレーザー照射手段とを備え、幹細胞に低出力のレーザーを照射して活性化させた後、幹細胞に所定の休止期間を設けて目標増殖数まで増殖させる幹細胞培養方法が開示されている。この幹細胞培養方法によれば、ヒト、非ヒト（動物）から採取した組織またはその細胞に存在する幹細胞を活性化させて飛躍的に増殖させることができる。
特開２０１５−１８６４６５号公報
ドナーから採取した組織またはその細胞には多種雑多な幹細胞が存在するから、組織または細胞に存在する幹細胞を培養したとしても多種雑多な幹細胞が増殖し、特定種類の幹細胞のみを培養することができない。幹細胞は、各種の疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療や再生医療、非治療的用途に利用されるが、培養された多種雑多な幹細胞は、特定種類の幹細胞のみからなる場合と比較し、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が小さく、各種の疾患を完治させる確率が低く、各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が低い。なお、前記特許文献１に開示の幹細胞培養方法では、多種雑多な幹細胞が培養され、特定種類の幹細胞のみを培養することができない。
本発明の目的は、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぐことができ、特定種類の幹細胞のみを培養することができる幹細胞培養方法を提供することにある。本発明の他の目的は、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確率が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が高い幹細胞を培養することができる幹細胞培養方法を提供することにある。
前記課題を解決するための本発明の前提は、ドナーから採取した第１骨髄液を用いて特定種類の幹細胞を培養する幹細胞培養方法である。
前記前提における本発明の特徴は、幹細胞培養方法が、ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、骨髄液分離工程によって層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、骨髄液抽出工程によって抽出した第２骨髄液と所定の培養液とを所定容量かつ所定面積の底面を有する第１培養容器に注入した後、第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第１観察工程と、形状変形第１観察工程における観察の結果、第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断し、第１培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第１培養容器に注入し、第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第１観察工程と、総平面面積第１観察工程における観察の結果、第１培養容器の底面において第１幹細胞が増殖して第１幹細胞の平面形状が拡張し、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出する幹細胞第１抽出工程と、幹細胞第１抽出工程によって抽出した第１幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞遠心分離工程と、幹細胞遠心分離工程によって第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞第２抽出工程と、幹細胞第２抽出工程によって抽出した第２幹細胞と所定の培養液とを第１培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の底面を有する第２培養容器に注入し、第２培養容器を所定時間静的に放置して第２幹細胞を第２培養容器の底面に定着させるとともに第２幹細胞を増殖させ、第２培養容器の底面において第２幹細胞の平面形状が拡張して第２培養容器の底面面積に対する第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出する幹細胞第３抽出工程とを有することにある。
本発明の一例としては、幹細胞培養方法が、幹細胞第２抽出工程によって抽出した第２幹細胞と培養液とを第２培養容器に注入した後、第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第２観察工程と、形状変形第２観察工程における観察の結果、第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断し、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入し、第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第２観察工程とを含み、幹細胞第３抽出工程では、総平面面積第２観察工程における観察の結果、第２幹細胞が増殖して第２幹細胞の平面形状が拡張し、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出する。
本発明の他の一例としては、第２培養容器の容量が４０〜６０ｃｃであり、第２幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第２幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第２幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、形状変形第２観察工程では、第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第２幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断する。
本発明の他の一例として、総平面面積第２観察工程では、第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する。
本発明の他の一例としては、第２培養容器の底面面積に対する第２幹細胞の総平面面積の第２目標割合が８８〜９２％である。
本発明の他の一例として、骨髄液分離工程では、ドナーから２〜３ｃｃの第１骨髄液を採取し、２〜３ｃｃの第１骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して第１骨髄液を該分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、骨髄液抽出工程では、分離容器内において層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する。
本発明の他の一例としては、第１培養容器の容量が２０〜３０ｃｃであり、第１幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第１幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第１幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、形状変形第１観察工程では、第１培養容器を体温と略同一の温度で１２〜２４時間静的に放置しつつ、１２〜２４時間の間において１〜２時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第１幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断する。
本発明の他の一例として、総平面面積第１観察工程では、第１培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する。
本発明の他の一例としては、第１培養容器の底面面積に対する第１幹細胞の総平面面積の第１目標割合が７０〜８０％である。
本発明の他の一例として、幹細胞遠心分離工程では、第１幹細胞を分離容器に注入し、分離容器を遠心分離器に設置して第１幹細胞を遠心分離させ、幹細胞第２抽出工程では、分離容器内において第１幹細胞を層状に遠心分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する。
本発明の他の一例としては、第１および第２幹細胞が間葉系幹細胞である。
本発明にかかる幹細胞培養方法によれば、層状に分離させた第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出し、第２骨髄液を培養液とともに培養して第１幹細胞を第１培養容器の底面に定着させるとともに第１幹細胞を増殖させ、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出し、層状に遠心分離させた第１幹細胞のうちの最下層に位置する第２幹細胞を抽出し、第２幹細胞を培養液とともに培養して第２幹細胞を第２培養容器の底面に定着させるとともに第２幹細胞を増殖させ、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出するから、層状に分離させた第１骨髄液から特定の第２骨髄液を抽出し、層状に分離させた第１幹細胞から特定の第２幹細胞を抽出することで、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぐことができ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができるとともに、不要な幹細胞が除去されたピュア（純粋）な幹細胞を製造することができる。幹細胞培養方法は、特定種類の幹細胞のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確率が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が高い幹細胞を培養することができる。
幹細胞培養方法は、抽出した第２骨髄液と培養液とを第１培養容器に注入した後、第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第１幹細胞の変形を観察した結果、第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断し、第１培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第１培養容器に注入し、第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察し、総平面面積を観察した結果、第１幹細胞が増殖して第１幹細胞の平面形状が拡張し、第１幹細胞の総平面面積が第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、第１培養容器から第１幹細胞を抽出するから、第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第１培養容器の底面に第１幹細胞を確実に定着させることができ、第１培養容器の底面に第１幹細胞が定着した後、第１培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第１培養容器に注入するとともに第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第１幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察することで、第１幹細胞の第１培養容器の底面に対する定着を正確に確認することができ、第１目標割合に対する第１幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができる。幹細胞培養方法は、第１培養容器において第１幹細胞を確実に定着かつ増殖させることができるとともに、第１目標割合に対する第１幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができるから、他の幹細胞を含まない第１幹細胞のみを培養することができ、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぎつつ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができる。
抽出した第２幹細胞と培養液とを第２培養容器に注入した後、第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第２幹細胞の変形を観察した結果、第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断し、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入し、第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察し、総平面面積を観察した結果、第２幹細胞が増殖して第２幹細胞の平面形状が拡張し、第２幹細胞の総平面面積が第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、第２培養容器から第２幹細胞を抽出する幹細胞培養方法は、第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第２培養容器の底面に第２幹細胞を確実に定着させることができ、第２培養容器の底面に第２幹細胞が定着した後、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入するとともに第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第２幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察することで、第２幹細胞の第２培養容器の底面に対する定着を正確に確認することができ、第２目標割合に対する第２１幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができる。幹細胞培養方法は、第２培養容器において第２幹細胞を確実に定着かつ増殖させることができるとともに、第２目標割合に対する第２幹細胞の総平面面積の到達度を正確に確認することができるから、他の幹細胞を含まない第２幹細胞のみを培養することができ、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぎつつ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができる。
第２培養容器の容量が約４０〜６０ｃｃであり、第２幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第２幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第２幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第２幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断する幹細胞培養方法は、第２幹細胞の定着時に容量が６０ｃｃを超過する大きな容器を使用すると、第２幹細胞が容器の底面に定着し難くなるとともに第２幹細胞の増殖が遅くなるが、前記容量の第２培養容器を使用することで、第２幹細胞を第２培養容器の底面に早期かつ容易に定着させることができ、第２培養容器において第２幹細胞を素早く増殖させることができる。幹細胞培養方法は、第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察するから、第２幹細胞の変形を見逃すことはなく、第２幹細胞の第２培養容器の底面に対する定着を正確に確認することができ、第２幹細胞の定着を確認した後、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入することで、第２幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、第２幹細胞が略円形を核として第２幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状に変形した場合に第２幹細胞が第２培養容器の底面に定着したと判断することで、第２幹細胞の第２培養容器の底面への定着を見逃すことはなく、第２幹細胞の平面形状の変化によって第２幹細胞の第２培養容器の底面に対する定着を正確に把握することができる。
第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する幹細胞培養方法は、１〜２時間間隔で第２培養容器の底面に定着した第２幹細胞の総平面面積を観察することで、第２幹細胞の第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、第２培養容器の底面面積に対して第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達したことを確実に把握することができる。幹細胞培養方法は、第２培養容器からの第２幹細胞を抽出のタイミングを誤ることなく、第２幹細胞の活性を保持しつつ第２培養容器から第２幹細胞を抽出することができる。
第２培養容器の底面面積に対する第２幹細胞の総平面面積の第２目標割合が８８〜９２％である幹細胞培養方法は、第２培養容器の底面面積に対する第２幹細胞の総平面面積が９２％を超過して第２幹細胞が増殖すると、第２幹細胞の活性が次第に失われるが、第２培養容器の底面面積に対して第２幹細胞の総平面面積が８８〜９２％に増殖したときに、第２幹細胞を第２培養容器から抽出するから、第２幹細胞の活性を保持することができ、高い活性を有する第２幹細胞を製造することができる。幹細胞培養方法は、高い活性を有する特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確率が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が高い幹細胞を培養することができる。
ドナーから２〜３ｃｃの第１骨髄液を採取し、２〜３ｃｃの第１骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して第１骨髄液を分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、分離容器内において層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する幹細胞培養方法は、多種雑多な幹細胞を含む第１骨髄液を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して上下方向へ層状に分離させることで、第１骨髄液から特定の第２骨髄液を確実に抽出することができ、第１骨髄液に含まれる不要な幹細胞を除去することができるとともに、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができる。幹細胞の培養に通常１５０〜２００ｃｃの骨髄液が必要とされているが、幹細胞培養方法は、ドナーから２〜３ｃｃの骨髄液を採取すればよく、少量の骨髄液で特定種類の幹細胞（第２幹細胞）を培養することができるから、骨髄液の採取時間を大幅に短縮することができ、骨髄液を低コストで採取することができるとともに、骨髄液の採取時にドナーにかかる負担を最小限にすることができる。
第１培養容器の容量が２０〜３０ｃｃであり、第１幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第１幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第１幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第１培養容器を体温と略同一の温度で１２〜２４時間静的に放置しつつ、１２〜２４時間の間において１〜２時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第１幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断する幹細胞培方法は、第１幹細胞の定着時に容量が３０ｃｃを超過する大きな培養容器を使用すると、第１幹細胞が容器の底面に定着し難くなるとともに第１幹細胞の増殖が遅くなるが、前記容量の第１培養容器を使用することで、第１幹細胞を第１培養容器の底面に早期かつ容易に定着させることができ、第１培養容器において第１幹細胞を素早く増殖させることができる。幹細胞培養方法は、第１培養容器を体温と略同一の温度で１２〜２４時間静的に放置しつつ、１２〜２４時間の間において１〜２時間間隔で第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察するから、第１幹細胞の変形を見逃すことはなく、第１幹細胞の第１培養容器の底面に対する定着を正確に確認することができ、第１幹細胞の定着を確認した後、第１培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第１培養容器に注入することで、第１幹細胞の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、第１幹細胞が略円形を核として第１幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状に変形した場合に第１幹細胞が第１培養容器の底面に定着したと判断することで、第１幹細胞の第１培養容器の底面への定着を見逃すことはなく、第１幹細胞の平面形状の変化によって第１幹細胞の第１培養容器の底面に対する定着を正確に把握することができる。
第１培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する幹細胞培養方法は、１〜２時間間隔で第１培養容器の底面に定着した第１幹細胞の総平面面積を観察することで、第１幹細胞の第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、第１培養容器の底面面積に対して第１幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達したことを確実に把握することができる。幹細胞培養方法は、第１培養容器からの第１幹細胞を抽出のタイミングを誤ることなく、第１幹細胞の活性を保持しつつ第１培養容器から第１幹細胞を抽出することができる。
第１培養容器の底面面積に対する第１幹細胞の総平面面積の第１目標割合が７０〜８０％である幹細胞培養方法は、第１培養容器の底面面積に対する第１幹細胞の総平面面積が８０％を超過して第１幹細胞が増殖すると、第１幹細胞の活性が次第に失われるが、第１培養容器の底面面積に対して第１幹細胞の総平面面積が７０〜８０％に増殖したときに、第１幹細胞を第１培養容器から抽出するから、第１幹細胞の活性を保持することができ、活性を保持した状態で第１幹細胞を増殖させることができる。
第１幹細胞を分離容器に注入し、分離容器を遠心分離器に設置して第１幹細胞を遠心分離させ、分離容器内において第１幹細胞を層状に遠心分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞培養方法は、不要な雑種の幹細胞を含む第１幹細胞を遠心分離器による遠心分離によって層状に分離させ、層状に遠心分離した第１幹細胞のうちの最下層に位置する第２幹細胞を抽出することで、第１幹細胞から特定の第２幹細胞を確実に抽出することができ、第１幹細胞から不要な幹細胞を除去することができるとともに、製造対象の特定種類の幹細胞（第２幹細胞）のみを培養することができる。
第１および第２幹細胞が間葉系幹細胞である幹細胞培養方法は、層状に分離させた第１骨髄液から特定の第２骨髄液を抽出し、層状に分離させた第１間葉系幹細胞から特定の第２間葉系幹細胞を抽出することで、不要な雑種の間葉系幹細胞が除去され、多種雑多な間葉系幹細胞の増殖を防ぐことができ、製造対象の特定種類の間葉系幹細胞（第２間葉系幹細胞）のみを培養することができる。幹細胞培養方法は、特定種類の間葉系幹細胞のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確率が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が高い間葉系幹細胞を培養することができる。
一例として示す幹細胞培養システムの概略構成図。 骨髄液分離工程の一例を示す説明図。 図２から続く骨髄液分離工程の説明図。 図３から続く骨髄液分離工程の説明図。 形状変形第１観察工程の一例を示す説明図。 第１扁平培養容器の側面図。 第１間葉系幹細胞の平面形状の一例を示す部分拡大図。 第１間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。 第１間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。 幹細胞遠心分離工程の一例を示す説明図。 幹細胞第２抽出工程の一例を示す説明図。 形状変形第２観察工程の一例を示す説明図。 第２扁平培養容器の側面図。 第２間葉系幹細胞の平面形状の一例を示す部分拡大図。 第２間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。 第２間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。 第２間葉系幹細胞の保存の一例を示す図。
一例として示す幹細胞培養システム１０の概略構成図である図１等の添付の図面を参照し、本発明にかかる幹細胞培養方法の詳細を説明すると、以下のとおりである。なお、図２は、骨髄液分離工程の一例を示す説明図であり、図３は、図２から続く骨髄液分離工程の説明図である。図４は、図３から続く骨髄液分離工程の説明図である。
幹細胞培養方法は、複数のドナー（人）から採取した第１骨髄液を利用し、骨髄液分離工程、骨髄液抽出工程、形状変形第１観察工程）、総平面面積第１観察工程、幹細胞第１抽出工程、幹細胞遠心分離工程、幹細胞第２抽出工程、形状変形第２観察工程、総平面面積第２観察工程、幹細胞第３抽出工程を行うことにより、第１骨髄液１９に含まれる複数種類の間葉系幹細胞の中から特定種類の単一種間葉系幹細胞を培養（製造）する。
幹細胞培養システム１０は、コンピュータ１１とバーコードリーダ１２と電子顕微鏡１３とから形成されている。コンピュータ１１は、中央処理装置（ＣＰＵや仮想ＣＰＵ）と記憶装置（メモリや仮想メモリ）と大容量記憶領域（ハードディスクや仮想ハードディスク等）とを備え、物理的なＯＳ（オペレーティングシステム）や仮想ＯＳ（仮想オペレーティングシステム）によって動作する。コンピュータ１１には、キーボード１４やマウス１５等の入力装置、ディスプレイ１６やプリンタ（図示せず）等の出力装置がインターフェイス（無線または有線）を介して接続されている。
骨髄培養システム１０では、ドナーデータ（ドナー特定情報）がＱＲコード（登録商標）を利用して管理される。ドナーデータには、ドナーの氏名、住所、電話番号、生年月日、性別、血液型、身長、体重、メールアドレス等がある。システム１０では、二次元コードとしてＱＲコードを使用しているが、ＱＲコードの他に、マトリックス式のＳＰコード、ベリコード（VeriCode）、マキシコード（MaxiCode）、ＣＰコード、DataMatrix、Code１、AztecCode、インタクタコード、カードｅを使用することができる。なお、システム１０で使用する二次元コードには、今後開発されるすべてのそれが含まれる。また、ドナーデータ（ドナー特定情報）をＩＣタグ（ＩＣチップ）によって管理することもできる。
骨髄液分離工程では、ドナーから採取した第１骨髄液１９を層状に分離させる。骨髄液採取では、それらドナーの胸骨または腸骨（骨盤）から２〜３ｃｃ（２〜３ｍｌ）の第１骨髄液１９が採取される。第１骨髄液１９は、ドナーに局所麻酔をかけた後、骨髄を穿刺して骨髄液（骨髄血）を吸引する「骨髄穿刺」（マルク）によって採取される。医師や看護師、研究者等の担当者は、第１骨髄液１９の採取と同時に、コンピュータ１１においてシステム１０を起動し、キーボード１４やマウス１５等の入力装置を利用してドナーデータをコンピュータ１１に入力する。
コンピュータ１１は、ドナーデータが入力される度毎（ドナーから第１骨髄液１９を採取する度毎）に各ドナーを特定するユニークなドナー識別子を生成し、ドナーデータをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（ドナーデータ記憶手段）。コンピュータ１１は、入力されたドナーデータを二次元コードライター機能によってＱＲコード（二次元コード）に変換し（二次元コード（ＱＲコード）変換手段）、ＱＲコードが印字された第１〜第４コード用紙１８ａ〜１８ｄを出力するとともに（二次元コード（ＱＲコード）出力手段）、そのＱＲコードを各ドナーを特定するドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（二次元コード（ＱＲコード）記憶手段）。
なお、ＮＯ１が印字された第１コード用紙１８ａに印字されたＱＲコードには、骨髄液分離工程、骨髄液抽出工程までの番号１が格納され、ＮＯ２が印字された第２コード用紙１８ｂに印字されたＱＲコードには、形状変形第１観察工程、総平面面積第１観察工程、幹細胞第１抽出工程までの番号２が格納されている。ＮＯ３が印字された第３コード用紙１８ｃに印字されたＱＲコードには、幹細胞遠心分離工程、幹細胞第２抽出工程までの番号３が格納され、ＮＯ４が印字された第４コード用紙１８ｄに印字されたＱＲコードには、形状変形第２観察工程、総平面面積第２観察工程、幹細胞第３抽出工程までの番号４が格納されている。コンピュータ１１は、骨髄液分離工程から幹細胞第３抽出工程の各工程毎に、記憶領域に格納したドナーデータとバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較する。
ドナーから採取された２〜３ｃｃの第１骨髄液１９は、図２に示すように、上下方向へ延びるガラス試験管２０（分離容器）内に注入（収容）される。なお、２〜３ｃｃの第１骨髄液１９には、０．５〜１ｍｌ（約５×１０７（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ））の複数種類の間葉系幹細胞が含まれる。第１骨髄液１９を注入するガラス試験管２０の外周面には、第１コード用紙１８ａが貼付されている。第１骨髄液１９を注入したガラス試験管２０は、図３に示すように、試験管立て２１にセットされ、試験管立て２１とともに恒温槽２２内に収容される。
医師や看護師、研究者等の担当者は、ガラス試験管２０の外周面にＱＲコードが印字された第１コード用紙１８ａを貼付した後、ガラス試験管２０のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。バーコードリーダ１２は、インターフェイス（有線または無線）を介してコンピュータ１１に接続されている。バーコードリーダ１２は、読み取ったＱＲコードをコンピュータ１１に送信する。
コンピュータ１１は、バーコードリーダ１２から送信されたＱＲコードが示す番号１およびドナーデータを記憶領域から抽出してキャッシュメモリに読み出すとともに、工程第１表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第１表示画面には、番号１およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離ボタン、骨髄液抽出ボタン、形状変形第１観察ボタン、総平面面積第１観察ボタン、幹細胞第１抽出ボタン、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタン、ログアウトボタンが表示される。幹細胞の培養を行わない場合、ログアウトボタンをクリックする。ログアウトボタンをクリックすると、コンピュータ１１においてシステム１０が停止する。
担当者は、ディスプレイ１６に表示された骨髄液分離ボタンをクリックした後、注射器からガラス試験管２０に第１骨髄液１９を注入し、第１骨髄液１９を注入したガラス試験管２０を試験管立て２１に挿入（セット）する。担当者は、図３に示すように、試験管立て２１を恒温槽２２内に収容し、第１骨髄液１９を注入したガラス試験管２０を恒温槽２２において所定時間（約２時間）静的に放置（動かすことなく静かに放置）する。恒温槽２２内の温度は、体温と略同一の約３６〜３７℃に保持されている。コンピュータ１１は、第１コード用紙１８ａに印字されたＱＲコードが示す番号１およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離実施中メッセージと骨髄液分離終了ボタンとをディスプレイ１６に表示する。
ガラス試験管２０を恒温槽２２に所定時間（約２時間）静的に放置することで、図４に示すように、試験管２０に注入された第１骨髄液１９が試験管２０内において上下方向へ何層か（３層）の層状に分離する。幹細胞の培養には通常１５０〜２００ｃｃ（１５０〜２００ｍｌ）の骨髄液が必要とされているが、この幹細胞培養方法は、ドナーから２〜３ｃｃの第１骨髄液１９を採取すればよく、少量の骨髄液１９で特定種類の間葉系幹細胞（第２間葉系幹細胞３１）を培養（製造）することができるから、骨髄液１９の採取時間を大幅に短縮することができ、骨髄液１９を低コストで採取することができるとともに、骨髄液１９の採取時にドナーにかかる負担を最小限にすることができる。
第１骨髄液１９を層状に分離させた骨髄液分離工程の後、骨髄液抽出工程が行われる。骨髄液抽出工程では、層状に分離した第１骨髄液１９から第２骨髄液２３を抽出する。担当者は、第１骨髄液１９が層状に分離したことを確認した後、ディスプレイ１６に表示された骨髄液分離終了ボタンをクリックする。
骨髄液分離終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第２表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第２表示画面には、番号１およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出ボタン、形状変形第１観察ボタン、総平面面積第１観察ボタン、幹細胞第１抽出ボタン、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第２表示画面の骨髄液抽出ボタンをクリックし、ガラス試験管２０のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号１およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出実施中メッセージ、骨髄液抽出終了ボタンをディスプレイに表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、恒温槽２２内から試験管立て２１を取り出し、試験管立て２１からガラス試験管２０を引き抜き、層状に分離した第１骨髄液１９の特定の層に存在する第２骨髄液２３を抽出する。担当者は、注射器（図示せず）を利用して層状に分離した第１骨髄液１９のうちの中間層に位置する３〜４ｍｍの層厚みの第２骨髄液２３を抽出（吸引）する。または、ピペット（図示せず）を利用して層状に分離した第１骨髄液１９のうちの中間層に位置する３〜４ｍｍの層厚みの第２骨髄液２３を抽出（吸引）する。幹細胞培養方法は、多種雑多な間葉系幹細胞を含む第１骨髄液１９を上下方向へ層状（３層）に分離させた後、注射器またはピペットを利用することで、第１骨髄液１９から特定（中間）の第２骨髄液２３を確実に抽出することができ、第１骨髄液１９に含まれる不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
図５は、形状変形第１観察工程の一例を示す説明図であり、図６は、第１扁平培養容器２５（第１培養容器）の側面図である。図７は、第１間葉系幹細胞３５の平面形状の一例を示す部分拡大図であり、図８は、第１間葉系幹細胞３５の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図７，８は、電子顕微鏡１３によって撮影された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を示す。
第１骨髄液１９から中間層に位置する特定の第２骨髄液２３を抽出した骨髄液抽出工程の後、形状変形第１観察工程が行われる。形状変形第１観察工程では、第２骨髄液２３および培養液２４を第１扁平培養容器２５（第１培養容器）（細胞培養容器）に注入（収容）し、培養容器２５内を体温と略同一の温度（約３６〜３７℃）に保持しつつ、１２〜２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、１２〜２４時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器２５内の第２骨髄液２３に含まれる第１間葉系幹細胞３５（第１幹細胞）の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡１３で観察し、幹細胞３５が培養容器２５の底面３６に定着したか否かを判断する。第２骨髄液２３および培養液２４を注入する第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁外面）には、ドナーを特定するＱＲコードを印字した第２コード用紙１８ｂが貼付されている。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第１骨髄液１９から特定の第２骨髄液２３を抽出した後、ディスプレイ１６に表示された骨髄液抽出終了ボタンをクリックする。骨髄液抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第３表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第３表示画面には、番号１およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察ボタン、総平面面積第１観察ボタン、幹細胞第１抽出ボタン、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、ＱＲコードが印字された第２コード用紙１８ｂを第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁外面）に貼付する。次に、工程第３表示画面の形状変形第１観察ボタンをクリックし、培養容器２５のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号２およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察実施中メッセージ、形状変形第１観察終了ボタンをディスプレイに表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
形状変形第１観察工程で使用される第１扁平培養容器２５は、透明なガラスまたは透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面３６を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器である。第１扁平培養容器２５は、頂部２６および底部２８と頂底部２６，２８の間に位置する中央部２７と、頂部２６に形成された注入口２９とを有する。注入口２９は、蓋３０によって水密に閉塞されている。第１扁平培養容器２５は、その容量が約２０〜３０ｃｃ（好ましくは、２５ｃｃ）であり、その底面面積が約２５〜３６ｍｍ２である。第１扁平培養容器２５は、その一辺の長さが５〜６ｍｍである。なお、第１扁平培養容器２５として小容量かつ所定面積の底面２８を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。
担当者は、注入口２９から蓋３０を取り外し、注射器またはピペットに吸引された第２骨髄液２３を培養容器２５の注入口２９から培養容器２５の内部に注入（収容）するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液２４を培養容器２５の注入口２９から培養容器２５の内部に注入（収容）し、蓋３０によって注入口２９を閉塞する。
培養液２４には、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍｌ）、アムホテリシン（約１００ｎｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（約１００ｍｋｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（約２〜４ｍｌ）、２０％ウシ胎児血清を添加したミネラル塩溶液およびアミノ酸が含まれる。第１扁平培養容器２５に注入された第２骨髄液２３に含まれる第１間葉系幹細胞３５は、時間の経過とともに培養容器２５の底面３６に定着しつつ、培養液２４によって培養され、培養容器２５の底面３６において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。
担当者は、第２骨髄液２３および培養液２４を第１扁平培養容器２５に注入した後、培養容器２５を電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１に設置（セット）する。なお、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第１扁平培養容器２５の底部２８との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器２５の底部２８をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２５の底部２８が上となり培養容器２５の頂部２６（注入口２９）が下となるように、培養容器２５を所定角度に傾斜させた状態に保持する。また、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第１扁平培養容器２５の頂部２６との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器２５の頂部２６をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２５の頂部２６が上となり培養容器２５の底部２８が下となるように、培養容器２５を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ３１の上面３２に対する第１扁平培養容器２５の傾斜角度α１は、２〜５°の範囲にあり、好ましくは、２〜３°の範囲にある。
幹細胞培養方法は、試料ホルダ３１の上面３２に対して第１扁平培養容器２５を前記傾斜角度で傾斜させることで、第１扁平培養容器２５内において第２骨髄液２３および培養液２４が培養容器２５の頂部２６の側（または底部２８の側）に偏り、培養容器２５の頂部２６の側（または底部２８の側）において第２骨髄液２３と培養液２４との水圧が大きくなって第１間葉系幹細胞３５が培養容器２５の底面３６の側に集中し、それによって第１間葉系幹細胞３５どうしの活性が高まり、培養容器２５の底面３６において第１間葉系幹細胞３５を容易かつ迅速に定着させることができる。
電子顕微鏡１３は、インターフェイス（有線または無線）を介してコンピュータ１１に接続されている。電子顕微鏡１３は、撮像素子によって被写体の拡大画像を撮影する画像撮影機能を有するとともに、その拡大画像をコンピュータ１１に送信する画像送信機能を有する。電子顕微鏡１３は、第１扁平培養容器２５に注入された第２骨髄液２３に含まれる第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔でコンピュータ１１に送信する。電子顕微鏡１３における画像撮影間隔や画像送信間隔は、キーボード１４やマウス１５等の入力装置によって１〜２時間の間で自由に設定することができる。
コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（幹細胞画像記憶手段）。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１６に表示する。担当者は、ディスプレイ１６に表示された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を１２〜２４時間の間において約１〜２時間間隔で確認（視認）し、第２骨髄液２３に含まれる幹細胞３５の平面形状の変化を観察する。なお、担当者が電子顕微鏡１３の観察窓から第１間葉系幹細胞３５の平面形状の変化を１２〜２４時間の間において約１〜２時間間隔で直接観察してもよい。
第１間葉系幹細胞３５の初期平面形状は略円形であり、幹細胞３５の平面形状が略円形の場合、幹細胞３５が第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁内面）に定着しておらず、幹細胞２７が増殖（分化）を開始していない。第１間葉系幹細胞２７の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として幹細胞２７が一方向（所定方向）へ不定形に伸張（拡張）した扁平形状であり、幹細胞２７が第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁内面）に定着し、幹細胞２７が増殖（分化）を開始している。
担当者は、形状変形第１観察工程における観察の結果、図７に示すように、ディスプレイ１６に表示された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像が略円形のまま観察される場合、幹細胞３５が第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁内面）に定着していないと判断し、幹細胞３５の平面形状の変化を約１〜２時間間隔で継続して観察する。担当者は、形状変形第１観察工程における観察の結果、図８に示すように、ディスプレイ１６に表示された第１間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、幹細胞３５が第１扁平培養容器２５の底面３５に定着したと判断する。
第１間葉系幹細胞３５の定着時に容量が３０ｃｃを超過するとともに底面面積が３６ｍｍ２を超過する大きな培養容器を使用すると、幹細胞３５が容器の底面に定着し難くなるとともに幹細胞３５の増殖が遅くなるが、幹細胞培養方法は、前記容量かつ前記底面面積の第１扁平培養容器２５を使用することで、幹細胞３５を培養容器２５の底面３６に容易に定着させることができ、培養容器２５において幹細胞２７を素早く増殖させることができる。
幹細胞培養方法は、第１扁平培養容器２５を体温と略同一の温度で１２〜２４時間静的放置しつつ、１２〜２４時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器２５内の第１間葉系幹細胞３５の初期平面形状からの変形を観察するから、幹細胞３５の変形を見逃すことはなく、幹細胞３５の培養容器２５の底面３６に対する定着を正確に確認することができる。
図９は、第１間葉系幹細胞３５の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図９は、電子顕微鏡１３によって撮影された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を示す。形状変形第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞３５（第１幹細胞）が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、幹細胞３５の第１扁平培養容器２５（第１培養容器）の底面３６への定着を確認した形状変形第１観察工程の後、総平面面積第１観察工程が行われる。
総平面面積第１観察工程では、第１扁平培養容器２５内に注入されている培養液２４を培養容器２５から排出し、培養容器２５内にあらたな培養液２４を注入（収容）する。次に、第１扁平培養容器２５を体温と略同一の温度（約３７℃）で３６〜４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）しつつ、３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器２５の底面３６に定着した第１間葉系幹細胞３５の培養容器２５の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡１３で観察し、幹細胞３５の総平面面積が培養容器２５の底面面積に対して第１目標割合に達したか否かを判断する。第１扁平培養容器２５の底面面積に対する第１間葉系幹細胞３５の総平面面積の第１目標割合は、７０〜８０％（７０〜８０％コンフルエント）である。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第２骨髄液２３に含まれる第１間葉系幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面３６に対する定着を確認した後、ディスプレイ１６に表示された形状変形第１観察終了ボタンをクリックする。形状変形第１観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第４表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第４表示画面には、番号２およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察ボタン、幹細胞第１抽出ボタン、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第４表示画面の幹細胞第２観察ボタンをクリックし、第１扁平培養容器２５を電子顕微鏡１６の試料ホルダ３１から取り外すとともに、培養容器２５のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号２およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察中メッセージ、総平面面積第１観察終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、形状変形第１観察工程において第１扁平培養容器２５に注入した培養液２４を注射器またはピペットを利用して培養容器２５から排出し、注射器またはピペットに吸引されたあらたな培養液２４を培養容器２５に注入（収容）する。あらたな培養液２４は、形状変形第１観察工程において注入されたそれと同一である。担当者は、あらたな培養液２４を第１扁平培養容器２５に注入した後、培養容器２５を電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１に設置（セット）する。
なお、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第１扁平培養容器２５の底部２８との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器２５の底部２８をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２５の底部２８が上となり培養容器２５の頂部２６（注入口２９）が下となるように、培養容器２５を所定角度に傾斜させた状態に保持する（図６参照）。また、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第１扁平培養容器２５の頂部２６との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器２５の頂部２６をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２５の頂部２６が上となり培養容器２５の底部２８が下となるように、培養容器２５を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ３１の上面３２に対する第１扁平培養容器２５の傾斜角度α１は、２〜５°の範囲にあり、好ましくは、２〜３°の範囲にある。
幹細胞培養方法は、第１間葉系幹細胞３５の定着を確認した後、第１扁平培養容器２５の培養液２４を排出しつつあらたな培養液２４を培養容器２５に注入することで、幹細胞３５の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、試料ホルダ３１の上面３２に対して第１扁平培養容器２５を前記傾斜角度で傾斜させることで、第１扁平培養容器２５内において第１間葉系幹細胞３５および培養液２４が培養容器２５の頂部２６の側（または底部２６の側）に偏り、培養容器２５の頂部２６の側（または底部２６の側）において第１間葉系幹細胞３５と培養液２４との水圧が大きくなって第１間葉系幹細胞３５が培養容器２５の底面３６の側に集中し、それによって第１間葉系幹細胞３５どうしの活性が高まり、培養容器２５の底面３６において第１間葉系幹細胞３５を容易かつ迅速に増殖（分化）させることができる。
電子顕微鏡１３は、第１扁平培養容器２５内の第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔でコンピュータ１１に送信する。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（幹細胞画像記憶手段）。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、ディスプレイ１６に表示された第１間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で確認（視認）し、第１扁平培養容器２５の底面３６に定着した幹細胞３５の培養容器２５の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、幹細胞２５の総平面面積が培養容器２５の底面面積に対して第１目標割合（７０〜８０％コンフルエント）に達したか否かを判断する。なお、担当者が電子顕微鏡１３の観察窓から第１間葉系幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面面積に対する総平面面積を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で直接観察し、幹細胞３５の総平面面積が培養容器２５の底面面積に対して第１目標割合（７０〜８０％コンフルエント）に達したか否かを判断してもよい。
担当者は、総平面面積第１観察工程における観察の結果、図８に示すように、ディスプレイ１６に表示された第１間葉系幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合（７０〜８０％コンフルエント）に達していない場合、幹細胞３５の培養容器２５の底面面積に対する総平面面積を約１〜２時間間隔で継続して観察する。なお、ディスプレイ１６に表示された拡大画像の全面積に対して第１間葉系幹細胞３５の総平面面積が第１目標割合に達した場合に、幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に達したものとする。
総平面面積第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞３５が第１扁平培養容器２５の底面３６（底壁内面）において増殖して幹細胞３５がコロニーを形成し、幹細胞３５の平面形状が拡張することで、図９に示すように、ディスプレイ１６に表示された幹細胞３５の培養容器２５の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合（７０〜８０％コンフルエント）に達した場合、培養容器２５から幹細胞３５を抽出する幹細胞第１抽出工程が行われる。幹細胞第１抽出工程では、第１扁平培養容器２５内において増殖（分化）した第１間葉系幹細胞３５を培養容器２５から抽出する。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第１間葉系幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合に達したことを確認した後、ディスプレイ１６に表示された総平面面積第１観察終了ボタンをクリックする。総平面面積第１観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第５表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第５表示画面には、番号２およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出ボタン、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第５表示画面の幹細胞第１抽出ボタンをクリックし、第１扁平培養容器２５のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号２およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出実施中メッセージ、幹細胞第１抽出終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、第１扁平培養容器２５に注入されている総平面面積第１観察工程時の培養液２４を注射器またはピペットを利用して培養容器２５から排出し、培養容器２５内をＰＢＳで洗浄した後、注射器またはピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器２５内に注入する。第１扁平培養容器２５にトリプシン液を注入すると、培養容器２５の底面３６に定着した第１間葉系幹細胞３５がトリプシン液によって底面３６から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、ピペットを利用して幹細胞３５を吸引し、幹細胞３５をピペット内に収容する。
幹細胞培養方法は、約１〜２時間間隔で第１間葉系幹細胞３５の総平面面積を観察することで、幹細胞３５の第１扁平培養容器２５の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器２５の底面面積に対して幹細胞２７の総平面面積が第１目標割合に達したことを確実に把握することができる。
図１０は、幹細胞遠心分離工程の一例を示す説明図である。第１扁平培養容器２５から第１間葉系幹細胞３５を抽出した幹細胞第１抽出工程の後、幹細胞遠心分離工程が行われる。幹細胞遠心分離工程では、幹細胞第１抽出工程によって抽出された第１間葉系幹細胞３５を遠心分離器３７によって層状に遠心分離する。医師や看護師、研究者等の担当者は、第１間葉系幹細胞３５を第１扁平培養容器２５からピペットに吸引した後、ディスプレイ１６に表示された幹細胞第１抽出終了ボタンをクリックする。
幹細胞第１抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第６表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第６表示画面には、番号２およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離ボタン、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、ＱＲコードが印字された第３コード用紙１８ｃを第１間葉系幹細胞３５を注入するガラス試験管３８の外周面に貼付する。次に、工程第６表示画面の幹細胞遠心分離ボタンをクリックし、ガラス試験管３８のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号３およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離実施中メッセージ、幹細胞遠心分離終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、ピペット内の第１間葉系幹細胞３５をそのガラス試験管３８に注入（収容）し、ガラス試験管３８を遠心分離器３７に設置（セット）する。担当者は、第１間葉系幹細胞３５を遠心分離器３７によって所定時間遠心分離した後、ガラス試験管３８を遠心分離器３７から取り出す。ガラス試験管３８内の第１間葉系幹細胞３５は、遠心分離器３７によって上下方向へ２層の層状に分離する。
図１１は、幹細胞第２抽出工程の一例を示す説明図である。第１間葉系幹細胞３５を層状に分離させた幹細胞遠心分離工程の後、幹細胞第２抽出工程が行われる。幹細胞第２抽出工程では、層状に分離した第１間葉系幹細胞３５から下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３９を抽出する。医師や看護師、研究者等の担当者は、遠心分離器３７によって第１間葉系幹細胞３５を上下方向へ層状に分離させた後、ガラス試験管３８を遠心分離器３７から取り出し、ディスプレイ１６に表示された幹細胞遠心分離終了ボタンをクリックする。
幹細胞遠心分離終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第７表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第７表示画面には、番号３およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出ボタン、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第７表示画面の幹細胞第２抽出ボタンをクリックし、ガラス試験管３８のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号３およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出実施中メッセージ、幹細胞第２抽出終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、ガラス試験管３８において層状に分離した第１間葉系幹細胞３５のうちの下層（最下層）に存在する第２間葉系幹細胞３９を抽出する。担当者は、注射器を利用して層状に分離した第１間葉系幹細胞３５のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３９を抽出（吸引）する。または、ピペットを利用して層状に分離した第１間葉系幹細胞３５のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３９を抽出（吸引）する。
幹細胞培養方法は、不要な幹細胞を含む第１間葉系幹細胞３５を遠心分離器３７で遠心分離して上下方向へ層状に分離させ、層状に遠心分離した幹細胞３５のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３９を抽出することで、幹細胞３５から特定の第２間葉系幹細胞３９を確実に抽出することができ、幹細胞３５から不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
第１扁平培養容器２５（第１培養容器）の底面面積に対する第１間葉系幹細胞３５の総平面面積が８０％を超過して幹細胞３５が増殖すると、幹細胞３５の活性が次第に失われるが、幹細胞培養方法は、培養容器２５の底面面積に対して幹細胞３５の総平面面積が７０〜８０％に増殖したときに、幹細胞３５を培養容器２５から抽出するから、幹細胞３５の活性を保持することができ、活性を保持した状態で幹細胞３５を増殖させることができるとともに、幹細胞３５から活性を有する第２間葉系幹細胞３９を抽出することができる。
図１２は、形状変形第２観察工程の一例を示す説明図であり、図１３は、第２扁平培養容器２５（第２培養容器）の側面図である。図１４は、第２間葉系幹細胞３９の平面形状の一例を示す部分拡大図であり、図１５は、第２間葉系幹細胞３９の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図１４，１５は、電子顕微鏡１３によって撮影された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を示す。
第１間葉系幹細胞３５から下層（最下層）に位置する特定の第２間葉系幹細胞３９を抽出した幹細胞第２抽出工程の後、形状変形第２観察工程が行われる。形状変形第２観察工程では、第２間葉系幹細胞３９および培養液２４を第２扁平培養容器３４（第２培養容器）（細胞培養容器）に注入（収容）し、培養容器３４を体温と略同一の温度（約３７℃）で３６〜４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）しつつ、３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器３４内の第２間葉系幹細胞３９（第２幹細胞）の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡１３で観察し、幹細胞３９が培養容器３４の底面４５に定着したか否かを判断する。第２間葉系幹細胞３９および培養液２４を注入する第２扁平培養容器３４の底面４５（底壁外面）には、ドナーを特定するＱＲコードを印字した第４コード用紙１８ｄが貼付されている。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第１間葉系幹細胞３５から特定の第２間葉系幹細胞３９を抽出した後、ディスプレイ１６に表示された幹細胞第２抽出終了ボタンをクリックする。幹細胞第２抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第８表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第８表示画面には、番号４およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察ボタン、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、ＱＲコードが印字された第４コード用紙１８ｄを第２扁平培養容器３４の底面４５（底壁外面）に貼付する。次に、工程第８表示画面の形状変形第２観察ボタンをクリックし、培養容器３４のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号４およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察中メッセージ、形状変形第２観察終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、注射器またはピペットに吸引された第２間葉系幹細胞３９を第２扁平培養容器３４に注入（収容）するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液２４を培養容器３４に注入（収容）する。形状変形第２観察工程で使用される第２扁平培養容器３４（第２培養容器）は、透明なガラスまたは透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面４５を有する平面形状が略四角形の扁平な容器であり、底面４５の面積が第１扁平培養容器２５（第１培養容器）のそれの約２倍である。第２扁平培養容器３４は、頂部４０および底部４２と頂底部４０，４２の間に位置する中央部４１と、頂部４０に形成された注入口４３とを有する。注入口４３は、蓋４４によって水密に閉塞されている。
第２扁平培養容器３４（第２培養容器）は、その容量が約４０〜６０ｃｃ（好ましくは、５０ｃｃ）であり、その底面面積が約５０〜７２ｍｍ２である。第２扁平培養容器２６は、その一辺の長さが約７〜８．５ｍｍである。なお、第２扁平培養容器３４として小容量かつ所定面積の底面４５を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。培養液２４は、形状変形第１観察工程において注入されたそれと同一である。培養容器３４に注入された第２間葉系幹細胞３９は、時間の経過とともに培養容器３４の底面４５に定着しつつ、培養液２４によって培養され、培養容器３４の底面４５において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。
担当者は、注入口４３から蓋４４を取り外し、ピペットに吸引された第２間葉系幹細胞３９を第２扁平培養容器３４の注入口４３から培養容器３４の内部に注入（収容）するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液２４を培養容器３４の注入口４３から培養容器３４の内部に注入（収容）し、蓋４４によって注入口４３を閉塞する。担当者は、第２間葉系幹細胞３９および培養液２４を第２扁平培養容器３４に注入した後、培養容器３４を電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１に設置（セット）する。
電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第２扁平培養容器３４の底部４２との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器３４の底部４２をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３４の底部４２が上となり培養容器３４の頂部４０（注入口４３）が下となるように、培養容器３４を所定角度に傾斜させた状態に保持する。また、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第２扁平培養容器３４の頂部４０との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器３４の頂部４０をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３４の頂部４０が上となり培養容器３４の底部４２が下となるように、培養容器３４を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ３１の上面３２に対する第２扁平培養容器３４の傾斜角度α２は、２〜５°の範囲にあり、好ましくは、２〜３°の範囲にある。
幹細胞培養方法は、試料ホルダ３１の上面３２に対して第２扁平培養容器３４を前記傾斜角度で傾斜させることで、第２扁平培養容器３４内において第２間葉系幹細胞３９および培養液２４が培養容器３４の頂部４０の側（または底部４２の側）に偏り、培養容器２５の頂部４０の側（または底部４２の側）において第２間葉系幹細胞３９と培養液２４との水圧が大きくなって第２間葉系幹細胞３９が培養容器３４の底面４５の側に集中し、それによって第２間葉系幹細胞３９どうしの活性が高まり、培養容器３４の底面４５において第２間葉系幹細胞３９を容易かつ迅速に定着させることができる。
電子顕微鏡１３は、第２扁平培養容器３４に注入された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞３９の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔でコンピュータ１１に送信する。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（幹細胞画像記憶手段）。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１６に表示する。担当者は、ディスプレイ１６に表示された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で確認（視認）し、幹細胞３９の平面形状の変化を観察する。なお、担当者が電子顕微鏡１３の観察窓から第２間葉系幹細胞３９の平面形状の変化を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で直接観察してもよい。
第２間葉系幹細胞３９の初期平面形状は略円形であり、幹細胞３９の平面形状が略円形の場合、幹細胞３９が第２扁平培養容器３４の底面４５（底壁内面）に定着しておらず、幹細胞３９が増殖（分化）を開始していない。第２間葉系幹細胞３９の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として幹細胞３９が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、幹細胞３９が第２扁平培養容器３４の底面４５（底壁内面）に定着し、幹細胞３９が増殖（分化）を開始している。
担当者は、形状変形第２観察工程における観察の結果、図１４に示すように、ディスプレイ１６に表示された第２間葉系幹細胞３９の平面形状が略円形のまま観察される場合、幹細胞３９が第２扁平培養容器３４の底面４５（底壁内面）に定着していないと判断し、幹細胞３９の平面形状の変化を約１〜２時間間隔で継続して観察する。担当者は、形状変形第２観察工程における観察の結果、図１５に示すように、ディスプレイ１６に表示された第２間葉系幹細胞３９の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、幹細胞３９が第２扁平培養容器３４の底面４５に定着したと判断する。
第２間葉系幹細胞３９の定着時に容量が６０ｃｃを超過するとともに底面面積が７２ｍｍ２を超過する大きな培養容器を使用すると、幹細胞３９が容器の底面に定着し難くなるとともに幹細胞３９の増殖が遅くなるが、幹細胞培養方法は、前記容量かつ前記底面面積の第２扁平培養容器３４を使用することで、幹細胞３９を培養容器３４の底面４５に容易に定着させることができ、培養容器３４において幹細胞３９を素早く増殖させることができる。
幹細胞培養方法は、第２扁平培養容器３４を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的放置しつつ、３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器３４内の第２間葉系幹細胞３９の初期平面形状からの変形を観察するから、幹細胞３９の変形を見逃すことはなく、幹細胞３９の培養容器３４の底面４５に対する定着を正確に確認することができる。
図１６は、第２間葉系幹細胞３９の平面形状の他の一例を示す部分拡大図であり、図１７は、第２間葉系幹細胞３９の保存の一例を示す図である。図１６は、電子顕微鏡１３によって撮影された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を示す。形状変形第２観察工程における観察の結果、第２間葉系幹細胞３９（第２幹細胞）が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、幹細胞３９の第２扁平培養容器３４（第２培養容器）の底面４５への定着を確認した幹細胞第３観察工程の後、総平面面積第２観察工程が行われる。
総平面面積第２観察工程では、第２扁平培養容器３４内に注入されている培養液２４を培養容器３４から排出し、培養容器３４にあらたな培養液２４を注入（収容）する。次に、第２扁平培養容器３４を体温と略同一の温度（約３６〜３７℃）で３６〜４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）しつつ、３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で培養容器３４の底面４５に定着した第２間葉系幹細胞３９の培養容器３４の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡１３で観察し、幹細胞３９の総平面面積が培養容器３４の底面面積に対して第２目標割合に達したか否かを判断する。第２扁平培養容器３４の底面面積に対する第２間葉系幹細胞３９の総平面面積の第２目標割合は、８８〜９２％（８８〜９２％コンフルエント）である。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第２間葉系幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面４５に対する定着を確認した後、ディスプレイ１６に表示された形状変形第２観察終了ボタンをクリックする。形状変形第２観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第９表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第９表示画面には、番号４およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第２観察ボタン、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第９表示画面の総平面面積第２観察ボタンをクリックし、第２扁平培養容器３４を電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１から取り外すとともに、培養容器３４のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダによって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号４およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第２観察中メッセージ、総平面面積第２観察終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、総平面面積第２観察工程において第２扁平培養容器３４に注入した培養液２４を注射器またはピペットを利用して培養容器３４から排出し、注射器またはピペットに吸引されたあらたな培養液２４を培養容器３４に注入（収容）する。あらたな培養液２４は、形状変形第１観察工程において注入されたそれと同一である。担当者は、あらたな培養液２４を第２扁平培養容器３４に注入した後、培養容器３４を電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１に設置（セット）する。
電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第２扁平培養容器３４の底部４２との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器３４の底部４２をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３４の底部４２が上となり培養容器３４の頂部４０（注入口４３）が下となるように、培養容器３４を所定角度に傾斜させた状態に保持する（図１３参照）。また、電子顕微鏡１３の試料ホルダ３１の上面３２と第２扁平培養容器３４の頂部４０との間にスペーサー３３を介在させ、培養容器３４の頂部４０をスペーサー３３によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３４の頂部４０が上となり培養容器３４の底部４２が下となるように、培養容器３４を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ３１の上面３２に対する第２扁平培養容器３４の傾斜角度α２は、２〜５°の範囲にあり、好ましくは、２〜３°の範囲にある。
幹細胞培養方法は、第２間葉系幹細胞３９の定着を確認した後、第２扁平培養容器３４の培養液２４を排出しつつあらたな培養液２４を培養容器３４に注入することで、幹細胞３９の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養方法は、試料ホルダ３１の上面３２に対して第２扁平培養容器３４を前記傾斜角度で傾斜させることで、第２扁平培養容器３４内において第２間葉系幹細胞３９および培養液２４が培養容器３４の頂部４０の側（または底部４２の側）に偏り、培養容器３４の頂部４０の側（または底部４２の側）において第２間葉系幹細胞３９と培養液２４との水圧が大きくなって第２間葉系幹細胞３９が培養容器３４の底面４５の側に集中し、それによって第２間葉系幹細胞３９どうしの活性が高まり、培養容器３４の底面４５において第２間葉系幹細胞３９を容易かつ迅速に増殖（分化）させることができる。
電子顕微鏡１３は、第２扁平培養容器３４内の第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞３９の平面形状の拡大画像を約１〜２時間間隔でコンピュータ１１に送信する。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する（幹細胞画像記憶手段）。コンピュータ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、ディスプレイ１６に表示された第２間葉系幹細胞３９の平面形状の拡大画像を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で確認（視認）し、第２扁平培養容器３４の底面４５に定着した幹細胞３９の培養容器３４の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、幹細胞３９の総平面面積が培養容器３４の底面面積に対して第２目標割合（８２〜９２％コンフルエント）に達したか否かを判断する。なお、担当者が電子顕微鏡１３の観察窓から第２間葉系幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面面積に対する総平面面積を３６〜４８時間の間において約１〜２時間間隔で直接観察し、幹細胞３９の総平面面積が培養容器３４の底面面積に対して第２目標割合（８８〜９２％コンフルエント）に達したか否かを判断してもよい。
担当者は、総平面面積第２観察工程における観察の結果、図１５に示すように、ディスプレイ１６に表示された第２間葉系幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合（８８〜９２％コンフルエント）に達していない場合、幹細胞３９の培養容器３４の底面面積に対する総平面面積を約１〜２時間間隔で継続して観察する。なお、ディスプレイ１６に表示された拡大画像の全面積に対して第２間葉系幹細胞３９の総平面面積が第２目標割合に達した場合に、幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に達したものとする。
総平面面積第２観察工程における観察の結果、第２間葉系幹細胞３９が第２扁平培養容器３４（第２培養容器）の底面４５（底壁内面）において増殖して幹細胞３９がコロニーを形成し、幹細胞３９の平面形状が拡張することで、図１６に示すように、ディスプレイ１６に表示された幹細胞３９の培養容器３４の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合（８８〜９２％コンフルエント）に達した場合、培養容器３４から幹細胞３９を抽出する幹細胞第３抽出工程が行われる。幹細胞第３抽出工程では、第２扁平培養容器３４内において増殖（分化）した第２間葉系幹細胞３９を培養容器３４から抽出する。幹細胞培養方法は、約１〜２時間間隔で総平面面積を観察することで、第２間葉系幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器３４の底面面積に対して幹細胞３９の総平面面積が第２目標割合に達したことを確実に把握することができる。
医師や看護師、研究者等の担当者は、第２間葉系幹細胞３９の第２扁平培養容器３４の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合に達したことを確認した後、ディスプレイ１６に表示された総平面面積第２観察終了ボタンをクリックする。総平面面積第２観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ１１は、工程第１０表示画面（図示せず）をディスプレイ１６に表示する。工程第１０表示画面には、番号４およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第２観察終了メッセージ、幹細胞第３抽出ボタンが表示される。
担当者は、工程第１０表示画面の幹細胞第３抽出ボタンをクリックし、第２扁平培養容器３４のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせる。ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号４およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第２観察終了メッセージ、幹細胞第３抽出終了ボタンをディスプレイ１６に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ１１は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ１６に表示する。
担当者は、総平面面積第２観察工程において第２扁平培養容器３４内に注入した培養液２４を注射器またはピペットを利用して培養容器３４から排出し、培養容器３４内をＰＢＳで洗浄した後、注射器またはピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器３４内に注入する。第２扁平培養容器３４にトリプシン液を注入すると、培養容器３４の底面４５に定着した第２間葉系幹細胞３９がトリプシン液によって底面４５から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。
担当者は、ピペットを利用して第２間葉系幹細胞３９を吸引し、幹細胞３９をピペットから保存容器４６に注入（収容）する。保存容器４６に注入された第２間葉系幹細胞３９は、不要な間葉系幹細胞が除去された活性を有する培養対象の特定種類（略単一種）のピュアな間葉系幹細胞である。担当者は、第２間葉系幹細胞３９をピペットから保存容器４６に注入した後、ＱＲコードが印字された第４コード用紙１８ｄを保存容器４６の外周面に貼付する。
担当者は、ディスプレイ１６に表示された工程第１０表示画面の幹細胞第３抽出終了ボタンをクリックし、保存容器４６のＱＲコードをバーコードリーダ１２に読み取らせた後、第２間葉系幹細胞３９を注入した保存容器４６を冷蔵庫４７に収納する。第２間葉系幹細胞３９は、冷蔵庫４７において約３〜４℃で保存される。
ＱＲコードがバーコードリーダ１２からコンピュータ１１に送信されると、コンピュータ１１は、ディスプレイ１６に表示されたドナーデータ（メモリに読み出したドナーデータ）とバーコードリーダ１２によって読み取られたＱＲコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号４およびドナーデータをディスプレイ１６に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、形状変形第１観察終了メッセージ、総平面面積第１観察終了メッセージ、幹細胞第１抽出終了メッセージ、幹細胞遠心分離終了メッセージ、幹細胞第２抽出終了メッセージ、形状変形第２観察終了メッセージ、総平面面積第２観察終了メッセージ、幹細胞第３抽出終了メッセージをディスプレイ１６に表示する。
第２扁平培養容器３４（第２培養容器）の底面面積に対する第２間葉系幹細胞３９の総平面面積が９２％を超過して幹細胞３９が増殖すると、幹細胞３９の活性が次第に失われるが、幹細胞培養方法は、培養容器３４の底面面積に対して幹細胞３９の総平面面積が８８〜９２％に増殖したときに、幹細胞３９を培養容器３４から抽出するから、幹細胞３９の活性を保持することができ、活性を保持した状態で幹細胞３９を増殖させることができる。
幹細胞培養方法は、層状に分離させた第１骨髄液１９のうちの中間層に位置する第２骨髄液２３を抽出し、第２骨髄液２３を培養液２４とともに培養して第１間葉系幹細胞３５（第１幹細胞）を第１扁平培養容器２５（第１培養容器）の底面３６に定着させつつ第１間葉系幹細胞３５を増殖させ、第１間葉系幹細胞３５の総平面面積が第１扁平培養容器２５の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、培養容器２５から第１間葉系幹細胞３５を抽出し、層状に遠心分離させた第１間葉系幹細胞３５のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３９（第２幹細胞）を抽出し、第２間葉系幹細胞３９を培養液２４とともに培養して第２間葉系幹細胞３９を第２扁平培養容器３４の底面４５に定着させつつ第２間葉系幹細胞３９を増殖させ、第２間葉系幹細胞３９の総平面面積が第２扁平培養容器３４の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、培養容器３４から第２間葉系幹細胞３９を抽出するから、層状に分離させた第１骨髄液１９から特定の第２骨髄液２３を抽出し、層状に分離させた第１間葉系幹細胞３５から特定の第２間葉系幹細胞３９を抽出することで、多種雑多な幹細胞の増殖を防ぐことができ、製造対象の特定種類の幹細胞（第２間葉系幹細胞）のみを培養することができるとともに、不要な幹細胞が除去されたピュア（純粋）な幹細胞を製造することができる。
幹細胞培養方法は、特定種類の幹細胞（第２間葉系幹細胞３９）のみを培養することができるから、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確率が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確率が高い幹細胞を培養することができる。
１０ 幹細胞培養システム
１１ コンピュータ
１２ バーコードリーダ
１３ 電子顕微鏡
１４ キーボード
１５ マウス
１６ ディスプレイ
１８ａ 第１コード用紙
１８ｂ 第２コード用紙
１８ｃ 第３コード用紙
１８ｄ 第４コード用紙
１９ 第１骨髄液
２０ ガラス試験管
２１ 試験管立て
２２ 恒温槽
２３ 第２骨髄液
２４ 培養液
２５ 第１扁平培養容器（第１培養容器）
２６ 頂部
２７ 中央部
２８ 底部
２９ 注入口
３０ 蓋
３１ 試料ホルダ
３２ 上面
３３ スペーサー
３４ 第２扁平培養容器（第２培養容器）
３５ 第１間葉系幹細胞（第１幹細胞）
３６ 底面
３７ 遠心分離器
３８ ガラス試験管
３９ 第２間葉系幹細胞（第２幹細胞）
４０ 頂部
４１ 中央部
４２ 底部
４３ 注入口
４４ 蓋
４５ 底面
４６ 保存容器
４７ 冷蔵庫

Claims (11)

  1. ドナーから採取した第１骨髄液を用いて特定種類の幹細胞を培養する幹細胞培養方法において、
    前記幹細胞培養方法が、前記ドナーから採取した第１骨髄液を層状に分離する骨髄液分離工程と、前記骨髄液分離工程によって層状に分離した第１骨髄液のうちの中間層に位置する第２骨髄液を抽出する骨髄液抽出工程と、前記骨髄液抽出工程によって抽出した前記第２骨髄液と所定の培養液とを所定容量かつ所定面積の底面を有する第１培養容器に注入した後、前記第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第１観察工程と、前記形状変形第１観察工程における観察の結果、前記第１幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、前記第１幹細胞が前記第１培養容器の底面に定着したと判断し、前記第１培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第１培養容器に注入し、前記第１培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第１培養容器の底面に定着した前記第１幹細胞の該第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第１観察工程と、前記総平面面積第１観察工程における観察の結果、前記第１培養容器の底面において前記第１幹細胞が増殖して該第１幹細胞の平面形状が拡張し、前記第１幹細胞の総平面面積が前記第１培養容器の底面面積に対して第１目標割合に達した場合、前記第１培養容器から前記第１幹細胞を抽出する幹細胞第１抽出工程と、前記幹細胞第１抽出工程によって抽出した第１幹細胞を層状に遠心分離する幹細胞遠心分離工程と、前記幹細胞遠心分離工程によって前記第１幹細胞を層状に分離させた後、最下層に位置する第２幹細胞を抽出する幹細胞第２抽出工程と、前記幹細胞第２抽出工程によって抽出した前記第２幹細胞と所定の培養液とを前記第１培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の底面を有する第２培養容器に注入し、前記第２培養容器を所定時間静的に放置して前記第２幹細胞を該第２培養容器の底面に定着させるとともに該第２幹細胞を増殖させ、前記第２培養容器の底面において前記第２幹細胞の平面形状が拡張して該第２培養容器の底面面積に対する該第２幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達した場合、前記第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する幹細胞第３抽出工程とを有することを特徴とする幹細胞培養方法。
  2. 前記幹細胞培養方法が、前記幹細胞第２抽出工程によって抽出した前記第２幹細胞と前記培養液とを前記第２培養容器に注入した後、前記第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第２培養容器内の前記第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察する形状変形第２観察工程と、前記形状変形第２観察工程における観察の結果、前記第２幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、前記第２幹細胞が前記第２培養容器の底面に定着したと判断し、前記第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第２培養容器に注入し、前記第２培養容器を２〜５°の傾斜角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置しつつ所定の時間間隔で該第２培養容器の底面に定着した前記第２幹細胞の該第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する総平面面積第２観察工程とを含み、前記幹細胞第３抽出工程では、前記総平面面積第２観察工程における観察の結果、前記第２幹細胞が増殖して該第２幹細胞の平面形状が拡張し、前記第２幹細胞の総平面面積が前記第２培養容器の底面面積に対して第２目標割合に達した場合、前記第２培養容器から前記第２幹細胞を抽出する請求項１に記載の幹細胞培養方法。
  3. 前記第２培養容器の容量が、４０〜６０ｃｃであり、前記第２幹細胞の初期平面形状が、略円形であり、前記第２幹細胞の変形後の平面形状が、前記略円形を核として該第２幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、前記形状変形第２観察工程では、前記第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、前記３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で前記第２培養容器内の第２幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、前記第２幹細胞が前記不定形の扁平形状に変形した場合に該第２幹細胞が前記第２培養容器の底面に定着したと判断する請求項２に記載の幹細胞培養方法。
  4. 前記総平面面積第２観察工程では、前記第２培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、前記３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で前記第２培養容器の底面に定着した前記第２幹細胞の該第２培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する請求項２または請求項３に記載の幹細胞培養方法。
  5. 前記第２培養容器の底面面積に対する前記第２幹細胞の総平面面積の第２目標割合が、８８〜９２％である請求項２ないし請求項４いずれかに記載の幹細胞培養方法。
  6. 前記骨髄液分離工程では、前記ドナーから２〜３ｃｃの前記第１骨髄液を採取し、前記２〜３ｃｃの第１骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、前記分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して前記第１骨髄液を該分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、前記骨髄液抽出工程では、前記分離容器内において層状に分離した前記第１骨髄液のうちの中間層に位置する前記第２骨髄液を抽出する請求項１ないし請求項５いずれかに記載の幹細胞培養方法。
  7. 前記第１培養容器の容量が、２０〜３０ｃｃであり、前記第１幹細胞の初期平面形状が、略円形であり、前記第１幹細胞の変形後の平面形状が、前記略円形を核として該第１幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、前記形状変形第１観察工程では、前記第１培養容器を体温と略同一の温度で１２〜２４時間静的に放置しつつ、前記１２〜２４時間の間において１〜２時間間隔で前記第１培養容器内の第１幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、前記第１幹細胞が前記不定形の扁平形状に変形した場合に該第１幹細胞が前記第１培養容器の底面に定着したと判断する請求項１ないし請求項６いずれかに記載の幹細胞培方法。
  8. 前記総平面面積第１観察工程では、前記第１培養容器を体温と略同一の温度で３６〜４８時間静的に放置しつつ、前記３６〜４８時間の間において１〜２時間間隔で前記第１培養容器の底面に定着した前記第１幹細胞の該第１培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する請求項１ないし請求項７いずれかに記載の幹細胞培養方法。
  9. 前記第１培養容器の底面面積に対する前記第１幹細胞の総平面面積の第１目標割合が、７０〜８０％である請求項１ないし請求項８いずれかに記載の幹細胞培養方法。
  10. 前記幹細胞遠心分離工程では、前記第１幹細胞を分離容器に注入し、前記分離容器を遠心分離器に設置して前記第１幹細胞を遠心分離させ、前記幹細胞第２抽出工程では、前記分離容器内において前記第１幹細胞を層状に遠心分離させた後、最下層に位置する前記第２幹細胞を抽出する請求項１ないし請求項９いずれかに記載の幹細胞培養方法。
  11. 前記第１および第２幹細胞が、間葉系幹細胞である請求項１ないし請求項１０いずれかに記載の幹細胞培養方法。
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