WO2013073672A1 - 細胞の立体構造体作製用の支持体を作製するための装置 - Google Patents

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insertion guide
opening
openings
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功一 中山
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国立大学法人佐賀大学
株式会社サイフューズ
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    • Y10T29/53961—Means to assemble or disassemble with work-holder for assembly

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for producing a support used as a scaffold when manufacturing a three-dimensional structure of a cell.
  • Patent Document 1 describes an improved method for generating cartilage-like tissue used to treat cartilage damage in joints.
  • Patent Documents 2 and 3 describe a support that is a scaffold. Has been.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to easily produce a support body in which needle-like bodies are arranged on a base.
  • the present invention is as follows. (1) a base on which openings for planting needles are arranged; A holder for holding the foundation; An insertion guide provided with a plurality of slots for mounting the needle-like bodies corresponding to the openings, and formed with a supply port for feeding the needle-like bodies to the base at one end of the slots; A device for producing a support for fixing cells, comprising: (2) The apparatus according to (1), further including an alignment mechanism that moves the insertion guide so that the supply port is aligned with an opening on a base held by the holder. (3) The device according to (1), wherein the openings of the base are arranged in a matrix.
  • a method for producing a support for fixing cells comprising:
  • a support body in which a plurality of needle-like bodies are implanted on the base can be easily produced by introducing the needle-like bodies into openings formed and arranged on the base.
  • the present invention provides an apparatus (cell immobilization support producing apparatus) for easily implanting a large number of needle-like bodies on a base and producing a support easily.
  • the inventor holds a base on which a plurality of openings for attaching a needle-like body is formed, and an insertion guide for the needle-like body on which the needle-like body can be placed corresponding to the plurality of openings formed in the base Has been invented, and a support manufacturing apparatus has been invented comprising a mechanism (positioning mechanism) for moving the insertion guide so that the needle-like body can be introduced into the opening of the base.
  • FIG. 1 is an explanatory view for explaining the outline of the manufacturing apparatus of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing an overview of the manufacturing apparatus of FIG. 1 in which a plurality of foundations are set.
  • the production apparatus 2 includes a base 10, a holder 4, and an insertion guide 6, and further includes an alignment mechanism as necessary.
  • the base 10 serving as the basis of the support body is formed in a plate shape, for example, and the holder 4 includes a side wall 4 a and a stopper 4 b in accordance with the shape of the base 10 in order to hold the base 10.
  • a plurality of openings 15 arranged in a matrix are formed in the base 10, and needle-like bodies 20 are inserted into the openings 15 and fixed.
  • An insertion guide 6 is provided next to the holder 4, and the insertion guide 6 includes a slot 12 for mounting a plurality of needle-like bodies 20 side by side in parallel. In each slot 12, the needle-like body 20 is placed so that the tip 20a of the needle-like body 20 is positioned closer to the holder 4 side than the rear end 20b.
  • the needle-like body 20 only needs to function like a skewer, and the shape is not limited to a needle-like shape with a sharp tip and a thick rear end.
  • the shape of the needle-like body 20 may be, for example, uniformly thin from the front end to the rear end, or may be a screw-like shape in which peaks and troughs are alternately repeated.
  • the material of the needle-like body 20 is not particularly limited, but can be formed of a resin such as polypropylene or nylon, or an alloy such as stainless steel. 1 and 2 show a mode in which the holder 4 holds the three bases 10, but the number of the bases 10 held by the holder 4 is not necessarily limited to three, and may be less than three or four or more.
  • a supply port 12a is formed at the end of each slot 12 of the insertion guide 6 on the holder 4 side, and the needle-like body 20 placed in the slot 12 is connected to the outside of the insertion guide 6 through the supply port 12a, for example,
  • the needle-like body 20 can be supplied to the base 10.
  • the alignment mechanism provided in the production apparatus 2 can bring the insertion guide 6 into contact with the base 10 held by the holder 4 and can apply pressure to the direction of the holder.
  • a plurality of slots 12 are formed so as to correspond to the matrix-shaped openings 15 formed on the base.
  • the slot can have any shape as long as the needle-like body can be movably mounted. *
  • the openings 10 of 26 rows and 26 columns (26 ⁇ 26) are formed in a matrix in the base 10, 26 openings 15 are formed in each row, and the insertion guide 6 has one row. Twenty-six slots 12 are formed in all the openings 15. However, in the present invention, the number of slots 12 provided in the insertion guide 6 may be a part of the number of openings 15.
  • a needle-like body 20 can be movably placed in each slot 12, and a supply port 12 a for feeding the needle-like body 20 to the outside of the insertion guide 6 at the end of each slot 12 on the holder 4 side. Is formed.
  • the needle-like body 20 placed on the slot 12 can be introduced from the slot 12 into the opening 15.
  • a method for introducing the needle-like body into the opening for example, a method of pushing out the needle-like body by applying a force in the base direction from the rear end 20b of the needle-like body using a pushing member described below and a charge are used.
  • an electrical method is mentioned, it is not limited to these, Any method may be taken as long as a needlelike object can be introduced into an opening.
  • the supply port 12a and the opening 15 are spatially separated to the extent that the introduction of the needle-like body 20 is not hindered. It may be.
  • the needle-like body When the needle-like body is introduced into the base, the needle-like body penetrates the entire opening along the hole formed in the base from the opening 15 on the near side of the base, protrudes from the opening on the back side of the base, and is placed on the base. Planted. In this case, when a plurality of bases are stacked, the needle-like body that penetrates the first base hits the second base aligned next.
  • the needle-like body can be introduced into the opening 15 of the second foundation. Therefore, even when a plurality of foundations are stacked and used, the needle-like body does not pierce and bend into the second foundation.
  • the bases of different opening patterns are aligned, as described above, there may be a problem that the needle-like body penetrating the first base pierces the second base. Therefore, when using a base having a different opening pattern, the next base is aligned with an interval corresponding to the length of the needle-like body, or one base is provided for each operation without arranging a plurality of bases. And the needle-like body may be inserted into the base.
  • Each base 10 is formed with, for example, a 26 ⁇ 26 opening 15 (the opening 15 is not limited to 26 ⁇ 26), but the interval (pitch) between adjacent openings 15 is a three-dimensional cell. It may be determined appropriately according to the size of the cell mass (spheroid) pierced by the needle-like body 20 at the time of manufacturing the structure.
  • the interval (pitch) between the openings defines the interval between the needle-like bodies of the support manufactured by the manufacturing apparatus of the present invention.
  • the interval between the needle-like bodies may vary depending on the size of the cell mass (spheroid) penetrating the needle-like bodies, but is preferably defined by a length of approximately 100% to 110% of the diameter of the cell mass.
  • the interval between the needle-like bodies is preferably about 1 mm to 1.1 mm.
  • the interval between the openings is set so that the needle-like body is positioned at such an interval that it can come into contact with the adjacent cell mass when the needle-like body penetrates the cell mass.
  • the support produced by implanting the needle-like body on the base can be pulled out in the longitudinal direction of the insertion guide or taken out from the insertion guide.
  • a plurality of bases are arranged and the needle-like body is inserted into the opening of the second base, if it is pulled out in the longitudinal direction of the insertion guide and in the direction opposite to the second base, Good.
  • the needle-like body is introduced into the opening 15 from the tip 20a of the needle-like body 20, but may be a device that introduces the needle-like body 20 into the opening 15 of the base 10 from the rear end 20b.
  • the needle-like body 20 protrudes toward the insertion guide 6 (see FIG. 6). Therefore, the insertion guide 6 is moved from the upper side to the lower side. Therefore, it is necessary to introduce the needle-like body 20 into the opening.
  • FIG. 3 is an explanatory view for explaining a manufacturing apparatus for introducing the needle-like body 20 from the rear end 20b of the needle-like body 20 into the opening 15 of the base 10.
  • the manufacturing apparatus 102 includes a base 10, a holder 104, an insertion guide 106, an alignment mechanism, a biasing plate 108, and the like.
  • the holder 104 has a side wall 104a that comes into contact with the side surface 10c of the base 10 and a stopper 104b that comes into contact with the peripheral portion 10b of the base 10 while being pressed.
  • the urging plate 108 presses the base 10 in the holder 104 toward the insertion guide 106, contacts the peripheral portion 10b of the base 10 while being pressed by the stopper 104b, and the base 10 is moved toward the insertion guide 106 and held. Is done.
  • the manufacturing apparatus 102 includes a biasing plate 108 that biases the base 10 in the holder 104 toward the insertion guide 106.
  • the urging plate 108 presses the base 10 toward the insertion guide 106
  • the peripheral portion 10 b of the base 10 is firmly fixed so as not to move in contact with the holder 104.
  • the base 10 adjacent to the base 10 to be extracted is pushed toward the insertion guide 106 by the biasing plate 108.
  • the peripheral portion 10b of the base 10 comes into contact with the stopper 104b of the holder 104 and stops, and the opening 15 on the base 10 is exposed so as to communicate with the supply port 112a of the insertion guide 106.
  • the needle-like body 20 is again placed in the slot 112 of the insertion guide 106 and the needle-like body 20 is introduced into the opening 15 from the slot 112, whereby the needle-like body is formed in the opening 15 of the base 10. 20 can be planted.
  • three bases 10 that can be held in the holder 104 are illustrated in FIGS. 3 and 4, the number is not limited to this, and may be four or more or less than three.
  • the manufacturing apparatus 2 shown in FIGS. 1 and 2 and the manufacturing apparatus 102 shown in FIGS. 3 and 4 have an alignment mechanism for aligning the supply ports 12a and 112a of the slots 12 and 112 with the openings 15 of the base 10.
  • Each has.
  • Examples of the member constituting the alignment mechanism include a spacer or a click mechanism, but are not limited thereto.
  • the manufacturing apparatus 2 illustrated in FIGS. 1 and 2 includes an alignment mechanism, and the alignment mechanism can adjust the position (for example, height) of the insertion guide 6. By adjusting the height of the insertion guide 6, it is possible to determine which opening 15 the supply port 12a communicates with.
  • the space between the supply port 12a of the insertion guide 6 and the opening 15 on the base 10 is such that introduction of the needle-like body 20 is not hindered. May be separated. Even if the insertion guide 6 and the base 10 are arranged in this way, the needle-like body 20 can be introduced from the slot 12 into the opening.
  • Various structures are conceivable as means for adjusting the height of the insertion guide 6.
  • the height is adjusted by stacking spacers on the lower side of the insertion guide 6 will be described.
  • the method of adjusting is not limited to the following example.
  • FIG. 5 is an explanatory view for explaining an alignment mechanism that raises the insertion guide 6 by placing a spacer on the lower side of the insertion guide 6.
  • the insertion guide 6 can be raised by placing the spacer 30 on the lower side of the insertion guide 6, thereby adjusting the position of the insertion guide 6.
  • the spacer 30 is formed to have the same thickness as the pitch between rows in the vertical direction H of the openings arranged in the matrix, so that the insertion guide 6 is slotted into the opening 15 in the row adjacent to the upper side by overlapping the spacer 30.
  • the needle-like body 20 placed in the slot 12 with the twelve supply ports 12 a communicating can be introduced into the opening 15.
  • the spacer 30 is placed under the insertion guide 6 so that the supply port 12a of the slot 12 is provided in the opening 15 in the upper row.
  • the needle-like body 20 can be introduced into the opening 15.
  • the needle-like body 20 can be implanted.
  • the needle-like body may not be implanted in all the openings 15. It is possible to obtain a support body having a desired shape by selecting an opening in which the needle-shaped body is installed from the openings arranged in a matrix, and the three-dimensional structure of the cell having the desired shape using the support body. A structure can be obtained.
  • the needle-like body 20 is introduced from the front end 20 a into the opening 15, and the needle-like body 20 is pushed into the opening 15 until the rear end 20 b is within the opening 15.
  • the insertion guide 6 can be moved from the lower side to the upper side along the vertical direction H to introduce the needle-like body 20 into the opening 15, but the mechanism of FIG. It is also possible to introduce the needle-like body 20 into all the openings 15 by moving from the lower side to the lower side.
  • the insertion guide 6 is moved from the upper side to the lower side, the insertion guide 6 is placed on the previously stacked spacers 30, and one spacer 30 is provided in accordance with the introduction of the needle-like body 20 into the opening 15.
  • the needle-like body 20 can be implanted in the base 10 by introducing the needle-like body 20 into the opening 15 while moving the insertion guide 6 from the upper side to the lower side.
  • a recess / projection is provided on the front side of the spacer 30, and a recess / projection on the front side of another spacer 30 is provided on the back side of the spacer 30.
  • Protrusions / concaves that fit with each other may be provided to prevent the spacer 30 from swinging and to improve stability.
  • a recess 30a is provided on the front side of the spacer 30, and this recess 30a is fitted to a protrusion (not shown) formed on the bottom of the insertion guide 6, thereby stabilizing the insertion guide 6 so that it does not move. 2 can be located.
  • the communication between the supply port 12a formed at one end of the slot 12 and the opening 15 of the base 10 can be stably maintained.
  • the needle-like body 20 placed in the slot 12 can be more reliably guided into the opening 15.
  • the alignment mechanism shown in FIGS. 5A and 5B can move the insertion guide 6 from the lower side to the upper side along the vertical direction H to implant the needle-like body 20 on the base 10.
  • the insertion guide 6 can be moved from the upper side to the lower side to implant the needle-like body 20 on the base 10.
  • the insertion guide 6 is moved from the upper side to the lower side, and the needle-like body 20 is implanted in the base 10.
  • FIG. 6 is an explanatory view showing a part of an alignment mechanism for previously superposing the spacer 30 on the lower side of the insertion guide 106 illustrated in FIGS. 3 and 4 and introducing the needle-like bodies in order from the upper row to the lower row. It is.
  • FIG. 6A for example, after the introduction of the needle-like body 20 into the uppermost opening (end opening) 15 is completed, one spacer 30 is removed and the height of the insertion guide 106 is increased by one line.
  • the needle-like body 20 can be introduced into each opening 15 in the second row from the top by being lowered by an amount. After the needle-like body 20 is introduced into the openings 15 in the second row from the top, as shown in FIG.
  • one spacer 30 is further removed, and the height of the insertion guide 106 is further lowered by one row, from above.
  • the needle-like body 20 can be introduced into each opening 15 in the third row.
  • the needles 20 may be implanted in the base 10 by overlapping the spacers 30 in advance and moving the movement guide 106 from the upper side to the lower side.
  • the needle-like body 20 is introduced into the opening 15 from the rear end 20b of the needle-like body 20 and the needle-like body 20 is implanted in the base 10
  • the needle-like body 20 from the base 10 to the insertion guide 106 side Therefore, the insertion guide 106 is moved from the upper side to the lower side to introduce the needle-like body 20 into the opening 15.
  • FIGS. 5 and 6 the insertion guides 6 and 106 are raised / lowered using the spacer, but the manner of raising / lowering the insertion guide on which the needle-like body 20 is placed is not limited thereto.
  • the both sides of the insertion guide may be supported by a click mechanism so as to be raised / lowered.
  • the insertion guide can be moved more easily by raising / lowering the insertion guide supported by a click mechanism.
  • FIG. 7 is a partial cross-sectional view of the alignment mechanism that is held by the click mechanism so as to be movable in the vertical direction H, cut along a plane substantially parallel to the vertical direction H. As shown in FIG. 7, the click mechanism may be generally used.
  • the click mechanism 50 includes an insertion guide 52 and a guide support body 54 that supports the insertion guide 52 so as to be movable in the vertical direction H.
  • the insertion guide 52 includes a slot 60 on which the needle-like body 20 is placed, an engagement claw 56, and a spring 58 that biases the engagement claw 56 outward, and the guide support 54 is engaged with the engagement claw 56.
  • each notch 70-72 is formed along the vertical direction H, and the spacing between the notches 70, 71, 72 is matched to the inter-row pitch of the openings 15 of the base 10 (see FIG. 1).
  • the insertion guide 52 moves upward so that the engagement claw 56 engages with the notch 71 from the state where the engagement claw 56 engages with the notch 70, the needle-like body 20 is placed in the opening 15 in the next row. Align the insertion guide so that it can be introduced. Further, when the insertion guide 52 moves downward so that the engaging claw 56 engages with the notch 70 so as to engage with the notch 72, the needle-like body 20 is introduced into the opening 15 in the next lower row. Align the insertion guide so that it can.
  • the click mechanism allows the supply port of the slot 60 to communicate with the next opening 15 of the base 10.
  • the insertion guide 52 can be stationary.
  • the spacer 30 described above is provided by using the click mechanism in which the insertion guide 52 includes the engaging claw 56 and the guide support 54 that supports the insertion guide 52 so as to be movable in the vertical direction H is provided with the notches 70 to 72.
  • the height of the insertion guide 52 can be easily adjusted without using.
  • the click mechanism can also be used as a movement adjusting means for the insertion guide.
  • the insertion guide can be aligned by a robot or by providing a height control mechanism.
  • this invention is a manufacturing apparatus and needle-like structure of a structure which implants a needle-like body in a horizontal direction. It should be understood that a manufacturing apparatus configured to implant the body in an oblique direction is also included.
  • FIG. 8 shows a mode in which the needle-like body 20 is introduced into the opening 15 by using a pushing member that collectively pushes the needle-like body 20 placed in the slot 12 illustrated in FIG. 1 or 2 into the opening 15 of the base 10. It is explanatory drawing explaining about. As shown in FIG.
  • the pressing member 80 is formed with a plurality of pressers 82 that match the recesses of the slots 12, and contacts the pressers 82 in a state where the end of the needle-like body 20 is pressed.
  • the pushing member 80 is moved to the supply port 12a side, the needle-like body 20 placed on the slot 12 is pushed out toward the base 10 and is needle-like into the opening of the base 10 through the supply port 12a.
  • the body 20 is introduced.
  • the pressing members 82 that engage with all the slots 12 in the pushing member 80, the needle-like bodies 20 in all the slots 12 can be introduced into the base 10 from the slots 12 in a lump. It is possible to reduce the labor required for introduction into the opening 15 and improve the convenience.
  • a three-dimensional structure of cells can be formed by penetrating and accumulating cell aggregates (spheroids) through needle-like bodies 20 implanted in the base 10 using the production apparatuses 2 and 102 of the present invention.
  • the cells used at this time include undifferentiated cells such as stem cells (ES cells, cord blood-derived cells, undifferentiated mesenchymal cells, etc.), somatic cells, tumor cells, and differentiated cells thereof.
  • stem cells ES cells, cord blood-derived cells, undifferentiated mesenchymal cells, etc.
  • somatic cells tumor cells
  • differentiated cells thereof differentiated cells thereof.
  • fibroblasts, stem cells, vascular endothelial cells, epidermal cells, epithelial cells, osteoblasts, chondrocytes or adipocytes that can be easily induced to differentiate from undifferentiated mesenchymal stem cells can be used.
  • Cells such as chondrocytes or bone cells can also be used.
  • the spheroid is not necessarily formed as an aggregate of a single type of cell, and may be formed from a plurality of types of cells as long as the spheroid is formed.
  • Cells are broadly classified into floating cells and anchorage-dependent cells. Blood cells and immune cells belong to the former, and cells such as skin and bone belong to the latter. Cells such as skin and bone die in a floating state in the culture solution and need to be propagated by attaching to a petri dish such as glass.
  • spheroids cell aggregates
  • spheroids when cells are collected in one place in a culture vessel whose surface has been treated with polytetrafluoroethylene, the cells seek a scaffold and adhere to each other to form cell aggregates, that is, spheroids. . Furthermore, when spheroids are bonded and fused together, a large shape is formed. Through spheroids, it is considered that cells shift to the stationary phase in the cell cycle and protein production increases. Therefore, in the present invention, in order to induce the cells in the stationary phase, it is preferable to form the three-dimensional structure of the cells after making them into spheroids.
  • the culture solution used for culturing cells depends on the cells to be cultured, a conventional synthetic medium or natural medium can be used.
  • a synthetic medium is preferable in view of infection from bacteria / viruses from animal-derived substances, supply timing and quality stability.
  • As the synthetic medium for example, ⁇ -MEM (Mnimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) RPMI 1640 medium, CMRC medium, HAM medium, DME / F12 medium, MCDB medium, and the like can be used.
  • growth factors, growth factors, physiologically active substances such as hormones, and other various substances having pharmacological action may be added as appropriate.
  • growth factors or cell growth factors include bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor, insulin-like growth factor (IGF). like Growth Factor), Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), known serum components such as transferrin (concentration is adjusted as appropriate), various vitamins and streptomycin, etc. There are antibiotics.
  • hormones include insulin, transferrin, dexamethasone, hydrocortisone, thyroxine, 3,3 ′, 5-triiodothyronine, 1-methyl-3-butylxanthine, progesterone, and the like.
  • physiologically active substances typically include, for example, ascorbic acid (particularly L-ascorbic acid), biotin, calcium pantothenate, ascorbyl diphosphate, vitamin D and other vitamins, serum albumin, transferrin and other proteins , Lipids, lipid acid sources, linoleic acid, cholesterol, pyruvic acid, nucleosides for DNA and RNA synthesis, glucocorticoids, retinoic acid, glycerophosphate, monothioglycerol and the like.
  • ascorbic acid particularly L-ascorbic acid
  • biotin particularly L-ascorbic acid
  • calcium pantothenate ascorbyl diphosphate
  • vitamin D vitamin D and other vitamins
  • serum albumin transferrin and other proteins
  • Lipids Lipids, lipid acid sources, linoleic acid, cholesterol, pyruvic acid, nucleosides for DNA and RNA synthesis, glucocorticoids, retinoic acid, glycero
  • FIG. 9 is a flowchart showing a typical procedure for producing a support using the production apparatus of the present invention.
  • the manufacturing apparatus 2 illustrated in FIGS. 1 and 2 (therefore, the alignment mechanism illustrated in FIG. 5 is used).
  • the user sets the base 10 in the holder 4 according to the shape of the support to be manufactured.
  • a plurality of slots 12 are formed in the insertion guide 6.
  • the supply port 12 a of the slot 12 communicates with an opening (end opening) 15 in the bottom row of the base 10.
  • alignment is performed by bringing the insertion guide 6 into contact with the holder 4 in a pressed state.
  • the needle-like body 20 is placed in each slot 12. After the needle-like body 20 is placed in each slot 12, the needle-like body 20 placed in the slot 12 is moved into the opening 15, and the needle-like body 20 is introduced into each opening 15.
  • the spacers 30 are stacked under the insertion guide 6, and the slots 12 are placed in the openings 15 in the next row. Align the supply port 12a. After the alignment of the insertion guide 6, the needle-like body 20 is newly placed in each slot 12, and the needle-like body 20 is introduced into the opening 15 from each slot 12. By repeating this operation, a support body in which needle-like bodies 20 are implanted in a matrix on the base 10 is completed.
  • FIG. 10 is a perspective view showing an overview of a support manufactured by a manufacturing apparatus.
  • the support body 98 is taken out from the holder 4.
  • the opening 15 of the next base 10 is exposed, and the next support body manufacturing operation can be started immediately.
  • the step of setting the base, the step of positioning the insertion guide, and the step of setting the needle-like body shown in FIG. 9 do not necessarily have to be performed in the order shown above.
  • the alignment can be performed after the needle-shaped body is set, or the insertion guide can be aligned and the needle-shaped body can be set simultaneously. Further, in FIG.
  • a total of 676 needle-like bodies 20 of 26 ⁇ 26 are implanted on the base 10, but this is an example, and the number of needle-like bodies 20 may be larger or at least better.
  • the number of needle-like bodies implanted in the base and the length thereof can be appropriately selected so as to match the shape of the target three-dimensional structure.
  • FIG. 11 is an explanatory view showing a state in which a three-dimensional structure of a cell is formed using a support 98 produced using the production apparatus of the present invention.
  • the sheet 90 is placed on the support 98.
  • the sheet 90 can be peeled from the base 10, and may be formed in a net shape so that the needle-like body 20 can be easily penetrated, or may have a hole corresponding to the needle-like body 20.
  • the sheet 90 By disposing the sheet 90 between the base 10 and the spheroid 92, the three-dimensional structure of cells formed based on the spheroid 92 can be easily separated from the base 10.
  • the sheet material for example, a material processed with fluorine or polyhydroxyethyl methacrylate polymer is preferable.
  • the sheet material is Teflon (registered trademark), poly-HEMA, acrylic plate, vinyl chloride plate, ABS resin plate, polyester resin plate, polycarbonate plate resin, PP (polypropylene), ABS (acrylonitrile butadiene styrene), Engineering plastics such as PE (polyethylene), POM (polyacetal), PC (polycarbonate), PEEK (polyether ether ketone), MCN (monomer casting nylon), 6N (6 nylon), 66N (66 nylon) may be used.
  • PE polyethylene
  • POM polyacetal
  • PC polycarbonate
  • PEEK polyether ether ketone
  • MCN monomer casting nylon
  • 6N 6 nylon
  • 66N 66 nylon
  • the spheroids 92 are inserted into the individual needle-like bodies 20 using a pipette 95 or the like and stacked.
  • the operation of penetrating the spheroid onto the needle-like body can be performed not only with the pipette 95 but also using, for example, a robot arm, tweezers, etc., and the user appropriately selects and penetrates the spheroid onto the needle-like body.
  • the operation can be performed.
  • the spheroids can be fused in the axial direction (longitudinal direction) of the needle-like body.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram illustrating a state in which a three-dimensional structure is constructed by stacking spheroids on a support, and after the adjacent spheroids are bonded, the three-dimensional structure is separated from the support together with the sheet. As shown in FIG. 12, after the adjacent spheroids 92 adhere to each other, the sheet 90 together with the three-dimensional structure of the cells is pulled away from the support 98. Thereby, the three-dimensional structure of the cell formed based on the spheroid can be obtained.
  • the base holding portion that holds the base, the insertion guide that includes the slot for placing the needle-like body, and the slot of the insertion guide communicate with the opening on the base.
  • the position adjustment unit for adjusting the position of the insertion guide with respect to the substrate can be provided so that a needle-like body can be implanted in the opening on the base for each row, and a cell three-dimensional structure can be easily formed. A support can be produced.

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Abstract

　本発明の細胞固定用支持体作製装置は、土台上に針状体が配列された支持体を簡便に作製することができる。作製装置２は土台１０、ホルダ４、挿入ガイド６および位置合わせ機構を備える。土台１０はホルダ４に保持される。土台１０には複数の開口１５が形成され、この開口１５に針状体２０が挿入されて固定される。ホルダ４の隣には挿入ガイド６が設けられ、挿入ガイド６は複数の針状体２０をほぼ平行に並べて載置するためのスロット１２を備える。挿入ガイド６には針状体２０が載置されるスロット１２が開口１５の配置に対応するように複数形成され、位置合わせ機構は、開口１５に供給口１２ａが隣接するように挿入ガイド６を移動させる。開口１５に供給口１２ａが隣接するように配置された後、針状体２０が開口１５内に導入され、土台１０に針状体２０が植設されて支持体が形成される。

Description

細胞の立体構造体作製用の支持体を作製するための装置
　本発明は、細胞の立体構造体を製造する際に足場として用いられる支持体を作製するための装置に関するものである。
　近年、再生医療の研究が発展しつつある。例えば損壊した細胞の代わりに、人工的に培養された細胞を患部に用いて患部を再生治療する。この目的のための細胞の培養方法としては、例えばシャーレやペトリ皿上で細胞を培養する２次元培養が従来からよく知られており、２次元培養で形成された細胞は特定の処理を行ってシャーレやペトリ皿から剥離され患部に用いられる。例えば特許文献１では、関節における軟骨の損傷を治療するために用いられる軟骨様組織の改良された生成方法が記載されている。
　また、さらに治療効果を高めるため、再生医療用の細胞を立体的に構築する技術が研究され、着々と開発が進められている。例えば、細胞を立体的な構造体に構築する１つの手段として、培養時の足場となる支持体を用いた構築方法が既に考案されており、特許文献２および３では足場である支持体について記載されている。
　ところで、細胞の立体構造体を作製する際に使用される支持体としては、例えば特許文献４に示されているように、複数の針状体が土台（基板）に植設された支持体が考案されているが、土台に植設する針状体の本数が増えれば増えるほど、支持体の作製に手間と時間を要していた。
特表２００７－５０２１２７号公報 特開２００４－２１６１１９号公報 特表２００６－５１３０１３号公報 国際公開第２００８／１２３６１４号
　本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、土台上に針状体が配列された支持体を簡便に作製することを目的とするものである。
　本発明は、以下の通りである。
（１）　針状体を植設するための開口が配列された土台と、
　前記土台を保持するホルダと、
　前記開口に対応して針状体を載置する複数のスロットを備え、前記スロットの一端に、前記針状体を前記土台へ供給するための供給口を形成した挿入ガイドと、
を有することを特徴とする細胞固定用支持体作製装置。
（２）　前記供給口を、前記ホルダに保持された土台上の開口に合わせるように、前記挿入ガイドを移動させる位置合わせ機構をさらに有する、（１）に記載の装置。
（３）　前記土台の開口はマトリクス状に配列されたものである、（１）に記載の装置。
（４）　前記位置合わせ機構が、前記挿入ガイドの位置を調節して前記スロットの供給口を前記土台の開口に合わせることを特徴とする（１）に記載の装置。
（５）　（１）～（４）のいずれか１項に記載の装置の挿入ガイドに針状体をセットする工程と
　前記針状体を前記作製装置の土台上に植設する工程と、を有することを特徴とする細胞固定用支持体の作製方法。
　本発明の作製装置によれば、土台上に形成し配列された開口に針状体を導入して土台上に複数の針状体が植設された支持体を簡便に作製することができる。
本発明の作製装置の概観を示した外観斜視図である。 複数の土台が重ねられてセットされた本発明の作製装置の概観斜視図である。 本発明の作製装置の態様を示す外観斜視図である。 複数の土台が重ねられてセットされた本発明の作製装置の概観斜視図である。 マトリクス状に配置された開口の下側の行から上側の行へ、順次針状体を先端から開口に挿入して支持体を作製する説明図である。 マトリクス状に配置された開口の上側の行から下側の行に順次針状体を後端から開口に挿入して支持体を作製する説明図である。 クリック機構を備えた挿入ガイドとその周辺構造を説明する部分断面図である。 複数の針状体を一括的に開口に挿入可能な押し込み部材を説明する斜視図である。 支持体を作製する手順を示したフローチャートである。 作製装置によって製造された支持体の斜視図である。 作製された支持体上にスフェロイドを積層して立体構造体を形成する様子を説明した説明図である。 立体構造体をシートごと支持体から引き上げて立体構造体を取得する様子を説明した説明図である。
　［概要］
　従来、細胞を立体的に配置して細胞の立体構造体を作製する場合、足場となる支持体を用いるが、この支持体を作製するには手間と時間を要していた。
　特に、針状体が設置された土台（基板）を支持体として使用し、この針状体にスフェロイドなどの細胞塊を刺し通して細胞の立体構造体を作製する場合では、より大きな立体構造体を取得するために土台に複数の針状体を植設して足場となる支持体を形成することが考えられる。しかしながら、より大きな立体構造体を提供するにはその分だけ針状体を多く土台に植設しなければならず、このために支持体の形成に手間を要する。このような問題に対し、本発明は、多数の針状体を土台に容易に植設して簡便に支持体を作製するための装置（細胞固定用支持体作製装置）を提供するものであり、本発明者は、針状体を取り付けるための複数の開口が形成された土台を保持し、土台に形成された複数の開口に対応して針状体を載置できる針状体の挿入ガイドを移動可能に設け、土台の開口に針状体を導入できるように挿入ガイドを移動させる機構（位置合わせ機構）を備える、支持体の作製装置を発明した。
　本発明の作製装置の具体的な実施形態について以下に説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための単なる例示であって、本発明をこの実施形態にのみ限定することは意図されない。本発明は、その趣旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することが可能である。
　本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2011-252495号明細書（出願日：2011年11月18日）の内容を包含する。本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、技術文献および公開公報、特許公報、その他の特許文献は、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。
　［態様（Ｉ）］
　図１は本発明の作製装置の概要について説明する説明図である。また、図２は複数の土台がセットされた図１の作製装置の概観について示した斜視図である。
　図１、２に示すように、作製装置２は土台１０、ホルダ４および挿入ガイド６を備え、さらに必要により位置合わせ機構を備える。支持体本体の基礎となる土台１０は、例えば板状に形成され、ホルダ４は、この土台１０を保持するために土台１０の形状に合わせて側壁４ａとストッパ４ｂとを備える。土台１０には、マトリクス状に配置された複数の開口１５が形成され、この開口１５に針状体２０が挿入されて固定される。ホルダ４の隣には挿入ガイド６が設けられ、挿入ガイド６は複数の針状体２０をほぼ平行に並べて載置するためのスロット１２を備える。各スロット１２は、針状体２０の先端２０ａが後端２０ｂよりもホルダ４側に近く位置するように針状体２０を載置する。針状体２０は串のように機能すればよく、その形状は先端が鋭く後端が太い針状に限定されるものではない。従って、針状体２０の形状は、例えば先端から後端まで一様に細く形成してもよいし、山と谷とが交互に繰り返されるネジのような形状としてもよい。針状体２０の材質は特に制限しないが、ポリプロピレンやナイロンなどといった樹脂や、ステンレスなどの合金で形成することができる。図１および２ではホルダ４が３つの土台１０を保持する態様について示したが、ホルダ４が保持する土台１０の数は３つに制限する必要はなく、３つ未満でも４つ以上でもよい。
　挿入ガイド６の各スロット１２のホルダ４側の端部には供給口１２ａが形成され、この供給口１２ａを介してスロット１２に載置された針状体２０を挿入ガイド６の外部に、例えば針状体２０を土台１０へと供給することができる。作製装置２に備えられた位置合わせ機構は、挿入ガイド６をホルダ４に保持された土台１０に接触させ、かつホルダの方向に対して圧力を加えることができる。挿入ガイド６には、例えば土台に形成されたマトリクス状の開口１５に対応するように複数のスロット１２が形成されている。スロットは、針状体を移動可能に載置できるかぎり、任意の形状とすることができる。　
　土台１０に例えば２６行２６列（２６×２６）の開口１５がマトリクス状に形成されている実施形態において、各行には２６個の開口１５が形成されており、挿入ガイド６には１行の全ての開口１５に合わせて２６個のスロット１２が形成されている。但し、本発明においては、挿入ガイド６に設けられたスロット１２の数は、開口１５の数の一部でもよい。各スロット１２には針状体２０を移動可能に載置することができ、各スロット１２のホルダ４側の端部には針状体２０を挿入ガイド６の外部に供給するための供給口１２ａが形成されている。
　位置合わせ機構がこの供給口１２ａを土台１０の開口１５に隣接させて配置することで、スロット１２上に載置された針状体２０をスロット１２内から開口１５内へと導入することができる。針状体を開口へ導入する方法としては、例えば、以下で説明する押し込み部材を用いて、針状体の後端２０ｂから土台方向に力を加えて針状体を押し出す方法および電荷を利用する電気的方法が挙げられるが、これらに限定されず、針状体を開口へ導入できるかぎりいずれの方法をとってもよい。供給口１２ａと土台１０上の開口１５とは隙間を形成しないように配置することが好ましいが、針状体２０の導入が妨げられない程度に供給口１２ａと開口１５とが空間的に隔てられていてもよい。
　針状体を土台に導入すると、針状体は、土台の手前側の開口１５から土台に形成された穴に沿って開口全体を貫通し、土台の奥側の開口から突出して、土台上に植設される。この場合、複数の土台が重ねられていると、１番目の土台を貫通した針状体は、次に整列した２番目の土台に突き当たる。しかし、この２番目の土台も、１番目の土台と同じパターンで開口が形成されているので、針状体は、２番目の土台の開口１５に導入することができる。従って、複数の土台を重ねて用いる場合でも、針状体は、２番目の土台に突き刺さって折れ曲がることはない。
　異なる開口パターンの土台を整列させると、前記のとおり、１番目の土台を貫通した針状体が、２番目の土台に突き刺さる問題が生じる場合がある。従って、異なる開口パターンの土台を用いるときは、針状体の長さの分だけ間隔をあけて次の土台を整列させるか、複数の土台を整列させずに、１つの作業ごとに１つの土台をホルダに設置して当該土台に針状体を挿入すればよい。
　各土台１０には例えば２６×２６の開口１５（開口１５は、２６×２６に限定されるものではない）が形成されているが、隣り合う開口１５との間隔（ピッチ）は、細胞の立体構造体の製造時に針状体２０に刺し通される細胞塊（スフェロイド）のサイズに合わせて適宜定めるとよい。この開口の間隔（ピッチ）により、本発明の製造装置により製造される支持体の針状体の間隔が規定される。針状体同士の間隔は、そこを貫通させる細胞塊（スフェロイド）の大きさによって変動し得るが、好ましくは、細胞塊の直径のほぼ１００％～１１０％の長さで規定される。１つの実施形態において、細胞塊の直径が１ｍｍである場合は、針状体同士の間隔は、約１ｍｍ～１．１ｍｍであることが好ましい。針状体に細胞塊を貫通させたときに隣り合う細胞塊と接触可能であるような間隔で針状体が位置決めされるように、開口の間隔を設定する。
　針状体を土台に植設して作製された支持体は、挿入ガイドの長手方向に引き抜くか、あるいは挿入ガイドの上から取り出すことができる。特に、土台を複数配列させて針状体が２番目の土台の開口に挿入されている場合は、挿入ガイドの長手方向であって２番目の土台とは反対側の方向に引き抜くようにすればよい。
　［態様（ＩＩ）］
　上記の作製装置２では針状体２０の先端２０ａから針状体を開口１５に導入したが、針状体２０の後端２０ｂから土台１０の開口１５に導入する装置としてもよい。この場合、針状体２０が土台２０に載置されると、針状体２０は挿入ガイド６側に突出することになる（図６参照）ため、挿入ガイド６は上側から下側に移動させて針状体２０を開口に導入する必要がある。図３は、針状体２０の後端２０ｂから土台１０の開口１５に針状体２０を導入する作製装置について説明する説明図である。また、図４は、図３に示した作製装置に複数の土台を保持させたときの概観斜視図である。
　図３および４に示すように、作製装置１０２は、土台１０、ホルダ１０４、挿入ガイド１０６、位置合わせ機構、付勢板１０８等を備える。ホルダ１０４は、土台１０の側面１０ｃと接触する側壁１０４ａと、土台１０の周辺部１０ｂに押された状態で接触するストッパ１０４ｂとを有する。付勢板１０８はホルダ１０４内の土台１０を挿入ガイド１０６側に押圧し、土台１０の周辺部１０ｂがストッパ１０４ｂに押された状態で接触して土台１０が挿入ガイド１０６側に寄せられて保持される。
　作製装置１０２は付勢板１０８を備え、付勢板１０８はホルダ１０４内の土台１０を挿入ガイド１０６側に付勢する。付勢板１０８が土台１０を挿入ガイド１０６側に押し付けることにより、土台１０の周辺部１０ｂがホルダ１０４に押された状態で接触して動かないようにしっかりと固定される。これにより、例えば、針状体２０の植設が完了した土台１０をホルダ１０４内から抜き取ると、この抜き取られる土台１０に隣り合った土台１０が付勢板１０８により挿入ガイド１０６側に押されて移動する。移動開始後、土台１０の周辺部１０ｂがホルダ１０４のストッパ１０４ｂに押された状態で接触して停止し、土台１０上の開口１５が挿入ガイド１０６の供給口１１２ａと連通できるように露呈する。開口１５が露呈した後、再び挿入ガイド１０６のスロット１１２に針状体２０を載置して針状体２０をスロッ１１２から開口１５内に導入することにより、土台１０の開口１５に針状体２０を植設することができる。ホルダ１０４内に保持できる土台１０は図３および４では３つを例示したが、これに限らず４つ以上でも３つ未満でもよい。
　［位置合わせ機構］
　図１と２に示された作製装置２、および図３と４に示された作製装置１０２は、スロット１２、１１２の供給口１２ａ、１１２ａを土台１０の開口１５に合わせるための位置合わせ機構をそれぞれ備えている。位置合わせ機構を構成する部材としては、スペーサまたはクリック機構などが挙げられるが、これらに限定されない。
　図１、２に例示した作製装置２は位置合わせ機構を備え、位置合わせ機構は、挿入ガイド６の位置（例えば、高さ）を調節することができる。挿入ガイド６の高さを調節することにより、供給口１２ａをどの開口１５に連通させるかを決定することができる。挿入ガイド６の供給口１２ａと土台１０上の開口１５とは隙間を形成しないようにすることが好ましいが、針状体２０の導入が妨げられない程度に供給口１２ａと開口１５とを空間的に隔ててもよい。挿入ガイド６と土台１０とをこのように配置しても針状体２０をスロット１２から開口に導入することができる。
　挿入ガイド６の高さを調節する手段としては様々な構造が考えられ、ここでは挿入ガイド６の下側にスペーサを積み重ねて高さを調節する実施形態について例示するが、挿入ガイド６の高さを調節する方法は以下の例に限定されるものではない。
　図５は挿入ガイド６の下側にスペーサを重ねて挿入ガイド６を上昇させる位置合わせ機構を説明する説明図である。
　図５（ａ）に示すように、挿入ガイド６の下側にスペーサ３０を重ねて配置することにより、挿入ガイド６を上昇させることができ、これにより挿入ガイド６の位置を調節することができる（図５（ｂ））。スペーサ３０は、例えば、マトリクス中に配置された開口の垂直方向Ｈの行間ピッチと同じ厚さにすることで、スペーサ３０を重ねることにより挿入ガイド６は上側に隣り合った行の開口１５にスロット１２の供給口１２ａを連通させてスロット１２に載置された針状体２０を開口１５内に導入することができる。下側の行の開口１５に先端２０ａから針状体２０を挿入し終わった後に、挿入ガイド６の下にスペーサ３０を重ねることで、一行上側の行の開口１５にスロット１２の供給口１２ａを連ねることができ、開口１５内への針状体２０の導入が可能となる。
　マトリクス状に配置された開口１５の最下行の開口（端部開口）１５から針状体２０の導入を開始して、上記の作業を繰り返すことにより、マトリクス状に設けられた全ての開口１５に針状体２０を植設することができる。また、目的とする支持体とその支持体によって作製される細胞の立体構造体の形状によっては、全ての開口１５に針状体を植設しない場合もある。マトリクス状に配置された開口のなかから針状体を設置する開口を選択することにより、所望の形状の支持体を得ることが可能となり、その支持体を用いて所望の形状を有する細胞の立体構造体を得ることができる。
　図５に示したように、先端２０ａから開口１５に針状体２０を導入し、後端２０ｂが開口１５内に収まるまで針状体２０を開口１５内に押し込んで針状２０を土台１０に植設する実施形態では、挿入ガイド６を垂直方向Ｈに沿って下側から上側に移動させて開口１５に針状体２０を導入することもできるが、図５の機構は挿入ガイド６を上側から下側に移動させて全ての開口１５に針状体２０を導入することもできる。挿入ガイド６を上側から下側に移動させる場合は、予め積み重ねられたスペーサ３０の上に挿入ガイド６を載せておき、開口１５内への針状体２０の導入に合わせてスペーサ３０を１つずつ取り除くことで、挿入ガイド６を上側から下側に移動させながら針状体２０を開口１５内に導入して土台１０に針状体２０を植設することができる。
　図５に示したスペーサ３０を用いて挿入ガイド６の高さを調節する実施形態では、スペーサ３０の表側に凹み／突起を設け、スペーサ３０の裏側に、別のスペーサ３０の表側の凹み／突起と嵌合する突起／凹みを設けて、スペーサ３０が揺動することを防止して安定性を高めてもよい。例えば、スペーサ３０の表側に凹み３０ａを設け、この凹み３０ａを挿入ガイド６の底に形成された突起（図示省略）と嵌合させることにより、挿入ガイド６が動かないように安定させて作製装置２上に位置させることができる。挿入ガイド６が揺動しないように作製装置２上に保持されることにより、スロット１２の一端に形成された供給口１２ａと土台１０の開口１５との連通を安定的に維持することができ、スロット１２内に載置された針状体２０を開口１５内により確実に導くことができる。
　図５（ａ）および（ｂ）に示した位置合わせ機構は、垂直方向Ｈに沿って下側から上側に挿入ガイド６を移動させて針状体２０を土台１０に植設することもできるし、上側から下側に挿入ガイド６を移動させて針状体２０を土台１０に植設させることもできる。以下で説明する図６に示されたもう一つの位置合わせ機構では、上側から下側に挿入ガイド６を移動させて針状体２０を土台１０に植設させる。
　図６は、図３および４に例示した挿入ガイド１０６の下側にスペーサ３０を予め重ね、上の行から下の行へ順に針状体を導入する位置合わせ機構の一部を示した説明図である。
　図６（ａ）に示すように、例えば、最上行の開口（端部開口）１５への針状体２０の導入が完了した後、スペーサ３０を１つ取り除いて挿入ガイド１０６の高さを一行分だけ下げて上から２行目の各開口１５に針状体２０を導入することができる。上から２行目の開口１５に針状体２０を導入した後、図６（ｂ）に示すように更にスペーサ３０を１つ取り除いて挿入ガイド１０６の高さを更に一行分だけ下げて上から３行目の各開口１５に針状体２０を導入することができる。このように、予めスペーサ３０を重ねておき上側から下側に移動ガイド１０６を移動させて土台１０に針状体２０を植設してもよい。
　このように針状体２０の後端２０ｂから開口１５に針状体２０を導入して土台１０に針状体２０を植設する実施形態では、土台１０から挿入ガイド１０６側に針状体２０が突出するため、上側から下側に挿入ガイド１０６を移動させて針状体２０を開口１５に導入する。
　また、上記の図５および図６ではスペーサを用いて挿入ガイド６、１０６を上昇／下降させたが、針状体２０が載置される挿入ガイドを上昇／下降させる態様はこれに限らない。例えば、挿入ガイドの両サイドをクリック機構で上昇／下降自在に支えてもよい。挿入ガイドをクリック機構で支えて上昇／下降させることにより、挿入ガイドの移動をより簡便に行うことができる。図７は、垂直方向Ｈで移動自在に挿入ガイドをクリック機構によって保持する位置合わせ機構を、垂直方向Ｈと略平行な平面で切断した部分断面図である。
　図７に示すように、クリック機構は一般的に用いられているものでよく、例えば、クリック機構５０は挿入ガイド５２、この挿入ガイド５２を垂直方向Ｈで移動可能に支えるガイド支持体５４を備える。挿入ガイド５２は針状体２０が載置されるスロット６０、係合爪５６、係合爪５６を外側に向けて付勢するバネ５８を備え、ガイド支持体５４は係合爪５６と係合するノッチ７０、７１および７２を有する。
　１つの実施形態において、各ノッチ７０～７２は垂直方向Ｈに沿って形成され、ノッチ７０、７１、７２の間隔は土台１０の開口１５（図１参照）の行間ピッチに合わせられている。これにより、例えば、係合爪５６がノッチ７０に係合した状態からノッチ７１に係合するように挿入ガイド５２が上へ移動した場合は、１つ上の行の開口１５に針状体２０を導入することができるように挿入ガイドを位置合わせする。また、係合爪５６がノッチ７０に係合した状態からノッチ７２に係合するように挿入ガイド５２が下へ移動した場合は、１つ下の行の開口１５に針状体２０を導入することができるように挿入ガイドを位置合わせする。ガイド支持体５４のそれぞれのノッチ７０～７２を土台１０の開口１５の行間ピッチに合わせて形成されているため、クリック機構は、スロット６０の供給口が土台１０の次の開口１５に通じるような状態で挿入ガイド５２を静止させることができる。このように、挿入ガイド５２が係合爪５６を備え、挿入ガイド５２を垂直方向Ｈに移動可能に支えるガイド支持体５４にノッチ７０～７２を設けたクリック機構を用いることにより、上述したスペーサ３０を用いることなく挿入ガイド５２の高さを簡便に調節することができる。以上のようにクリック機構を挿入ガイドの移動調節手段として用いることもできる。
　また、上記のスペーサまたはクリック機構の他にも、ロボットによって、または高さ制御機構を設けることによって、挿入ガイドを位置合わせすることもできる。
　なお、上記の説明は、針状体を垂直方向Ｈに植設する実施形態についてのものであるが、本発明は、針状体を水平方向に植設するような構成の製造装置および針状体を斜め方向に植設するような構成の製造装置も包含することを理解されたい。
　［針状体の導入効率の改善］
　図１または図３に例示した作製装置２、１０２において、針状体２０を挿入ガイド６、１０６のスロット１２、１１２から土台１０上の開口１５へ導入するとき、手作業で１本ずつスロット１２、１１２から開口１５内に導入してもよいが、図８に示すように、複数本の針状体２０を一括してスロットから開口に導入してもよい。
　図８は、図１または２で例示したスロット１２に載置された針状体２０を一括的に土台１０の開口１５に押し込む押し込み部材を用いて針状体２０を開口１５内に導入する態様について説明する説明図である。図８に示すように、押し込み部材８０には、スロット１２の凹みと合致する複数の押さえ８２が形成され、この押さえ８２に針状体２０の端部が押された状態で接触する。この状態で、押し込み部材８０を供給口１２ａ側へ動かすと、スロット１２上に載置された針状体２０が土台１０へ向けて押し出され供給口１２ａを介して土台１０の開口内に針状体２０が導入される。押し込み部材８０に全てのスロット１２に係合する押さえ８２を形成することにより、全スロット１２内の針状体２０をスロット１２から土台１０に一括して導入することができ、針状体２０の開口１５内への導入にかかる手間を小さくし利便性を高めることができる。
　［立体構造体］
　本発明の作製装置２、１０２を用いて土台１０に植設された針状体２０に細胞の凝集塊（スフェロイド）を貫通させて積み上げることで細胞の立体構造体を形成することができる。このとき使用される細胞としては、例えば、幹細胞（ＥＳ細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉細胞等）、体細胞、腫瘍細胞、などの未分化細胞またはその分化細胞が挙げられる。また、未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導が可能な線維芽細胞、幹細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞または脂肪細胞を使用することもできるし、関節軟骨細胞または骨細胞などの細胞を使用することもできる。また、スフェロイドは、必ずしも単一の種類の細胞の凝集体として形成される必要はなく、スフェロイドが形成されるかぎり、複数種類の細胞から形成されていてもよい。
　細胞は、浮遊系細胞と足場依存性細胞とに大きく分類され、前者には血液系や免疫系の細胞が属し、後者には皮膚や骨などの細胞が属する。皮膚や骨などの細胞は、培養液中で浮いている状態では死んでしまい、ガラスなどシャーレに付着することで増殖させる必要がある。このため、例えば、ポリテトラフルオロエチレンにより表面が処理された培養容器において細胞を一カ所に集めるようにすると、細胞は足場を求めて、お互いに接着し合い、細胞凝集塊すなわちスフェロイドが形成される。さらに、スフェロイド同士が接着・融合すると大きな形状のものができる。スフェロイドを介することにより、細胞周期において細胞は静止期に移行し、タンパク質の産生が増加すると考えられる。従って、本発明では、細胞を静止期に誘導するため、一旦スフェロイドにしてから細胞の立体構造体を形成することが好ましい。
　細胞の培養に用いられる培養液は、培養対象の細胞にもよるが、慣用の合成培地または天然培地を用いることができる。動物由来物質からの細菌／ウイルスなどの感染、供給時期や品質の安定性を考慮すると合成培地が好ましい。合成培地としては、例えば、α―ＭＥＭ（Mnimum Essential Medium）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地)ＲＰＭＩ １６４０培地、ＣＭＲＣ培地、ＨＡＭ培地、ＤＭＥ／Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ培地、などを用いることができる。これらの培地には、増殖因子や成長因子、ホルモンなどの生理活性物質、薬理作用を有するその他の種々の物質を適宜添加してもよい。このような物質を添加することにより、培養細胞に特定の機能を付与したり、細胞本来の機能を変化させることができる。一例として、成長因子又は細胞増殖因子としては、骨形成蛋白質(BMP:Bone Morphogenetic Protein）、繊維芽細胞増殖因子(FGF:Fibroblast Growth Factor）、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子(IGF:Insulin－like Growth Factor）、血小板由来増殖因子(PDGF:Platelet Derived Growth Factor）、血管内皮細胞増殖因子(VEGF:Vascular Endothelial Growth Factor）、トランスフェリンなどの既知血清成分（濃度は適宜調整）、各種ビタミンやストレプトマイシンなどの抗生物質などがある。ホルモンとしては、例えば、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、３，３'，５－トリヨードチロニン、１－メチル－３－ブチルキサンチン、プロゲステロン、などが挙げられる。
　その他の生理活性物質として典型的には、例えば、アスコルビン酸（特に、Ｌ－アスコルビン酸）、ビオチン、パントテン酸カルシウム、アスコルビン酸二リン酸、ビタミンＤ等のビタミン類、血清アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質、脂質、脂質酸源、リノール酸、コレステロール、ピルビン酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成用ヌクレオシド、グルココルチコイド、レチノイン酸、グリセロホスフェート、モノチオグリセロールなどが挙げられる。
　図９は本発明の作製装置を用いて支持体を作製する場合の代表的な手順について示したフローチャートである。ここでは図１および２に例示した作製装置２に沿って説明を行う（従って、図５に例示された位置合わせ機構が使用される）。
　図９に示すように、ユーザは、作製する支持体の形状に合わせた土台１０をホルダ４にセットする。挿入ガイド６には複数のスロット１２が形成されており、ホルダ４に土台１０をセットした後、例えば、土台１０の最下行の開口（端部開口）１５にスロット１２の供給口１２ａが連通するように挿入ガイド６をホルダ４に押された状態で接触させることで位置合わせを実行する。土台１０の開口１５に挿入ガイド６のスロット１２が連通するように挿入ガイド６の位置が合わされた後、各スロット１２に針状体２０を載置する。針状体２０を各スロット１２に載置した後、スロット１２に載置された針状体２０を開口１５内に移動させ、各開口１５内に針状体２０を導入する。
　スロット１２に載置された全ての針状体２０の後端２０ｂが開口１５内に導入された後、スペーサ３０を挿入ガイド６の下に積み重ねて、１つ上の行の開口１５にスロット１２の供給口１２ａを合わせる。挿入ガイド６の位置合わせを行った後、各スロット１２内に新しく針状体２０を載置して、各スロット１２から開口１５内へ針状体２０を導入する。この作業を繰り返すことによって、土台１０に針状体２０がマトリクス状に植設された支持体が完成する。
　図１０は作製装置によって作製された支持体の概観を示した斜視図である。
　図１０に示すように、土台１０上の全ての開口１５に針状体２０を植設して支持体９８を作製した後、この支持体９８をホルダ４から取り出す。ホルダ４に複数の土台１０を保持させている場合は、次の土台１０の開口１５が露呈して次の支持体の作製作業をすぐに開始することができる。なお、図９に示された、土台をセットする工程、挿入ガイドの位置合わせ工程、針状体をセットする工程は、必ずしも上記に示した順序通りに実施する必要はなく、例えば、挿入ガイドの位置合わせを針状体のセットの後に行うこともできるし、挿入ガイドの位置合わせと針状体のセットを同時に行うこともできる。また、図１０では、２６×２６の合計６７６本の針状体２０を土台１０上に植設したが、これは一例であり針状体２０の数はこれより多くてもよいし少なくともよい。土台に植設される針状体の数およびその長さは、目的とする細胞の立体構造体の形状に適合するように、適宜選択することができる。
　［立体構造体の構築］
　支持体９８を用いて細胞の立体構造体を構築する場合は、例えば支持体９８上に剥離可能なシートを被せ、このシート上に針状体２０を貫通させて、その針状体にスフェロイドを貫通させる。図１１は本発明の作製装置を用いて作製された支持体９８を用いて細胞の立体構造体を形成する様子について示した説明図である。
　図１１に示すように、支持体９８上にシート９０を被せる。シート９０は土台１０から剥離可能であり、例えば針状体２０が容易に貫通できるように、網状に形成される、あるいは針状体２０に合わせて孔を有していてもよい。このシート９０を土台１０とスフェロイド９２との間に配置することにより、スフェロイド９２を基に形成された細胞の立体構造体を土台１０から容易に引き離すことができる。シート材料としては、例えば、フッ素加工やポリヒドロキシエチルメタクリレートポリマー加工されたものが好ましい。また、シート材料は、テフロン（登録商標）、poly-HEMA、アクリル板、塩化ビニル板、ＡＢＳ樹脂板、ポリエステル系樹脂板、ポリカーボネート板等の樹脂、ＰＰ（ポリプロピレン）、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＯＭ（ポリアセタール）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、ＭＣＮ（モノマーキャスティングナイロン）、６Ｎ（６ナイロン）、６６Ｎ（６６ナイロン）等のエンジニアリングプラスチックでもよい。
　土台１０の上にシート９０を被せた後、ピペット９５などを用いて個々の針状体２０にスフェロイド９２を挿通させて積み上げてゆく。スフェロイドを針状体上に貫通する操作は、ピペット９５だけでなく、他にも例えばロボットアームやピンセットなども用いて行うことができ、ユーザは適宜選択してスフェロイドを針状体上に貫通する操作を行うことができる。スフェロイド同士の接触によって、スフェロイドは、針状体の軸方向（縦方向）に融合し得る。
　また、針状体は、スフェロイドを貫通させたときに隣り合うスフェロイドと接触可能であるような間隔で位置決めされているので、針状体の軸に対して水平な方向（横方向）にも融合し得る。このようなスフェロイドの融合により、土台１０上の針状体２０に刺し通されたスフェロイド９２から細胞の立体的な構造体が形成される。図１２は支持体上にスフェロイドを積み上げて立体構造体を構築し、隣り合うスフェロイドが接着した後にシートごとこの立体構造体を支持体から引き離して取得する様子を説明した説明図である。図１２に示すように、隣り合ったスフェロイド９２同士が接着した後、細胞の立体構造体ごとシート９０を支持体９８から引き離す。これによりスフェロイドを基にして形成された細胞の立体構造体を取得することができる。
　以上のように本発明の作製装置によれば、土台を保持する土台保持部と、針状体を載置するスロットを備えた挿入ガイドと、挿入ガイドのスロットが土台上の開口と連通するように基板に対する挿入ガイドの位置を調節する位置調節部とを備えたことにより、各行ごとに針状体を土台上の開口に植設することができ、簡便に細胞立体構造体を形成するための支持体を作製することができる。
　２　　　作製装置
　４　　　ホルダ
　４ａ　　側壁
　４ｂ　　ストッパ
　６　　　挿入ガイド
　１０　　土台
　１２　　スロット
　１２ａ　供給口
　１５　　開口
　２０　　針状体
　２０ａ　先端
　２０ｂ　後端
　３０　　スペーサ
　５０　　クリック機構
　５２　　挿入ガイド
　５４　　ガイド支持体
　５６　　係合爪
　５８　　バネ
　６０　　スロット
　７０、７１、７２　ノッチ
　８０　　押し込み部材
　９０　　シート
　９２　　スフェロイド
　９５　　ピペット
　９８　　支持体
　１０２　作製装置
　１０４　ホルダ
　１０６　挿入ガイド
　１０８　付勢板
　１１２　スロット
　Ｈ　　　垂直方向

Claims (5)

  1. 　針状体を植設するための開口が配列された土台と、
    　前記土台を保持するホルダと、
    　前記開口に対応して針状体を載置する複数のスロットを備え、前記スロットの一端に、前記針状体を前記土台へ供給するための供給口を形成した挿入ガイドと、
    を有することを特徴とする細胞固定用支持体作製装置。
  2. 　前記供給口を、前記ホルダに保持された土台上の開口に合わせるように、前記挿入ガイドを移動させる位置合わせ機構をさらに有する、請求項１に記載の装置。
  3. 　前記土台の開口はマトリクス状に配列されたものである、請求項１に記載の装置。
  4. 　前記位置合わせ機構が、前記挿入ガイドの位置を調節して前記スロットの供給口を前記土台の開口に合わせることを特徴とする請求項１に記載の装置。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の装置の挿入ガイドに針状体をセットする工程と
    　前記針状体を前記作製装置の土台上に植設する工程と、を有することを特徴とする細胞固定用支持体の作製方法。
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