CN103436491B - 一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，该方法以昆虫鳞翅为基底，所述昆虫鳞翅倾斜放置于细胞悬浮液中，细胞在重力作用下垂直落在所述昆虫鳞翅表面，且细胞数目自上而下逐渐增多；所述昆虫鳞翅表面的细胞根据昆虫鳞翅表面的微纳结构定向排列。本发明以昆虫鳞翅作为基底，易于获得，安全无毒，可实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养，同时规避了人工合成材料带来的一系列工艺复杂及安全问题；利用重力作用形成的密度梯度分布，规避了机械作用力对细胞的损伤，保留了细胞活力，形成的具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列对于组织再生包括连接组织再生与修复都具有潜在的应用前景和现实意义。

Description

一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法
技术领域
本发明属于生物材料及组织工程技术领域，具体涉及一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法。
背景技术
随着组织工程中器官与组织修复、移植、生物传感器等研究的发展，细胞定向排列生长以及细胞密度的梯度分布越来越重要。目前随着微纳技术的成熟，细胞培养的基底材料可以在体外实现可控的细胞粘附、定向排列等行为。与此同时，利用机械力、物理化学方法以及喷墨打印机技术等也可以在体外实现细胞密度的梯度分布。
然而，目前许多基底材料的合成工艺复杂，甚至涉及到一些有毒物质，并且无论是物理化学方法还是打印技术都会对细胞活力造成损害。另外，在目前细胞培养的研究中，几乎没有一种方法能够实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养方法。因此，无法满足医用种植体、组织工程尤其是骨连接组织工程等领域的需要。
综上所述，亟需一种能够实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养方法，以实现细胞定向有序排列并具一定的密度梯度分布。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种以昆虫鳞翅为基底的细胞培养方法，可实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养方法，对于组织再生包括连接组织再生与修复都具有潜在的应用前景和现实意义。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，该方法以昆虫鳞翅为基底，所述昆虫鳞翅倾斜放置于细胞悬浮液中，细胞在重力作用下垂直落在所述昆虫鳞翅表面，且细胞数目自上而下逐渐增多；所述昆虫鳞翅表面的细胞根据昆虫鳞翅表面的微纳结构定向排列。
在本发明一个较佳实施例中，所述方法具体步骤如下：
（1）获取和固定昆虫鳞翅：截取长方形昆虫鳞翅薄片，用聚苯乙烯溶液将所述鳞翅薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上，并做亲水处理；
（2）配制细胞悬浮液：选取目标细胞，用培养皿将目标细胞稀释成一定浓度的悬浮液，将所得细胞悬浮液放入玻璃容器中；
（3）细胞沉降：将步骤（1）中制备的昆虫鳞翅以一定的倾斜角插入步骤（2）中准备好的细胞悬浮液中，并使昆虫鳞翅没入细胞悬浮液中，静置数小时；
（4）获得具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列：将步骤（3）中的昆虫鳞翅取出，用磷酸缓冲液冲洗掉黏附不牢固的细胞，得到所需的具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（1）中，昆虫鳞翅薄片选自大蓝闪蝶、欢乐女神闪蝶、小蓝闪蝶、大陆闪蝶、西方蓝闪蝶、白斑眼蝶、玉斑凤蝶中的至少一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（2）中，目标细胞为具有纤维状形状的细胞。
在本发明一个较佳实施例中，所述目标细胞为成纤维细胞、骨髓干细胞和神经细胞中的至少一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（2）中，细胞悬浮液的浓度为2×105个/mL。
在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（3）中，昆虫鳞翅的插入数量为1片或者多片不同表面结构的昆虫鳞翅的组合。
在本发明一个较佳实施例中，所述昆虫鳞翅的插入倾斜角度为5～85°。
在本发明一个较佳实施例中，所述昆虫鳞翅的插入方向为以表面纹路横向插入或纵向插入中的至少一种。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，该方法应用昆虫鳞翅这种天然生物材料作为基底，具有易于获得，安全无毒的特点，可实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养，同时规避了人工合成材料带来的一系列工艺复杂及安全问题；利用重力作用形成的密度梯度分布，规避了机械作用力对细胞的损伤，保留了细胞活力，形成的具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列对于组织再生包括连接组织再生与修复都具有潜在的应用前景和现实意义。
附图说明
图1是本发明一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法的流程示意图；
附图中各部件的标记如下：1.昆虫鳞翅和细胞的准备，2.将昆虫鳞翅倾斜放置于一定密度的细胞悬浮液中，3. 沉降后细胞液中的昆虫翅基底和细胞排列。具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1，本发明实施例包括：
昆虫鳞翅是一种天然生物材料，安全无毒，易于获得，且其表面具有微纳结构，能够调节与其相接触的细胞功能，促进细胞的定向排列。
与此同时，利用重力自然沉降作用，细胞垂直落在鳞翅表面，形成细胞数目自上而下逐渐增多的密度梯度分布，细胞活力得到保证，实现细胞密度和排列同时可控的细胞培养方法。
实施例1
基于闪蝶翅基底的细胞密度和排列可控培养
1、获取和固定闪蝶鳞翅：
截取长方形闪蝶鳞翅薄片，用聚苯乙烯溶液将翅膀薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上。
2、配制细胞悬液：
选取NIH/3T3小鼠的成纤维细胞，用培养基将成纤细胞稀释成浓度为2×105/mL的细胞悬浮液，将所得的细胞悬浮液放入一定大小的玻璃容器中。
3、细胞沉降：
将步骤1获得的闪蝶鳞翅以与水平方向15°的倾斜角插入步骤2中准备好的细胞悬液中，于37℃下静置数小时。
4、获得具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列：
将步骤3中的闪蝶鳞翅取出，用磷酸缓冲液冲洗掉黏附不牢固的细胞，得到所需的具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列。
实施例2
两种细胞在同一片闪蝶鳞翅上的细胞密度和排列可控的培养
1、获取和固定闪蝶鳞翅：
截取长方形闪蝶鳞翅薄片，用聚苯乙烯溶液将翅膀薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上。
2、配制细胞悬液：
选取NIH/3T3小鼠的成纤维细胞和MFC小鼠骨髓干细胞，用培养基分别稀释成浓度为2×105/mL的细胞悬浮液，将所得的细胞悬浮液分别放入一定大小的玻璃容器中。
3、细胞沉降：
将步骤1获得的闪蝶鳞翅以与水平方向15°的倾斜角插入步骤2中准备好的小鼠成纤维细胞悬液中，37℃下静置数小时后取出，用磷酸换冲液冲洗数遍后；将闪蝶鳞翅头尾倒置后继续以与水平方向30°的倾斜角插入步骤2中准备好的小鼠骨髓干细胞悬液中，37℃下静置数小时。
4、获得具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列：
将步骤3中的闪蝶翅基底取出，用磷酸缓冲液冲洗3遍去除黏附不牢固的细胞，得到两种细胞密度和排列可控培养的闪蝶翅基底。
闪蝶翅基底生物相容性测试：
1、闪蝶翅基底的细胞毒性测试：
采用MTT细胞毒性测试法，对闪蝶鳞翅基底上和普通培养皿上培养的细胞进行细胞毒性测试来观察闪蝶鳞翅的生物毒性。测试结果显示，生长于闪蝶鳞翅基底上与普通培养皿上的细胞活力无统计性差异。
2、闪蝶鳞翅基底的细胞活力测试：
用Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液分别对闪蝶基底上的细胞进行荧光染色。Calcein-AM可以对活细胞染色，PI溶液可以对死细胞染色，在荧光显微镜下分别显示为绿色和红色。通过对细胞进行染色后，用荧光显微镜同时观察闪蝶鳞翅基底上活细胞和死细胞的数目。结果显示，闪蝶鳞翅基底上几乎全为绿色荧光的活细胞，闪蝶鳞翅基底上的细胞活力旺盛。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，该方法以昆虫鳞翅为基底，所述昆虫鳞翅倾斜放置于细胞悬浮液中，细胞在重力作用下垂直落在所述昆虫鳞翅表面，且细胞数目自上而下逐渐增多；所述昆虫鳞翅表面的细胞根据昆虫鳞翅表面的微纳结构定向排列；
所述方法具体步骤如下：
（1）获取和固定昆虫鳞翅：截取长方形昆虫鳞翅薄片，用聚苯乙烯溶液将所述鳞翅薄片背面朝上固定在相同大小的玻璃片上，并做亲水处理；
（2）配制细胞悬浮液：选取目标细胞，用培养皿将目标细胞稀释成一定浓度的悬浮液，将所得细胞悬浮液放入玻璃容器中；所述目标细胞为具有纤维状形状的细胞；
（3）细胞沉降：将步骤（1）中制备的昆虫鳞翅以一定的倾斜角插入步骤（2）中准备好的细胞悬浮液中，并使昆虫鳞翅没入细胞悬浮液中，静置数小时；
（4）获得具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列：将步骤（3）中的昆虫鳞翅取出，用磷酸缓冲液冲洗掉黏附不牢固的细胞，得到所需的具有定向排列规律和密度梯度分布的细胞排列。
2.根据权利要求1所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，昆虫鳞翅薄片选自大蓝闪蝶、欢乐女神闪蝶、小蓝闪蝶、大陆闪蝶、西方蓝闪蝶、白斑眼蝶、玉斑凤蝶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述目标细胞为成纤维细胞、骨髓干细胞和神经细胞中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，细胞悬浮液的浓度为2×105个/mL。
5.根据权利要求1所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，昆虫鳞翅的插入数量为1 片或者多片不同表面结构的昆虫鳞翅的组合。
6.根据权利要求5所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述昆虫鳞翅的插入倾斜角度为5 ～ 85°。
7.根据权利要求6所述的基于昆虫翅基底的细胞密度和排列可控培养的方法，其特征在于，所述昆虫鳞翅的插入方向为以表面纹路横向插入或纵向插入中的至少一种。
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